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申请/专利权人：河南科技大学

摘要：本发明公开了一种小鲵科动物视网膜显微组织切片的制备方法，属于显微组织切片技术领域。该方法包括以下步骤：1将小鲵科动物的眼球完整无损的取出，并修剪多余组织；2将采集的眼球置于固定液中，固定后冲洗备用；3将经固定处理的眼球组织依次浸入浓度梯度乙醇中脱水，每个梯度脱水45～60min；4将经脱水处理的眼球浸入100％乙醇与二甲苯的混合液中2～3min，取出后再浸入二甲苯中10～30min；5将经透明处理的眼球放入二甲苯与石蜡的混合液中20～30min，取出后再分两次放入石蜡中，每次45～60min；6将经浸蜡处理的眼球包埋，依次经切片、展片、贴片、烤片、染色、封固处理，即得；其流程简单，操作方便，获得的切片完整，图片结构清晰。

主权项：小鲵科动物视网膜显微组织切片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）取材：将小鲵科动物的眼球完整无损的取出，并修剪多余组织；（2）固定、冲洗：将采集的眼球置于固定液中，固定后冲洗备用；（3）脱水：将经固定处理的眼球组织依次浸入浓度梯度50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇中脱水，其中95%、100%乙醇各重复两次，每个梯度脱水45~60min；（4）透明：将经脱水处理的眼球组织浸入100%乙醇与二甲苯的混合液中2~3min，取出后再浸入二甲苯中10~30min；所述100%乙醇与二甲苯的体积比为1:1；（5）浸蜡：将经透明处理的眼球组织放入二甲苯与石蜡的混合液中20~30min，取出后再分两次放入石蜡中，每次45~60min；所述二甲苯与石蜡的体积比为1:1；（6）将经浸蜡处理的眼球组织包埋，依次经切片、展片、贴片、烤片、染色、封固处理，即得；所述切片的厚度为4~6μm，切片后置于42~45℃的水中展片；所述贴片、烤片为：待切片自然伸展平后从水中取出，控干水分，置于37~45℃下干燥2~4h，或者于室温下自然干燥一夜；所述染色为H.E染色，操作步骤为：将切片依次置于二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min、100%乙醇Ⅰ5min、100%乙醇Ⅱ5min、95%乙醇5min、85%乙醇5min、75%乙醇5min、水5min、苏木精染液10~20min，流水冲洗5min，再置于HCl‑乙醇分化液20~40s，流水冲洗10~30min，镜检，流水冲洗2min，再依次置于70%乙醇1min、85%乙醇1min、伊红染液2min、95%乙醇Ⅰ2min、95%乙醇Ⅱ2min、100%乙醇Ⅰ2min、100%乙醇Ⅱ2min、二甲苯Ⅰ5min、二甲苯Ⅱ5min。

全文数据：小鲵科动物视网膜显微组织切片的制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种两栖动物视网膜显微组织切片的制备方法，具体涉及用于显微观察的小鲵科动物视网膜组织切片的制备方法，属于显微组织切片技术领域。背景技术[0002]眼睛作为视觉的重要组成原件，能够客观的将外界的图像信号转化为生理脉冲而被中枢大脑神经所识别，经过中枢神经分析以其指导动物做出各种动作和行为反应。视网膜位于脊索动物眼球靠近大脑一侧的背部，视网膜在整个眼球中尤为重要，因为视网膜承担着将光信号转化为神经信号的整个任务。不同动物由于活动模式、栖息地环境和进化地位的不同，出现了形形色色的适应性行为。[0003]小鲵科动物是亚洲特有的有尾类两栖动物，也是现生有尾目10科中第三大科，全世界现已知66种，隶属2亚科、10属。中国现已知2亚科8属30种，主要分布于东北、西南山区、华中及台湾地区。小鲵科动物生活环境可分为水栖型和陆栖型，活动习性可分为昏型或者夜行性，由于生活环境和活动习性的不同导致光照的不同，从而引起视网膜形态结构的变化。研宄视网膜的形态结构特征，视网膜石蜡切片的制作是必不可少的一步。发明内容[0004]本发明的目的是提供一种小鲵科动物视网膜显微组织切片的制备方法。[0005]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：[0006]小銳科动物显微组织切片的制备方法，包括以下步骤：[0007]1取材:将小鲷科动物的眼球完整无损的取出，并修剪多余组织；[0008]⑵固定、冲洗:将采集的眼球置于固定液中，固定后冲洗备用；[0009]3脱水:将经固定处理的眼球组织依次浸入浓度梯度5〇%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇中脱水，其中95%、100%乙醇各重复两次，每个梯度脱水45〜6〇min;[0010]⑷透明：将经脱水处理的眼球组织浸入100%乙醇与二甲苯的混合液中2〜3min，取出后再浸入二甲苯中10〜3〇min;[0011]5浸蜡:将经透明处理的眼球组织放入二甲苯与石蜡的混合液中2〇〜3〇min，取出后再分两次放入石蜡中，每次45〜6〇min;[0012]⑹将经浸蜡处理的眼球组织包埋，依次经切片、展片、贴片、烤片、染色、封固处理，即得。I[0013]步骤⑵中所述固定液为10%福尔马林溶液，用量为眼球组织体积的10〜20倍。[0014]步骤⑶中所述脱水在室温下进行。[0015]步骤⑷中所述100%乙醇与二甲苯的体积比为1:1。[0016]步骤⑸中所述二甲苯与石錯的体积比为1:1。[0017]步骤⑹中所述切片的厚度为4〜6wn，切片后置于42〜45°C的水中展片。[0018]步骤⑹中所述贴片、烤片为:待切片自然伸展平后从水中取出，控干水分，置于37〜45°C下干燥2〜4h，或者于室温下自然干燥一夜，亦或将切片置于载玻片上，加少量水后持载玻片在酒精灯上加温，使切片伸展。[0019]所述苏木精染液为：将lg苏木精溶于20mL100%乙醇中得甲液，SOg钾明矾溶于300mL蒸馏水中得乙液;将甲液、乙液混合，煮沸2〜3min，再加蒸馏水定容至i〇〇〇mL;最后加入0.2g碘酸钠，即得。[0020]所述伊红染液为:将0.5g伊红加入到100mL85%乙醇中，溶解完全，即得。[0021]所述HC1-乙醇分化液为:将lmL盐酸加入到99mL70%乙醇中，混匀，即得。[0022]步骤⑹中所述染色为H.E染色，操作步骤为:将切片依次置于二甲苯ii〇min、二甲苯II10min、100%乙醇I5min、100%乙醇II5min、95%乙醇5min、85%乙醇5min、75%乙醇5min、水5min、苏木精染液10〜20min，流水冲洗5min，再置于HC1-乙醇分化液20〜40s，流水冲洗10〜30min，镜检，流水冲洗2min，再依次置于70%乙醇lmin、85%乙醇lmin、伊红染液2min、95%乙醇I2min、95%乙醇II2min、100%乙醇I2min、100%乙醇II2min、二甲苯I5min、二甲苯II5min。其中，I、II仅代表处理次数，如二甲苯11〇min、二甲苯n1Omin分别为二甲苯第一次处理l〇min，二甲苯第二次处理10min。[0023]本发明的有益效果：[0024]本发明中小鲵科动物视网膜显微组织切片的制备方法包括取材、固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、修整、切片与展片、贴片与烤片、H.E染色、封固等步骤，流程简单，操作方便，获得的切片完整，图片结构清晰，为研究小鲵科动物视网膜结构提供了技术支持，适用于实验室研究工作者对小鲵科动物视网膜组织形态结构的研宄。附图说明[0025]图1为实施例1中山溪鲍Batrachuperuspinchonii视网膜石蜡切片显微图。具体实施方式[0026]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。[0027]实施例1[0028]染液及分化液的配制：[0029]苏木精染液:将lg苏木精溶于20mL100%乙醇中得甲液，50g钾明矾溶于300mL蒸馏水中得乙液;将甲液、乙液混合，煮沸2〜3min，再加蒸馏水定容至lOOOmL;最后加入0.2g碘酸钠，即得。[0030]伊红染液:将0.5g伊红加入到lOOmL85%乙醇中，溶解完全，即得。如果染不上色，可加入0•2%的冰醋酸稀释，以促进伊红染色。[0031]HC1-乙醇分化液:将lmL盐酸加入到99mL70%乙醇中，混匀，即得。[0032]本实施例中小鲵科动物山溪鲵Batrachuperuspinchonii视网膜显微组织切片的制备方法，包括以下步骤：[0033]1取材:在室温下，用手术刀和手术钳将小鲵科动物的眼球完整无损的取出，并对多余的组织进行修剪；[G034]2固定:将采集的眼球投入10%福尔马林固定液中进行固定，用量为眼球组织体积的15倍，做好标记以便于识别；[0035]⑶冲洗:将固定后的眼球组织用水冲洗过夜；[0036]4脱水：在室温下，将乙醇脱水剂用蒸馈水配成不同的梯度浓度，然后将眼球组织置入，进行逐级脱水，即依次在50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇中脱水，其中95%、100%乙醇各重复两次，各级乙醇脱水的时间50min如需过夜，眼球应停留在70%乙醇中）；[0037]5透明：透明分两步，第一步采用100%乙醇和二甲苯按体积比i:i配制的透明液，透明时间为2.5min，第二步采用纯的二甲苯透明液，透明时间为20min;[OO38]⑹浸蜡:将已透明的眼球放入体积比1:1的二甲苯与石蜡的混合液中25min，然后再分两次放入58°C的纯蜡中，每次浸蜡50min，共lOOmin透蜡完毕；[0039]7包埋:在包埋盒内注入融化的石蜡，将已浸蜡的眼球置入其中，使蜡块迅速冷却硬固，包埋好的眼球在蜡块中可长期保存；[0040]⑻石蜡块的整修:将包埋盒上石蜡块做适当整修；[0041]⑼切片与展片:切片厚度5mi，切好片后置于42°C温水中展片；[0042]1〇贴片与烤片:待石蜡切片自然伸展平之后轻轻地从水中捞取，拨正位置，控干水分，然后放入40°C温箱中千燥3h;[0043]11H_E染色:H.E染色按以下流程进行，欲染切片依次置于二甲苯KiOmin—二甲苯II10min—100%酒精I5min-100%酒精n5min—95%酒精5min—85%酒精5min—75%酒精5min—•蒸馈水浸泡5min—•苏木精染液（15min—流水冲洗5min—HC1-酒精分化液3〇s-流水冲洗2〇min镜检后蒸馏水冲洗2min酒精（lmin—85%酒精（lmin—伊红染液2min—酒精I2min—95%酒精II2min—100%酒精I2min—100%酒精n2min—二甲苯I5min-二甲苯n5min;[0044]12封固：在染色后的视网膜组织边缘滴中性树胶，用右手持细镊轻轻地夹住盖玻片的右侧，并把它的左边放在树胶的左边，然后左手持解剖针扶住盖玻片的左边，右手将镊子松开逐渐下降，慢慢抽出，这样树胶在盖玻片均匀地展开并将其中气泡排出，用二甲苯擦干净盖玻片周多余边溢的树胶，将切片放置平稳，稍加重压，待树胶干燥凝固，即得，切片可长期保存。[0045]本实施例中小鲵科动物山溪鲵Batrachuperuspinchonii视网膜石蜡切片显微图如图1所示，图中Lens为晶状体，Retina为视网膜。[0046]注意事项：[0047]丨、步骤4中脱水处理使用梯度浓度乙醇的作用是利用不同浓度的乙醇逐步脱去组织细胞中的水分，而不至于使组织细胞变形影响观察效果，需要注意的是采用高浓度乙醇脱水时应严格把握时间，以免脱水过度。[0048]2、步骤5中透明处理采用的二甲苯有透明组织的作用，利用二甲苯占据细胞中乙醇位置从而达到透明组织的效果，需要注意的是应时刻注意透明程度且透明适当后立即放入石蜡中。脱水时应注意每级中停留的时间依材料的大小、性质以及固定液的性质而定。[0049]3、步骤5中如果组织块有局部不能透明即有呈白色混浊状态时，则是因脱水不彻底所致，应退回重新脱水，然后再透明。[0050]4、步骤6中浸蜡的作用是利用石蜡与二甲苯互溶的特性，使石蜡占据组织中二甲苯的位置，从而有利于切片。[0051]5、步骤（11中染色过程使用的二甲苯其作用是脱蜡，苏木素染色细胞核，伊红染色细胞质，需要注意的是染色过程须严格把握时间以免功亏一篑。

权利要求：1.小鲵科动物视网膜显微组织切片的制备方法，其特征在于:包括以下步骤：1取材:将小鲵科动物的眼球完整无损的取出，并修剪多余组织；2固定、冲洗:将采集的眼球置于固定液中，固定后冲洗备用；3脱水:将经固定处理的眼球组织依次浸入浓度梯度5〇%、70%、80%、9〇%、95%、100%的乙醇中脱水，其中95%、100%乙醇各重复两次，每个梯度脱水45〜60min;4透明：将经脱水处理的眼球组织浸入100%乙醇与二甲苯的混合液中2〜3min，取出后再浸入二甲苯中10〜30min;所述100%乙醇与二甲苯的体积比为1:1;5浸蜡:将经透明处理的眼球组织放入二甲苯与石蜡的混合液中20〜30min，取出后再分两次放入石蜡中，每次45〜60min;所述二甲苯与石蜡的体积比为1:1;6将经浸蜡处理的眼球组织包埋，依次经切片、展片、贴片、烤片、染色、封固处理，即得;所述切片的厚度为4〜6mi，切片后置于42〜45°C的水中展片;所述贴片、烤片为:待切片自然伸展平后从水中取出，控干水分，置于37〜45°C下干燥2〜4h，或者于室温下自然干燥一夜；所述染色为H.E染色，操作步骤为:将切片依次置于二甲苯IlOmin、二甲苯ni0min、100%乙醇I5min、100%乙醇II5min、95%乙醇5min、85%乙醇5min、75%乙醇5min、水5min、苏木精染液10〜20min，流水冲洗5min，再置于HC1-乙醇分化液20〜40s，流水冲洗10〜30min，镜检，流水冲洗2min，再依次置于70%乙醇lmin、85%乙醇lmin、伊红染液2min、95%乙醇I2min、95%乙醇II2min、100%乙醇I2min、100%乙醇n2min、二甲苯I5min、二甲苯II5min。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述苏木精染液为:将lg苏木精溶于20mL100%乙醇中得甲液，50g钾明矾溶于300mL蒸馏水中得乙液;将甲液、乙液混合，煮沸2〜3min，再加蒸馏水定容至lOOOmL;最后加入〇.2g碘酸钠，即得。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述伊红染液为:将〇•5g伊红加入到100mL85%乙醇中，溶解完全，即得。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述HC1-乙醇分化液为:将lmL盐酸加入到99mL70%乙醇中，混匀，即得。

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