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申请/专利权人：吉林大学

摘要：一种采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法，属于生物技术领域。本发明的目的是利用Crisprcas9技术敲除GADD45a基因，构建兔模型，探究该基因对于动物肝脏影响的采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法。本发明的步骤是：构建sgRNA、合成双链DNA、p UC‑57载体线性化、连接p UC‑57载体和双链DNA、转化、单克隆的挑取及质粒DNA的提取、鉴定质粒测序、CAS9表达质粒，经酶切线性化，用于体外转录。本发明经过相关检测，成功获得Gadd45a敲除兔模型，该模型的获得能够在给予相应酒精刺激后模拟临床上脂肪肝、肝硬化和肝癌等肝功能病的病理过程，能更有效地预测新疫苗、新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果，同时大大降低新药研发的风险，为临床研究提供基础模型。

主权项：一种采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法，其特征在于：①构建sgRNA：在Gadd45a基因第1个外显子处选取2个sgRNA序列作用靶点，合成两对寡聚核苷酸链：Sgrna1‑F TAGGTCGCGGTCCTCGGCGAAACCSgrna1‑RAAACGGTTTCGCCGAGGACCGCGA;Sgrna2‑F TAGGACTCTCCGCAATCCGGGTGCSgrna2‑R AAACGCACCCGGATTGCGGAGAGT；②合成双链DNA：两条合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链DNA；反应条件：95℃ 5min后室温放置1h；双链DNA反应体系；③p UC‑57载体线性化：p UC‑57载体在与②中合成的DNA连接时，需要先经Bbs I线性化，并回收纯化；酶切反应体系表；④连接p UC‑57载体和双链DNA：按如下连接体系进行混样，简短离心，放入16℃连接仪连接过夜，连接反应体系表；⑤转化：（1）从‑80℃冰箱取50 μL感受态细菌，加入10 μL④中的连接产物，混匀，在冰上冷却30分钟；（2）42℃水浴热激90s，冰上冷却2分钟；（3）加200μL LB液体培养基，在恒温震荡培养箱37℃，250 rpm震荡培养30 min；（4）吸取200 μL菌液均匀地涂布在氨苄抗性LB平板上，放于37℃恒温培养箱中培养12小时；⑥单克隆的挑取及质粒DNA的提取：从培养基中挑取单菌落，接种于6 mL液体LB培养基中，培养基中含6 μL氨苄青霉素，放于摇床中，37℃培养12‑14h；将细菌中的质粒提取出来；⑦鉴定质粒测序使用M13通用引物对质粒进行测序分析，测序连接正确后可用于后续实验；⑧CAS9表达质粒，经酶切线性化，用于体外转录；CAS9mRNA的合成在体外利用T7RNA聚合酶完成，酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；酶切体系。

全文数据：采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域。背景技术[0002]Gadd45家族是DNA损伤修复的重要相关基因，在细胞凋亡中发挥重要的作用。该家族由三个基因Gadd45a、Gadd45b和Gadd45g组成，调节各种细胞命运和功能，包括调控细胞周期、细胞凋亡、DNA修复和表观遗传修饰等。Gadd45a作为该家族基因之一目前的研究还主要在细胞水平上，对于动物体的影响还不明确。有文献表明在肝硬化和肝细胞癌HCC组织中Gadd45a的表达量下调。因此，我们猜测Gadd45a对肝脏功能可能有一定的影响。故建立Gadd45a敲除兔模型，对其酒精灌胃处理，观察肝损伤程度。[0003]人类肝病的病症模型肝病机理研究和新药研发的重要基础。因此建立敲除兔模型，刺激其产生相应的肝损伤，有效地模拟人类肝病的病理过程，能更有效地预测新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果，同时大大降低新药研发的风险。发明内容[0004]本发明的目的是利用CrisprCas9技术敲除GADD45a基因，构建兔模型，探究该基因对于动物肝脏影响的采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法。[0005]本发明的步骤是：①构建sgRNA:在Gadd45a基因第1个外显子处选取2个SgRNA序列作用祀点，合成两对寡聚核苷酸链：SgrnaI-FTAGGTCGCGGTCCTCGGCGAAACCSgrnaI-RAAACGGTTTCGCCGAGGACCGCGA;Sgrna2-FTAGGACTCTCCGCAATCCGGGTGCSgrna2-RAAACGCACCCGGATTGCGGAGAGT；②合成双链DNA:两条合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链DNA;反应条件:95°C5min后室温放置Ih;双链DNA反应体系③pUC-57载体线性化：pUC-57载体在与②中合成的DNA连接时，需要先经BbsI线性化，并回收纯化；酶切反应体系表④连接PUC-57载体和双链DNA:按如下连接体系进行混样，简短离心，放入16°C连接仪连接过夜，连接反应体系表⑤转化：1从-80°c冰箱取50yL感受态细菌，加入10yL④中的连接产物，混匀，在冰上冷却30分钟；242°C水浴热激90s，冰上冷却2分钟；3加200yLLB液体培养基，在恒温震荡培养箱37°C，250rpm震荡培养30min;4吸取200yL菌液均匀地涂布在氨苄抗性LB平板上，放于37°C恒温培养箱中培养12小时；⑥单克隆的挑取及质粒DNA的提取：从培养基中挑取单菌落，接种于6mL液体LB培养基中，培养基中含6yL氨苄青霉素，放于摇床中，37°C培养12-14h;将细菌中的质粒提取出来；⑦鉴定质粒测序使用M13通用引物对质粒进行测序分析，测序连接正确后可用于后续实验；⑧CAS9表达质粒，经酶切线性化，用于体外转录;CAS9mRNA的合成在体外利用T7RNA聚合酶完成，酶切37°C3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；酶切体系[0006]本发明模型建立过程：1受精卵的获取和显微注射注射卵泡刺激素FSH，之后注射人绒毛膜促性腺激素HCG购于宁波第二激素厂），获取受精卵，通过显微注射仪器将预混合好的CAS9mRNAsgRNA混合物注射到细胞质中CAS9mRNA150ngAU;sgRNA30ngAU。[0007]2体外培养受精卵并进行发育将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37°C恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中，用于后面实验；3胚胎Gadd45a基因敲除情况鉴定显微注射后的胚胎，体外培养5d后，取出发育至桑椹胚期的胚胎，放于PBS中清洗3次后，收集单个胚胎至于PCR管中，在单个胚胎中加入5yLNP40裂解液进行胚胎裂解，裂解条件为:56°C，Ih;95°C，10min，以裂解产物为模板，使用PCR上游和下游引物进行PCR扩增，电泳鉴定，并进行DNA测序，得到基因型鉴定结果；设计PCR引物如下：上游引物:GGGTTCGGATTGCCCAAASense下游引物：GGTGCCCTGTGCAAACTAntiSensePCR反应体系PCR反应条件：95°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸40s;35个循环；72°C延伸5min；4注射后的受精卵移植及动物培育显微注射后，将受精卵移植，进行胚胎发育，进行规范化饲养。[0008]本发明经过相关检测，成功获得Gadd45a敲除兔模型，该模型的获得能够在给予相应酒精刺激后模拟临床上脂肪肝、肝硬化和肝癌等肝功能病的病理过程，能更有效地预测新疫苗、新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果，同时大大降低新药研发的风险，为临床研究提供基础模型。附图说明[0009]图1是本发明表达载体HJC57-sgRNA的结构示意图；图2是本发明PCR产物鉴定胚胎Gadd45a基因敲除情况的电泳图；图3是测序结果。具体实施方式[0010]本发明步骤是:pUC57-sgRNA载体构建①构建sgRNA:在Gadd45a基因第1个外显子处选取2个SgRNA序列作用祀点，合成两对寡聚核苷酸链：SgrnaI-FTAGGTCGCGGTCCTCGGCGAAACCSgrnaI-RAAACGGTTTCGCCGAGGACCGCGA;Sgrna2-FTAGGACTCTCCGCAATCCGGGTGCSgrna2-RAAACGCACCCGGATTGCGGAGAGT；②合成双链DNA:两条合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链DNA;反应条件:95°C5min后室温放置Ih;双链DNA反应体系③pUC-57载体线性化：pUC-57载体在与②中合成的DNA连接时，需要先经BbsI线性化，并回收纯化；酶切反应体系表④连接PUC-57载体和双链DNA:按如下连接体系进行混样，简短离心，放入16°C连接仪连接过夜，连接反应体系表⑤转化：1从-80°c冰箱取50yL感受态细菌，加入10yL④中的连接产物，混匀，在冰上冷却30分钟；242°C水浴热激90s，冰上冷却2分钟；3加200yLLB液体培养基，在恒温震荡培养箱37°C，250rpm震荡培养30min;4吸取200yL菌液均匀地涂布在氨苄抗性LB平板上，放于37°C恒温培养箱中培养12小时；⑥单克隆的挑取及质粒DNA的提取：从培养基中挑取单菌落，接种于6mL液体LB培养基中，培养基中含6yL氨苄青霉素，放于摇床中，37°C培养12-14h;将细菌中的质粒提取出来；⑦鉴定质粒测序使用M13通用引物对质粒进行测序分析，测序连接正确后可用于后续实验；⑧CAS9表达质粒，经酶切线性化，用于体外转录;CAS9mRNA的合成在体外利用T7RNA聚合酶完成，酶切37°C3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；酶切体系[0011]本发明模型建立过程：1受精卵的获取和显微注射注射卵泡刺激素FSH，之后注射人绒毛膜促性腺激素HCG购于宁波第二激素厂），获取受精卵，通过显微注射仪器将预混合好的CAS9mRNAsgRNA混合物注射到细胞质中CAS9mRNA150ngAU;sgRNA30ngAU。[0012]2体外培养受精卵并进行发育将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37°C恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中，用于后面实验；3胚胎Gadd45a基因敲除情况鉴定显微注射后的胚胎，体外培养5d后，取出发育至桑椹胚期的胚胎，放于PBS中清洗3次后，收集单个胚胎至于PCR管中，在单个胚胎中加入5yLNP40裂解液进行胚胎裂解，裂解条件为:56°C，Ih;95°C，10min，以裂解产物为模板，使用PCR上游和下游引物进行PCR扩增，电泳鉴定，并进行DNA测序，得到基因型鉴定结果；设计PCR引物如下：上游引物:GGGTTCGGATTGCCCAAASense下游引物：GGTGCCCTGTGCAAACTAntiSensePCR反应体系PCR反应条件：95°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸40s;35个循环;72°C延伸5min；4注射后的受精卵移植及动物培育显微注射后，将受精卵移植，进行胚胎发育，进行规范化饲养。

权利要求：I.一种采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法，其特征在于：①构建sgRNA:在Gadd45a基因第1个外显子处选取2个SgRNA序列作用祀点，合成两对寡聚核苷酸链：Sgrnal-FTAGGTCGCGGTCCTCGGCGAAACCSgrnal-RAAACGGTTTCGCCGAGGACCGCGA;Sgrna2-FTAGGACTCTCCGCAATCCGGGTGCSgrna2-RAAACGCACCCGGATTGCGGAGAGT；②合成双链DNA:两条合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链DNA;反应条件:95°C5min后室温放置Ih;双链DNA反应体系③pUC-57载体线性化：pUC-57载体在与②中合成的DNA连接时，需要先经BbsI线性化，并回收纯化；酶切反应体系表④连接PUC-57载体和双链DNA:按如下连接体系进行混样，简短离心，放入16°C连接仪连接过夜，连接反应体系表⑤转化：1从-80°C冰箱取50yL感受态细菌，加入10yL④中的连接产物，混匀，在冰上冷却30分钟；242°C水浴热激90s，冰上冷却2分钟；3加200yLLB液体培养基，在恒温震荡培养箱37°C，250rpm震荡培养30min;4吸取200yL菌液均匀地涂布在氨苄抗性LB平板上，放于37°C恒温培养箱中培养12小时；⑥单克隆的挑取及质粒DNA的提取：从培养基中挑取单菌落，接种于6mL液体LB培养基中，培养基中含6yL氨苄青霉素，放于摇床中，37°C培养12-14h;将细菌中的质粒提取出来；⑦鉴定质粒测序使用M13通用引物对质粒进行测序分析，测序连接正确后可用于后续实验；⑧CAS9表达质粒，经酶切线性化，用于体外转录;CAS9mRNA的合成在体外利用T7RNA聚合酶完成，酶切37°C3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；酶切体系2.权利要求1所述采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法，其特征在于:pUC57-sgRNA载体序列为SEQIDNo.1权利要求1所述采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法，其特征在于:模型建立过程：1受精卵的获取和显微注射注射卵泡刺激素，之后注射人绒毛膜促性腺激素，获取受精卵，通过显微注射仪器将预混合好的CAS9mRNAsgRNA混合物注射到细胞质中，其中CAS9mRNA150ngAU;sgRNA30ngμΐ；2体外培养受精卵并进行发育将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37°C恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中，用于后面实验；3胚胎Gadd45a基因敲除情况鉴定显微注射后的胚胎，体外培养5d后，取出发育至桑椹胚期的胚胎，放于PBS中清洗3次后，收集单个胚胎至于PCR管中，在单个胚胎中加入5yLNP40裂解液进行胚胎裂解，裂解条件为:56°C，Ih;95°C，10min，以裂解产物为模板，使用PCR上游和下游引物进行PCR扩增，电泳鉴定，并进行DNA测序，得到基因型鉴定结果；设计PCR引物如下：上游引物：GGGTTCGGATTGCCCAAASense下游引物：GGTGCCCTGTGCAAACTAntiSensePCR反应体系PCR反应条件：95°：预变性51^11;94°：变性3〇8,58°：退火3〇8,72°：延伸4〇8;35个循环；72°：延伸5min；4注射后的受精卵移植及动物培育显微注射后，将受精卵移植，进行胚胎发育，进行规范化饲养。

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