买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所

摘要：本发明提供用于鉴别DAdV‑2和DAdV‑3的引物组，属于禽病学研究领域。采用了如SEQ ID NO.1‑2所示的引物组（2条引物），对鸭群中的属于腺病毒科禽腺病毒属的两种鸭源禽腺病毒（DAdV‑2和DAdV‑3）的鉴别诊断方法，本发明基于DAdV‑2和DAdV‑3的pVⅢ基因特点，建立一种仅需一套引物组（2条引物）的检测方法，即可科学对DAdV‑2和DAdV‑3进行鉴别，为在鸭群中开展DAdV‑2和DAdV‑3分子流行病毒学调查和科学防控相关疫病提供技术支撑，具有十分重要的研究意义。

主权项：1.用于鉴别DAdV‑2和DAdV‑3的引物组，其特征在于：所述引物组如下：DAdV‑23‑F：5’‑ CGATCAACAACCCTACGCCAAC ‑3’，DAdV‑23‑R：5’‑ CTGAGCTGTACGCGACCTT ‑3’ 。

全文数据：用于鉴别DAdV-2和DAdV-3的引物组技术领域[0001]本发明属于禽病学研宄领域，具体涉及用于鉴别DAdV-2和DAdV-3的引物组。背景技术[0002]根据国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV的最新分类（https:talk,ictvonline.org，腺病毒科（Family:AiMoWridae下设5个属Genera，分别为富AT腺病毒属Genus:Atadenovirus、禽腺病毒属Genus:Aviadenovirus、鱼腺病毒属Genus:Ichtadenovirus、哺乳动物腺病毒属Genus:Mastadenovirus和唾液酸酶病毒属（Genus:Siadenovirus。[0003]研究发现，禽类中存在多种腺病毒感染，其中感染鸡的腺病毒有5种:禽腺病毒A型FowlaviadenovirusA，FAdV-A、禽腺病毒B型（FowlaviadenovirusB，FAdV-B、禽腺病毒C型（FowlaviadenovirusC，FAdV-C、禽腺病毒D型（FowlaviadenovirusD，FAdV-D、禽腺病毒E型FowlaviadenovirusE，FAdV-E，均属于禽腺病毒属。感染火鸡Turkey的腺病毒有4种，分别属于腺病毒科的两个属，其中火鸡腺病毒B型（TurkeyaviadenovirusB、火鸡腺病毒C型（TurkeyaviadenovirusC和火鸡腺病毒D型（TurkeyaviadenovirusD属于禽腺病毒属;而火鸡唾液酸酶病毒A型TurkeysiadenovirusA属于唾液酸酶病毒属。感染鹦鹉Psittacine的腺病毒有2种，分别属于腺病毒科的两个属，其中鹦鹉富AT腺病毒属A型（PsittacineatadenovirusA属于富AT腺病毒属；而鹤踏腺病毒B型PsittacineaviadenovirusB属于禽腺病毒属。[0004]当前研宄表明，鸭群中己报道的腺病毒有属于富AT腺病毒属的鸭腺病毒A型duckadenovirusA，缩写为DAdV-AhSOM年，随着高通量技术的发展，MarekA等测定了1株鸭源腺病毒GR株，GenBank登录号NC024486全基因组序列，并将其命名为鸭腺病毒2型（duckadenovirus2，DAdV-2，属于禽腺病毒属新成员（MarekA,KajSnGL，KosiolC，etal.Completegenomesequencesofpigeonadenovirus1andduckadenovirus2extendthenumberofspecieswithinthegenusAviadenovirus[J].Virology,2014，462-463:l〇7_l14.，随后ICTV将其科学命名为鸭腺病毒B型（duckaviadenovirusB，用来区别鸭腺病毒A型，为了便于研究的一致性，本发明还是将其写为DAdV-2。随后2014年以来，在我国番鸭中出现一种新的鸭腺病毒CH-GD-2014株，GenBank登录号KR135164，该病毒和鸭腺病毒2型duckadenovirus2GR株存在以下明显区别:①其全基因组序列和GR株的核苷酸同源性仅为92•3%;②CH-GD-2014株和GR株的Hexon基因的核苷酸同源性仅为76.6%，低于80.0%;③CH-GD-2014株有2个纤突蛋白（Fiberl、Fiber2，而GR株只有1个纤突蛋白Fiber。基于上述特征表明在我国鸭群中流行一种新的鸭腺病毒，并将其命名为鸭腺病毒3型（duckadenovirus3，DAdV-3周镇海.鸭腺病毒3型基因组序列分析及致病性研究[D]•华南农业大学硕士论文，2016.。上述研究表明，当前在鸭群中已发现3种腺病毒:属于富AT腺病毒属的DAdV-A、属于禽腺病毒属的DAdV-2和DAdV-3。[0005]腺病毒颗粒为无囊膜、核衣壳呈二十面体对称、线性、双链DNA病毒，其基因组全长约为33kd左右。pvni蛋白是腺病毒的主要结构蛋白，位于衣壳的内面，与六邻体紧密相连，属六邻体相关蛋白，内有3个蛋白酶切位点，其对完整病毒粒子的形成是必不可少的，且与其他腺病毒和哺乳动物腺病毒的同源性差别很大。利用分子生物学软件对DAdV-2和DAdV-3的pVm基因分析比对发现，DAdV-2代表株GR株）的pVm基因全长为786bp，编码261个aa残基的pVIE蛋白；DAdV_3代表株CH-GD-2014株的pVm基因全长为732bp，编码243个aa残基的pVm蛋白，其核苷酸同源性为97.3%。[0006]PCR技术因其具有高效性、系统性和经济简便性被广泛应用于多种病原微生物的检测。一般而言，对两个病原进行鉴别诊断，需要针对2个病原分别设计引物（即共需要4条引物），来建立鉴别诊断方法。本发明的目的是建立针对禽腺病毒属的2中鸭源腺病毒DAdV-2和DAdV-3得鉴别诊断PCR方法，为解决上述问题，本发明基于DAdV-2和DAdV-3的pVHI基因特点，建立一种仅需一套引物组2条引物）的检测方法，g卩可科学对DAdV-2和DAdV-3进行鉴别，为鸭群中开展属于禽腺病毒属的DAdV-2和DAdV-3的2种病原的流行病学调查奠定基础，具有十分重要的研究意义。发明内容[0007]本发明的目的在于提供用于鉴别DAdV-2和DAdV-3的引物组，建立一种仅需一套引物组2条引物的检测方法，即可科学对DAdV-2和DAdV-3进行鉴别，为鸭群中开展属于禽腺病毒属的DAdV-2和DAdV-3的2种病原的流行病学调查奠定基础。[0008]为实现上述目的采用以下技术方案：用于鉴别DAdV-2和DAdV-3的引物组，所述引物组如下：DAdV-23-F:5’_CGATCAACAACCCTACGCCAAC-3’，DAdV-23-R:5’-CTGAGCTGTACGCGACCTT-3’。[0009]按照DreamTaqGreenPCRMasterMixGX试剂盒推荐的的5〇此体系进行扩增，其中2XPCRMasterMix扩增反应液25yL、引物组①AdV-23_F和DAdV_23-R，l〇yM分别为1.0UL、提取的核酸模板1.0uL、补充灭菌去离子水至终体积50uL，混匀后进行PCR扩增。[0010]扩增条件为95。：预变性3min后进入循环，95〇c变性3〇s、AT52»c—62。〇退火3〇s、72°C延伸50s，35个循环结束后，72°C终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。AT52°C-62°C表示退火温度在此区间进行优化，经优化后的最佳退火温度为54°C。[0011]本发明的另一目的是提供所述的引物组在制备检测DAdV-2和DAdV-3试剂盒中的应用。[0012]本发明的优点在于：本发明基于DAdV-2和DAdV-3的pvni基因特点，建立一种仅需一套引物组2条引物）的PCR方法，结果判定如下：当目的条带约213bp时判为DAdV-2阳性;当目的条带约159bp时判为DAdV-3阳性；当目的条带约213bp和159bp时判为DAdV-2和DAdV-3混合感染阳性;本发明方法fg]单实用、方便快捷，即可科学对DAdV_2和DAdV-3进行鉴别，具有十分重要的研究章义。心、附图说明[0013]图1DAdV-3与DAdV-2的基因缺失区。[0014]图2PCR产物电泳分析，其中M:DL500分子量标准；1:DAdV-2;2:DAdV-3;3:DAdV-2和0八狀-3混合感染；4:0£¥;5:]\©?¥;6:011^;7:6?¥;84.。〇11;9:1?.厶_;10:3_3.;11:?.1«.。具体实施方式[0015]实施例11、材料1.1毒株和菌株试验用病原DAdV-3、DAdV-2、鸭肠炎病毒（DEV、番鸭细小病毒MDPV、鸭圆环病毒DuCV、鸭源鹅细小病毒GPV;试验用对照菌株鸭大肠杆菌E.coli、鸭疫里氏杆菌R.A.、沙门氏菌S.S.和鸭源禽多杀性巴氏杆菌P.M.，均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。[0016]引物设计根据美国国家生物技术信息中心（NationalCenterofBiotechnologyInformation，NCBI数据库GenBank上腺病毒科DAdV-2代表株GR株NC024486、DAdV-3代表株CH-GD-2014株）的pVHI基因，利用LasergeneDNAStarMegAlign进行核苷酸系列分析比对，确定DAdV-2和DAdV-3的pVm基因核苷酸同源性为97.3%，但DAdV-3比DAdV-2存在一个54bp连续核苷酸序列GCGGGTGGGGCGATTCCGCTCTACACGAGCGGATCGGAAGGTGACGTGCAATTA缺失图1。[0017]针对此基因缺失区，利用引物设计软件Oligo7.0设计一套引物组2条），跨过该基因缺失区，设计的特异性引物序列为：DAdV-23-F:5’_CGATCAACAACCCTACGCCAAC-3’，DAdV-23-R:5’_CTGAGCTGTACGCGACCTT-3’。[0018]主要试剂DreamTaqGreenPCRMasterMix2X购自ThermoScientific公司，EasyPureGenomicDNAKit、EasyPureBacteriaGenomicDNAKit均购自北京全式金生物技术有限公司。[0019]试验方法的建立2.1基因组DNA的提取0八沢-2、04狀-3、0£¥、1\0^¥、011^、0?¥按照£387?11代6611〇1111。0祖1忖试剂盒的方法提取相应的基因组DNA，_8〇°C冻存备用。[0020]E_coli、R_A_、S.S•和P.M•按照EasyPureBacteriaGenomicDNAKit试剂盒的方法提取相应的基因组DNA，-80°C冻存备用。[0021]2.2反应液的配置和退火温度的优化按照DreamTaqGreenPCRMasterMix2X试剂盒推荐的的50uL体系进行扩增，其中2XPCRMasterMixri|Si^'t25yL^|^DAdV-23-F10uM2.0uL^|^DAdV-23-Rl〇uM1.0此、提取的核酸模板DAdV-3、DAdV_2、DAdV-3和DAdV-2混合各1.0uL、补充灭菌去离子水至终体积50yL，混匀后进行PCR扩增。[0022]扩增条件为95°C预变性3min后进入循环，95°C变性30S、AT52°C-62。〇退火30s、72°C延伸50s，35个循环结束后，72°C终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。AT52°C-62°C表示退火温度在此区间进行优化。经优化后的最佳退火温度为54°C。[0023]结果可见（图2，当模板仅加入DAdV-2时，出现大小为213bp的条带第1泳道）；当模板仅加入DAdV-3时，出现大小为159bp的条带第2泳道）；当模板加入DAdV-2和DAdV-3混合时，出现大小为213bp和159bp的两条带第3泳道）。[0024]2.3特异性试验将优化后的PCR体系和条件，对0£¥、10?¥、011^、6?¥、£.£；〇11、1?.八.、3.5.和？1.进行扩增，均未见扩增条带。结果见图2，DEV第4泳道）、MDPV第5泳道）、DuCV第6泳道）、GPV第7泳道）、E.coli第8泳道）、R.A.第9泳道S.S.第10泳道和P.M•第11泳道），表明建立的方法特异性强，对常见水禽病原均无交叉反应。[0025]临床试验对179份送检鸭源病料按照常规方法研磨处理后，利用EasyPureGenomicDNAKit提取相应的核酸DNA，利用优化后的PCR方法进行DAdV-2和DAdV-3感染的检测。结果可见，检测至IJ3份DAdV-2感染阳性，阳性率为1•68%;检测到15份DAdV-3感染阳性，阳性率为8.38%;检测到2份DAdV-2和DAdV-3共感染阳性，阳性率为1.12%。[0026]将PCR反应结束后的阳性目的片段利用琼脂糖凝胶回收试剂盒DP209,天根生化科技北京有限公司）分别进行切胶回收。按照PEASY-T1SimpleCloningKit克隆连接试剂盒CT111-01，北京全式金生物技术有限公司）说明书将PCR扩增基因片段克隆到pEASY_T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素含量为100ygmL抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒DP105,天根生化科技北京有限公司）提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物和条件对提取的质粒分别进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术北京有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行此似分析验证，均为相应的DAdV-2和DAdV-3的pVm片段，其中DAdV-2阳性片段和DAdV-2GR株）的pVm基因同源性在99•1%以上;DAdV-3阳性片段和DAdV-3CH-⑶-2014株）的pVm基因同源性在99.3%以上。[0027]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

权利要求：1.用于鉴别DAdV-2和DAdV-3的引物组，其特征在于:所述引物组如下：DAdV-23-F:5’_CGATCAACAACCCTACGCCAAC-3’，DAdV-23-R:5’-CTGAGCTGTACGCGACCTT-3’。2.权利要求1所述的引物组在制备检测DAdV-2和DAdV-3试剂盒中的应用。

百度查询： 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 用于鉴别DAdV-2和DAdV-3的引物组