买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：宁波爱她基因科技有限公司

摘要：本发明公开了一种人GNAQ基因突变检测试剂盒以及ddPCR检测方法，包括DNA提取试剂盒、特异性引物、荧光检测探针和数字PCR仪器。所述特异性引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物长度为20bp，下游引物长度为23bp；所述荧光探针包括野生型荧光检测探针和突变型荧光检测探针。本发明设计合理，结构简单，可以直接获取组织中该位点的突变频率。检测探针的3’端均有MGB‑NFQ修饰，野生型检测探针5’端具有FAM荧光基团修饰，突变型检测探针5’端具有HEX荧光基团修饰。

主权项：1.一种人GNAQ基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括DNA提取试剂盒、特异性引物、荧光检测探针和数字PCR仪器，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物长度为20bp，下游引物长度为23bp；所述荧光探针包括野生型荧光检测探针和突变型荧光检测探针。

全文数据：一种人GNAQ基因突变检测试剂盒以及ddPCR检测方法技术领域[0001]本发明涉及分子生物学和医学领域，具体是一种人GNAQ基因突变检测试剂盒以及ddPCR检测方法。背景技术[0002]葡萄酒色斑（Port-winestains，PWS为最常见的毛细血管畸形（Capillarymalformation，又称鲜红斑癒，系先天性皮肤毛细血管扩张畸形，发病率为0.3%〜0.5%，常在出生时出现，好发于头、面、颈部，也可累及四肢和躯干。表现为边缘清楚而不规则的红斑，压之褪色或不完全褪色。红斑颜色常随气温、情绪等因素而变化。随着年龄的增长，病灶颜色逐渐加深、增厚，并出现结节样增生。部分严重的病变可伴有软组织，甚至骨组织的增生，导致患部增大变形等。65%的患者的病灶将逐渐扩张，在40岁前可增厚，出现结节，于创伤后易于出血。组织病理学研究表明鲜红斑痣是由位于真皮上层异常扩张的血管丛组成，深度约为1〇〇-1〇〇〇μπι，直径10-300μπι，而表皮层未见异常。[0003]在临床实践中发现，近些年来，脉冲染料激光与光子治疗技术在鲜红斑痣治疗领域取得了长足的进步，但临床疗效仍不尽人意，只有约10%的患者可获得完全清除。长时间停止治疗后，部分皮损的颜色会加深。Huikeshoven等采用颜色测量的方法对51例接受脉冲染料激光治疗的患者进行随访，治疗前、5次治疗后、最后一次随访时分别进行颜色测量，研究结果表明5次治疗后的效果并非持久不变，随着时间延长，皮损的颜色会逐步加深。[0004]经过临床研究发现，通过施加药物进行干预脉冲染料激光雷帕霉素等），而不同患者对于药物的敏感性存在较大的差异。且如何在PWSPort-WineStain，葡萄酒色斑）中分辨其中的SWSSturge-Webersyndrome,Sturge-Weber综合症）颜面部血管瘤存在很大的困难。[0005]根据血管瘤和脉管畸形诊断和治疗指南（2016版），目前单纯葡萄酒色斑根据病史、临床表现即可诊断。其组织病理学改变为真皮浅层毛细血管网扩张畸形，管壁仍为单层内皮细胞构成，表皮层及其周围组织正常。囿于各医院诊疗条件等主客观因素，本疾病存在着漏诊、误诊的可能。根据本指南并通过对大量临床样本的临床研究发现，在鲜红斑痣患者组织中GNAQ基因的pos.80412493存在错义突变，突变频率约为5%左右，突变型（即阳性）与野生型（即阴性结果提示后续治疗应采用不同方案，可以避免疾病进展为恶性且将治疗副作用减少到最低。目前采用的组织学或其他技术手段尚未由足够的敏感性和特异性分辨此类型的突变，而数字液滴PCRddPCR检测灵敏度高、操作简便适合此类型疾病的诊断。发明内容[0006]本发明的目的在于提供一种人GNAQ基因突变检测试剂盒以及ddPCR检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。[0007]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：[0008]一种人GNAQ基因突变检测试剂盒，包括DNA提取试剂盒、特异性引物、荧光检测探针和数字PCR仪器，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物长度为20bp，下游引物长度为23bp;所述荧光探针包括野生型荧光检测探针和突变型荧光检测探针。[0009]作为本发明进一步的方案:所述DNA提取试剂盒为QIAampDNAMini。[0010]作为本发明进一步的方案:所述荧光检测探针和特异性引物对如下：[0011]上游引物:5’-CTTAATGACTTGGACCGCGT-3’[0012]下游引物：5’-GTCAAAGGGGTATTCGATGATCC-3’[0013]野生型荧光检测探针:5’-FAM-CCCTGTGGTGGGGACTCGAAC-MGB-NFQ-3’[0014]突变型荧光检测探针：5，-HEX-CCCTGTGGTGGGGACTTGAAC-MGB-NFQ-3，；[0015]作为本发明进一步的方案:所述数字PCR仪器内配置有相应的PCR反应液和数字PCR芯片。[0016]本发明还公开了一种人GNAQ基因突变检测试剂盒的ddPCR检测方法，其特征在于，具体步骤如下：[0017]步骤一:DNA提取[0018]对被检者进行组织提取，被检者组织的取材应取自表皮以下的真皮层，包含毛细血管为宜；[0019]步骤二:扩增反应[0020]1探针和引物mix稀释。用H20PCRGrade稀释探针和引物，并将配制好的探针和引物进行分装，于-20°C冰箱中避光保存;具体的，配置IOxPrimerProbeMix用于后续实验，其中l〇xPrimerProbeMix的探针和引物浓度如下：[0021]A·2yL的上游引物：5’-CTTAATGACTTGGACCGCGT-3’：原液为100，OOOnM[0022]B·2yL的下游引物：5’-GTCAAAGGGGTATTCGATGATCC-3’：原液为100，OOOnM[0023]C.IyL的野生型荧光检测探针：5’-FAM-CCCTGTGGTGGGGACTCGAAC-MGB-NFQ-3’：原液为100,OOOnM[0024]D.IyL的突变型荧光检测探针：5，-HEX-CCCTGTGGTGGGGACTTGAAC-MGB-NFQ-3,：原液为100，000nM;[0025]E.将A-D加入含有34yL的H20PCRGrade的1.5mLEP管中，轻轻混匀。[0026]2配制PCR反应液;lxPCRmix各组分如下单位:yL，总反应孔的体积为15yL;[0027][0028]3进行PCR反应;将PCR反应液加入数字PCR芯片，并放入数字PCR仪器，反应体系如下：[0029][0030][0031]4反应结束后，导出数据，进行GNAQ基因突变率的分析；[0032]步骤三:数据分析[0033]对被检者的每个样本进行GNAQ基因pos.80412493的突变率的分析，得到GNAQ基因的突变频率。[0034]与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明设计合理，结构简单，可以直接获取组织中该位点的突变频率。检测探针的3’端均有MGB-NFQ修饰，野生型检测探针5’端具有FAM荧光基团修饰，突变型检测探针5’端具有HEX荧光基团修饰。需要说明的是，HAM，HEX属于荧光基集团，NFQ属于淬灭基团。当FAM基团或HEX基团在同一序列上时，两个基团位置相距很近，此时FAMHEX荧光基团因为NFQ淬灭基团的作用而不产生信号；当荧光探针结合到靶标序列时，会因Taq酶的扩增作用而被降解，从而导致FAMHEX荧光基团与NFQ淬灭基团分离，荧光信号得以释放并被检测到，从而用于数据的后续分析。具体实施方式[0035]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0036]数字PCR技术，是一种核酸分子绝对定量技术，具体而言，数字PCR技术采用绝对定量的策略，能够直接读取目标片段的拷贝数，这对于低拷贝序列、拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究等方面具有很大的优势。数字PCR系统能以导致遗传疾病的异常基因为靶标，只需抽取少量母体外周血提取总核酸，克服母体DNA的背景干扰，运用多种策略对其中含量极低的游离胎儿DNARNA标记进行精确定量检测分析，即可达到在基因水平对各种遗传疾病准确检测。[0037]本发明提供一种人GNAQ基因突变检测试剂盒以及ddPCR检测方法，其中所述基因突变检测试剂盒包括DNA提取试剂盒、特异性引物、荧光检测探针和数字PCR仪器。[0038]所述DNA提取试剂盒为QIAampDNAMini。[0039]本发明专利所使用的GNAQ基因突变区域的特异性扩增引物为本公司自主发明设计的。上游引物长度为20bp，下游引物长度为23bp。[0040]本发明专利所使用的GNAQ基因突变区域的特异性检测探针为本公司自主发明设计的。突变荧光检测探针的特点：[0041]具体的本专利设计的荧光检测探针和特异性引物对如下：[0042]上游引物：5，-CTTAATGACTTGGACCGCGT-3’[0043]下游引物：5，-GTCAAAGGGGTATTCGATGATCC-3，[0044]野生型荧光检测探针:5’-FAM-CCCTGTGGTGGGGACTCGAAC-MGB-NFQ-3’[0045]突变型荧光检测探针：5’-HEX-CCCTGTGGTGGGGACTTGAAC-MGB-NFQ-3’；[0046]本发明所公开的试剂盒适用于QuantStudio3DRainDropplus等各型号的数字PCR仪，同时本发明公开的实例仅使用其中一种数字PCR仪进行实验的实施举例，不影响其他平台的使用。[0047]具体实施例如下：[0048]步骤一:DNA提取[0049]适用本发明中的DNA提取试剂盒为QIAampDNAMiniKitCAT.51304或其他适宜组织gDNA提取的试剂盒。[0050]对被检者进行组织提取，被检者组织的取材应取自表皮以下的真皮层，包含毛细血管为宜。[0051]步骤二:扩增反应[0052]1探针和引物mix稀释；用H20PCRGrade稀释探针和引物，并将配制好的探针和引物进行分装，于-20°C冰箱中避光保存。具体的，配置IOxPrimerProbeMix用于后续实验，其中l〇xPrimerProbeMix的探针和引物浓度如下：[0053]A·2yL的上游引物：5’-CTTAATGACTTGGACCGCGT-3’：原液为100，OOOnM[0054]B·2yL的下游引物：5，-GTCAAAGGGGTATTCGATGATCC-3，：原液为100，OOOnM[0055]C.IyL的野生型荧光检测探针：5，-FAM-CCCTGTGGTGGGGACTCGAAC-MGB-NFQ-3,：原液为100,OOOnM[0056]D.IyL的突变型荧光检测探针：5’-HEX-CCCTGTGGTGGGGACTTGAAC-MGB-NFQ-3’：原液为100，000nM;[0057]E.将A-D加入含有34yL的H20PCRGrade的1.5mLEP管中，轻轻混匀。[0058]2配制PCR反应液；lxPCRmix各组分如下单位:yL，总反应孔的体积为15yL;[0059][0060]3进行PCR反应;将PCR反应液加入数字PCR芯片，并放入数字PCR仪器，反应体系如下：[0061][0062]4反应结束后，导出数据，进行GNAQ基因突变率的分析。[0063]步骤三:数据分析[0064]对被检者的每个样本进行GNAQ基因pos.80412493的突变率的分析，得到GNAQ基因的突变频率。[0065]与现有技术相比，本发明设计合理，结构简单，可以直接获取组织中该位点的突变频率。检测探针的3’端均有MGB-NFQ修饰，野生型检测探针5’端具有FAM荧光基团修饰，突变型检测探针5’端具有HEX荧光基团修饰。需要说明的是，HAM，HEX属于荧光基集团，NFQ属于淬灭基团。当FAM基团或HEX基团在同一序列上时，两个基团位置相距很近，此时FAMHEX荧光基团因为NFQ淬灭基团的作用而不产生信号；当荧光探针结合到靶标序列时，会因Taq酶的扩增作用而被降解，从而导致FAMHEX荧光基团与NFQ淬灭基团分离，荧光信号得以释放并被检测到，从而用于数据的后续分析。[0066]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。[0067]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

权利要求：1.一种人GNAQ基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括DNA提取试剂盒、特异性引物、荧光检测探针和数字PCR仪器，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物长度为20bp，下游引物长度为23bp;所述荧光探针包括野生型荧光检测探针和突变型荧光检测探针。2.根据权利要求1所述的人GNAQ基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂盒为QIAampDNAMini。3.根据权利要求1所述的人GNAQ基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述荧光检测探针和特异性引物对如下：上游引物:5’-CTTAATGACTTGGACCGCGT-3’下游引物：5’-GTCAAAGGGGTATTCGATGATCC-3’野生型荧光检测探针:5’-FAM-CCCTGTGGTGGGGACTCGAAC-MGB-NFQ-3’突变型荧光检测探针:5’-HEX-CCCTGTGGTGGGGACTTGAAC-MGB-NFQ-3’。4.根据权利要求1所述的人GNAQ基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述数字PCR仪器内配置有相应的PCR反应液和数字PCR芯片。5.如权利要求1〜4任一所述的人GNAQ基因突变检测试剂盒的ddPCR检测方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤一:DNA提取对被检者进行组织提取，被检者组织的取材为表皮以下并包含毛细血管的真皮层；用QIAampDNAMiniQIAGEN，Germany，货号CATN0.5130451306试剂盒按照标准流程提取。或使用其他组织DNA提取试剂盒并遵循相应的流程进行DNA提取。步骤二:扩增反应1探针和引物mix稀释；用H20PCRGrade稀释探针和引物，并将配制好的探针和引物进行分装，于-20°C冰箱中避光保存;具体的，配置IOxPrimerProbeMix用于后续实验，其中IOxPrimerProbeMix的探针和引物浓度如下，共配置40yL:A、2yL的上游引物:5’-CTTAATGACTTGGACCGCGT-3’：原液为100，OOOnMB、2yL的下游引物：5’-GTCAAAGGGGTATTCGATGATCC-3’：原液为100，OOOnMC、IyL的野生型荧光检测探针：5’-FAM-CCCTGTGGTGGGGACTCGAAC-MGB-NFQ-3’：原液为100,OOOnMD、IyL的突变型荧光检测探针：5’-HEX-CCCTGTGGTGGGGACTTGAAC-MGB-NFQ-3’：原液为100,OOOnM；E、将A-D加入含有34yL的H20PCRGrade的1.5mLEP管中，轻轻混匀。2配制PCR反应液；lxPCRmix各组分如下：H20PCRGrade:3yL，QuantStudio3DDigitalPCRMasterMixv2,2x：7.5yL,IOxProbeMix：1.5yL,ExtractedDNA：3yLIOng，总反应孔的体积为15yL;3进行PCR反应;将PCR反应液加入数字PCR芯片，并放入数字PCR仪器，反应体系如下：4反应结束后，导出数据，进行GNAQ基因突变率的分析；步骤三:数据分析对被检者的每个样本进行GNAQ基因pos.80412493的突变率的分析，得到GNAQ基因的突变频率。

百度查询： 宁波爱她基因科技有限公司 一种人GNAQ基因突变检测试剂盒以及ddPCR检测方法