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申请/专利权人：瑟纳治疗公司

摘要：本发明涉及用于研究、诊断和治疗对HBV基因表达和或活性的调节响应和或调节HBV基因表达通路的性状、疾病或状况的化合物、组合物和方法。具体而言，本发明涉及包括能够调节或介导针对HBV基因表达的RNA干扰RNAi的双链核酸分子，包括小核酸分子，如短干扰核酸siNA、短干扰RNAsiRNA、双链RNAdsRNA、微小RNAmiRNA和短发夹RNAshRNA分子。

主权项：1.抑制乙型肝炎病毒HBV表达的双链短干扰核酸siNA分子，其由有义链和反义链组成，所述有义链由核苷酸序列5’ – ugAGaGaaGuCCAcCaCGAUsU ‑ 3’ SEQ ID NO:410组成，所述反义链由核苷酸序列5’ – B UCGUgguGGaCUUcUCUCaUsU B ‑ 3’ SEQ ID NO:411组成，其中B是反向脱碱基部分；粗体核苷酸包含2'‑O‑甲基修饰，小写字母核苷酸包含2'‑氟修饰，斜体核苷酸是脱氧核苷酸，并且s是硫代磷酸酯键。

全文数据：使用短干扰核酸SiNA的乙型肝炎病毒HBV基因表达的RNA干扰介导的抑制[0001]序列表[0002]依照37CFR§1.52e5，经由EFS提交的序列表通过引用并入本文。经由EFS提交的序列表文本文件包含于2010年8月17日创建的文件〃SequenceListingJFDl"，其大小为455,495字节。[0003]发明背景[0004]乙型肝炎是由乙型肝炎病毒HBV引起的传染性肝脏疾病。该疾病可以急性引起肝脏炎症、呕吐、黄疸并且在一些少数情况下严重的暴发性疾病、死亡。大多数感染导致慢性疾病，所述慢性疾病可以是无症状的或导致慢性肝脏炎症，所述慢性肝脏炎症导致肝硬化和肝细胞癌HCC发展的发病率上升。[0005]HBV感染是全球性问题，全世界有约350百万人被慢性感染，每年有60万人死于HBV相关的肝脏疾病或HCC。该疾病已引起在亚洲和非洲的疾病流行，并且在中国流行。HBV的传播是经由传染性血液或体液。目前有用于预防HBV感染的疫苗。然而，疫苗是预防性的，不能用于治疗已被感染的患者。[0006]有数个批准的通过阻断HBV聚合酶的作用而防止HBV复制的慢性乙型肝炎的化疗治疗拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定）。所述治疗都没有导致病毒的完全清除，这些治疗导致在延长的治疗之后发展的耐药的HBV变异株。也可以用聚乙二醇化干扰素-α2a治疗乙型肝炎，但是这种治疗与严重的副作用相关，不是在所有患者中都有效。[0007]HBV是嗜肝病毒科的成员，基于抗原表位，其被分为4种主要血清型adr、actf、ayr、aW。基于基因组序列，该病毒也可以归类为8种基因型A-Η。基因型A在美洲、非洲、印度和西欧是常见的。基因型B和C存在于亚洲和美国。基因型D在南欧和印度是最常见的。基因型E存在于西非和南非。基因型F和H通常存在于中美洲和南美洲。基因型G通常存在于欧洲和美国。[0008]HBV基因组由部分双链的环状DNA链组成。基因组是〜3.3Kb长度。其编码4个已知基因（C、X、P和S。HBV是在复制过程中利用逆转录酶的少数DNA病毒之一。HBV复制涉及多个阶段，包括进入、脱衣壳和将病毒基因组运输到细胞核中。最初，HBV基因组的复制涉及产生RNA中间体，然后所述RNA中间体被逆转录以产生DNA病毒基因组。[0009]由于目前的治疗方法效率低下、严重的副作用或由于耐药变异株的产生，目前的治疗方法是有限的，所以在临床上需要开发新的疗法来治疗HBV感染。[0010]通过RNA干扰似下称为“RNAi”）改变病毒基因表达，特别是HBV基因表达，是满足这种需要的一种方法。通过短单链RNA“ssRNA”）或双链RNA〃dsRNA〃）分子诱导RNAi。短dsRNA分子，称为“短干扰核酸（“siNA”）”或“短干扰RNA”或“siRNA”或“RNAi抑制剂”使与该SiNA共有序列同源性的信使RNA"mRNAs"的表达沉默。这可以经由通过包含SiNA的内切核酸酶复合物，通常称为RNA诱导性沉默复合物RISC介导的mRNA切割发生。目标RNA的切割一般发生于与siNA双链体的引导序列互补的区域中部Blbashir等人，2001，Genes，15,188。此外，RNA干扰还可以涉及小RNA例如微小RNA或miRNA介导的基因沉默，推测通过抑制翻译或调节染色质结构且从而阻止目标基因序列的转录的细胞机制（参见例如，AlIshire，2002,Science,297:1818-1819;Volpe等人，2002,Science,297:1833-1837;Jenuwein，2002，Science，297:2215-2218;和Hall等人，2002，Science，297:2232-2237〇[0011]数项研究已经尝试使用RNAi用于治疗HBV，在i?應Ifortreating·fepatitisΰViralInfection,Chen,Y等人.，PharmaceuticalResearch,2008第25卷，第I期，第72-86页中已经全面综述了这种方法。然而，正如上述参考文献中所述，单一siRNA的转染往往不能提供足够的基因沉默。出处同上。因此，尽管RNAi技术领域取得了显著进步，但是仍然需要可以有效抑制HBV基因表达并且可以治疗与HBV表达相关的疾病如肝脏疾病和癌症的试剂。[0012]发明概述[0013]本发明提供了对于用调节HBV表达的新的短干扰核酸（SiNA分子治疗对调节HBV基因表达响应的疾病的问题的解决方案。[00M]本发明提供了用小核酸分子通过RNA干扰RNAi用于调节HBV基因的表达并用于治疗乙型肝炎和由乙型肝炎感染导致的这种状况的化合物、组合物和方法。[0015]特别地，本发明的特征在于用于调节HBV基因和或涉及HBV基因表达和或活性的途径的其他基因表达的小核酸分子和方法，所述小核酸分子即短干扰核酸siNA分子，包括但不限于短干扰RNAsiRNA、双链RNAdsRNA、微小RNAmiRNA、短发夹RNAshRNA和环状RNA分子。本发明人已经发现，选择来自所有已知的完整HBV基因组的保守区的目标位点导致具有高的效力和功效的序列。[0016]在一个方面，本发明提供了在细胞或哺乳动物中抑制HBV基因表达的双链短干扰核酸siNA分子，其中所述双链siNA包含有义和反义链。反义链包含与和HBV基因的表达相关的RNA的至少一部分互补的序列。有义链包含与反义链互补的序列。在各个实施方案中，至少一条链包含至少一个选自序列SEQIDNO:1-502的15个核苷酸的序列。在某些实施方案中，反义链包含至少15个核苷酸，所述至少15个核苷酸与表Ia中所述的目标序列具有序列互补性。在其他和或在相同的实施方案中，反义链包含至少一个表Ib中所述的反义序列之一的15个核苷酸的序列。在一些实施方案中，有义链包含至少一个表Ib中所述的有义链序列的15个核苷酸的序列。[0017]在本发明的该方面的某些实施方案中，提供了双链短干扰核酸（siNA分子，其中反义链包含表Ic中所述的修饰的序列，所述修饰的序列与本发明的目标序列具有序列互补性。在一些实施方案中，有义链还包含表Ic中所述的修饰的序列。[0018]在某些实施方案中，本发明提供了调节HBV表达的双链短干扰核酸siNA分子，其中siNA包含有义链和反义链;每条链独立地是15-30个核苷酸的长度;反义链包含与下列中任一个具有序列互补性的至少15个核苷酸：[0020]在本发明的一些实施方案中，SiNA分子的反义链包含至少一个下列的15个核苷酸：[0023]在一些实施方案中，本发明的siNA分子的有义链包含至少一个下列的15个核苷酸：[0026]在一些实施方案中，本发明的siNA分子包含下列中的任一个：[0029]在一些实施方案中，本发明的特征在于包含下列中任一个的双链短干扰核酸siNA分子:双链体[0032]在一些实施方案中，本发明的特征在于组合物，所述组合物包含：[0033]a本发明的双链短干扰核酸siNA;[0034]⑹具有化合物编号1-46中任一个的阳离子脂质化合物或其任何组合；[0035]c胆固醇；[0036]dDSPCjP[0037]ePEG-DMG。[0038]在一些实施方案中，本发明的组合物包含具有下列摩尔比的化合物编号1-46中任一个的任何阳离子脂质：[0039]阳离子脂质胆固醇PEG-DMG56.6385.4;[0040]阳离子脂质胆固醇PEG-DMG60382;[0041]阳离子脂质胆固醇PEG-DMG67.3293.7;[0042]阳离子脂质胆固醇PEG-DMG49.3473.7;[0043]阳离子脂质胆固醇PEG-DMG50.344.35.4;[0044]阳离子脂质胆固醇PEG-C-DMADSPC4048210;[0045]阳离子脂质胆固醇PEG-DMGDSPC4048210;和[0046]阳离子脂质胆固醇PEG-DMGDSPC5830210。[0047]在一些实施方案中，本发明的组合物包含分别具有分别约50:30:10:2的摩尔比的13Z，16Z-N，N-二甲基-3-壬基二十二烷基-13，16-二烯-l-胺、胆固醇、DSPC和PEG-DMG。[0048]在一些实施方案中，本发明的组合物进一步包含冷冻保护剂。在一些实施方案中，冷冻保护剂是蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖、甘露糖醇、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、麦芽三糖-七糖、葡聚糖、羟乙基淀粉、胰岛素、山梨糖醇、甘油、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、二甲亚砜或其任何组合。在一些实施方案中，冷冻保护剂是蔗糖。在一些实施方案中，冷冻保护剂是海藻糖。在一些实施方案中，冷冻保护剂是蔗糖和海藻糖的组合。[0049]在本发明的一些实施方案中，本发明的SiNA的所有核苷酸都是未修饰的。在其他实施方案中，siNA分子的一条或两条链中的独立地一个或多个例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个）核苷酸位置是修饰的。修饰包括核酸糖修饰、碱基修饰、主链核苷酸间键修饰、非核苷酸修饰和或其任何组合。在某些情况下，嘌呤和嘧啶核苷酸是差别修饰的。例如，嘌呤和嘧啶核苷酸在2’-糖位置上可以是差别修饰的（即，至少一个嘌呤具有与在2’-糖位置上在相同或不同链中的至少一个嘧啶不同的修饰）。在某些情况下，在一条或两条链中嘌呤未修饰，而在一条或两条链中嘧啶是修饰的。在某些其他情况下，在一条或两条链中嘧啶未修饰，而在一条或两条链中嘌呤是修饰的。在一些情况下，至少一个修饰的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸或2’-0_烷基核苷酸。在一些情况下，在一条或两条链中的至少5个或更多的嘧啶核苷酸全部是2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸或全部是2’-0-甲基嘧啶核苷酸。在一些情况下，在一条或两条链中的至少5个或更多的嘌呤核苷酸全部是2’-脱氧-2’-氟嘌呤核苷酸或全部是2’-0-甲基嘌呤核苷酸。在某些情况下，其中siNA分子包含本文所述的一个或多个修饰，在引导反义链的5’末端的1、2和3位的核苷酸是未修饰的。[0050]在某些实施方案中，本发明的SiNA分子具有在一条或两条链上的1、2、3或4个核苷酸的3’突出端。在其他实施方案中，siNA分子缺乏突出端（S卩，具有平端）。优选地，siNA分子具有在有义和反义链上的2个核苷酸的3’突出端。突出端可以是修饰或未修饰的。在突出端中的修饰核苷酸的实例包括但不限于2’-0-烷基核苷酸、2脱氧-2氟核苷酸、锁定核酸LNA核苷酸或2’-脱氧核苷酸。反义链中的突出端核苷酸可以包括与HBV目标序列中的核苷酸互补的核苷酸。同样地，有义链中的突出端可以包括在HBV目标序列中的核苷酸。在某些情况下，本发明的SiNA分子在反义链上具有其为2’-ο-烷基例如，2’-ο-甲基核苷酸的2个3’突出端核苷酸，和在有义链上具有其为2脱氧核苷酸的2个3’突出端核苷酸。在其他情况下，本发明的SiNA分子在反义链和有义链上都具有两个3’突出端核苷酸，所述3’突出端核苷酸为2’-0-烷基例如，2’-0-甲基核苷酸。在某些实施方案中，2’-0-烷基核苷酸是2’-0_甲基尿苷核苷酸。在某些情况下，突出端也包括在突出端的核苷酸之间的一个或多个硫代磷酸酯键。[0051]在某些实施方案中，本发明的SiNA分子具有帽（在本文中也称为“末端帽”）。帽可以存在于5末端5帽或3末端3帽处，或可以存在于2个末端上，例如在siNA的有义链的5’和3’末端处。[0052]在一些实施方案中，本发明的SiNA分子在反义链的5’末端是磷酸化的。磷酸酯基团可以是磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。[0053]本发明的siNA分子当是双链时可以是对称的或不对称的。这些双链SiNA的每条链的核苷酸长度可以独立地是3-30个核苷酸。通常，本发明的SiNA分子的每条链约为15-30即，约为19、20、21、22、23或24个核苷酸长度。[0054]本发明的siNA分子，其为双链的或具有双链体结构，独立地包含约3-约30例如，约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对。通常，本发明的SiNA的双链体结构为15-30,更通常为18-25,还更通常为19-24,和最通常为19-21个碱基对长度。[0055]在某些实施方案中，提供了双链短干扰核酸（SiNA分子，其中所述分子具有有义链和反义链且包括式A:[0057]其中，上链是双链核酸分子的有义链，下链是双链核酸分子的反义链;其中所述反义链包含SEQIDN0:452，SEQIDN0:453，SEQIDN0:454,或SEQIDN0:455中的至少一个15个核苷酸序列，有义链包含与所述反义链具有互补性的序列；[0058]每个N独立地是未修饰或化学修饰的核苷酸或非核苷酸；[0059]每个B是存在或不存在的末端帽；[0060]⑽代表突出端核苷酸，其各自独立地是未修饰或化学修饰的；[0061][N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；[0062]Π和X2独立地是0-4的整数；[0063]X3是15-30的整数；[0064]X4是9-30的整数；和[0065]X5是0-6的整数，条件是X4和X5的总和是15-30。[0066]在一个实施方案中，本发明的特征在于式㈧的双链短干扰核酸SiNA;其中[0067]aNm位置中的一个或多个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-0-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；[0068]⑹Nm位置中的一个或多个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-0-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；[0069]cNx3位置中的一个或多个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-0-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合;和[0070]⑹Nx3位置中的一个或多个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-0-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸。[0071]本发明进一步提供了组合物，所述组合物包含本文所述的双链核酸分子和药学上可接受的载体或稀释剂。[0072]组合物的施用能通过已知方法进行，其中所述核酸在体外或体内引入所需目标细胞内。[0073]用于将本发明的核酸分子引入细胞、组织和生物内的常用技术包括各种载体系统、试剂和载体的使用。适合于在本发明中使用的此类载体系统的非限制性实例包括缀合物、核酸-脂质颗粒、脂质纳米颗粒LNP、脂质体、脂复合体（Iipoplexes、胶粒、病毒体virosomes、病毒样颗粒VLP、核酸复合物及其混合物。[0074]本发明的组合物可以是气溶胶、分散体、溶液（例如可注射溶液）、乳膏、软膏、片剂、粉末、悬浮液等的形式。这些组合物可以以任何合适的方式施用，例如经口、舌下、经颊、肠胃外、经鼻或局部。在一些实施方案中，组合物是气溶胶化的且经由吸入递送。[0075]本发明的分子和组合物具有在广泛范围的治疗应用上的效用。相应地，本发明的另一个方面涉及本发明的化合物和组合物在治疗受试者中的用途。本发明从而提供了用于治疗患有状况的受试者例如人的方法，所述状况通过HBV的作用介导，其中所述方法包括给所述受试者施用有效量的本发明的双链短干扰核酸SiNA分子。因此，本发明的SiNA分子治疗乙型肝炎感染和或由此产生的状况。在一些实施方案中，状况是肝脏疾病。在其他实施方案中，状况是癌症。[0076]本发明的这些及其他方面在参考下述详述和附图后将是显而易见的。此外，可以预期的是，本文所述的任何方法或组合物可以与本文所述的任何其他方法或组合物一起实施，并且可以组合不同的实施方案。[0077]另外，说明书自始至终引用专利、专利申请及其他文件，以描述且更具体地阐述本发明的各个方面。本文引用的这些参考文献各自包括附图完整地通过引用并入本文。[0078]附图简述[0079]图1显示了涉及RNAi的目标RNA降解的非限制性被提议的机制代表。通过依赖于RNA的RNA聚合酶RdRP由外来单链RNA产生的双链RNAdsRNA激活切酶DICER，所述切酶依次产生SiNA双链体，所述外来单链RNA例如病毒、转座子或其他外源RNA。可替代地，合成或表达的SiNA可以通过合适的方法直接引入细胞内。形成识别目标RNA的活性SiNA复合物，从而导致通过RISC内切核酸酶复合物降解目标RNA或导致通过依赖于RNA的RNA聚合酶RdRP合成另外的RNA，其可以激活切酶且导致另外的siNA分子，从而扩大RNAi应答。[0080]图2显示了使用代表性SiNA双链体的通用结构的本发明的化学修饰的SiNA构建体的非限制性实例。关于本发明的任何SiNA分子，除了本文所述的其他修饰和特征之外，可以单独使用图中所示的特定修饰或与图中的其他修饰组合使用。在该图中，N代表此处所述的任何核苷酸或任选地非核苷酸。具有B-Nx3-NX2-B-3’的顶部链是SiNA的有义链或过客链），而具有8抑11-阶4-[扣15-5’的下部链是81祖的反义链（引导链）。有义链的内部部分的核苷酸或任选的非核苷酸被指定为Nx3，反义链的内部部分的核苷酸或任选的非核苷酸）被指定为NX4。内部部分的核苷酸或任选的非核苷酸通常在两条链之间碱基配对，但是在一些实施方案中可以任选地缺乏碱基配对例如，具有错配或缺口）。通过括号指定突出端区域的核苷酸或任选的非核苷酸）。反义链的5’-末端部分的核苷酸被指定为[N]。末端帽任选地存在于有义链的5’和或3’末端，并进一步任选地存在于反义链的3末端。一般来说，每条链可以独立为约15-约30个核苷酸长度，但根据任何突出端核苷酸的存在也可以变化。在某些实施方案中，Xl和X2独立地为0-4的整数;X3是15-30的整数;X4是9-30的整数；X5是0-6的整数，条件是X4和X5的总和为15-30。显示了对于SiNA构建体的有义和反义链的核苷酸的各种修饰。可以如本文所述例如，2’-O-甲基、2脱氧-2’-氟、2脱氧、LNA、通用碱等对⑻突出端核苷酸位置进行化学修饰，并且可以源自相应的目标核酸序列，或不是源自相应的目标核酸序列。图中所示的构建体也可以包含如本文所述的硫代磷酸酯键。例如，硫代磷酸酯键可以存在于任何N、（N，和或[N]位置之间。此类硫代磷酸酯可以应用在嘌呤“R”和嘧啶Ύ’位置之间，或用于稳定通常的嘧啶键。此外，尽管在图上未描绘，但图中显示的构建体可以任选包括在来自有义链的5’-末端的第9位，或通过从引导链的5’-末端计数11个核苷酸位置基于引导链的5’-末端的第11位处的核糖核苷酸。同样，反义链在从5’_末端的第14位包括核糖核苷酸，或者可替代地选择或设计该反义链使得2’-0-烷基核苷酸（例如，2’-0_甲基嘌呤）不存在于这个位置。此外，虽然没有在图中显示，但是反义链的5’_末端位置可以包含如本文所述的末端磷酸酯基团。反义链通常包含与本发明的任何目标核酸序列互补的序列，如在本文表Ia中所述的那些。[0081]图3显示了应用于图2中所述的代表性SiNA双链体的修饰的某些组合的非限制性实例。下述显不代表性结构的表格提供了⑻Xl、（NX2、Nx3、Nx4和或[N]X5核苷酸（和任选的非核苷酸位置的特定组合。例如，指定5个或更多的例如，5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多Nx3和5个或更多的（例如，5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多Nx4嘧啶Ύ’和嘌呤“R”核苷酸的组合，除了任选的硫代磷酸酯取代以外，其中每一个都可以独立地具有如图中所示的特定的⑻χθΡ或⑽χ2取代。5末端反义链[N]核苷酸通常是核糖核苷酸，但也可以根据它们是否是嘌呤“R”或嘧啶Ύ’核苷酸而修饰或未修饰。[0082]图4Α-C显示了本发明的不同siNA构建体的非限制性实例。图2和图3中所示的代表性结构的标准可以应用于图4A-C中所示的结构中的任一种。[0083]图4Α中显示的实例（构建体1、2和3具有19个代表性碱基对;然而，本发明的不同实施方案包括本文描述的任何数量的碱基对。括号区域代表核苷酸突出端，例如，包含长度为约1个、2个、3个或4个核苷酸，优选约2个核苷酸。构建体1和2可以独立地用于RNAi活性。构建体2可以包含多核苷酸或非核苷酸接头，其可以任选被设计为生物可降解的接头。在一个实施方案中，构建体2中显示的环结构可以包含生物可降解的接头，其导致在体内和或体外形成构建体1。在另一个实例中，构建体3可以用于在相同原理下产生构建体2,其中接头用于在体内和或体外产生活性siNA构建体2,其可以任选利用另一种生物可降解的接头以在体内和或体外产生活性siNA构建体1。因此，siNA构建体的稳定性和或活性可以基于用于在体内或体外和或体外使用的siNA构建体的设计进行调节。[0084]图4Β中显示的实例代表本发明的双链核酸分子的不同变化，例如微小RNA，其可以包括起因于部分互补性的突出端、凸起、环和茎-环。具有凸起、环和茎-环的此类基序一般是miRNA的特征。凸起、环和茎-环可以起因于任何程度的部分互补性，例如在本发明的双链核酸分子的1条或2条链中约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多核苷酸的错配或凸起。[0085]图4C中显示的实例代表本发明的模型双链核酸分子，其包含具有2个21核苷酸序列、具有2个核苷酸3突出端的19个碱基对双链体。顶部链（1代表有义链过客链），中间链⑵代表反义链（引导链），和下部链⑶代表目标多核苷酸序列。2个核苷酸突出端NN可以包含衍生自目标多核苷酸的序列。例如，引导链中的3’-NN序列可以与目标多核苷酸的5’-[NN]序列互补。此外，过客链的5’-NN序列可以包含与目标多核苷酸序列的5’-[NN]序列相同的序列。在其他实施方案中，突出端NN不衍生自目标多核苷酸序列，例如其中引导链中的3’-NN序列与目标多核苷酸的5’-[NN]序列不互补，且过客链的5’-NN序列可以包含与目标多核苷酸序列的5’-[NN]序列不同的序列。在另外的实施方案中，任何NN核苷酸是化学修饰的，例如如2’-0_甲基、2’-脱氧-2’-氟和或本文的其他修饰。此外，过客链可以包含过客链的核糖核苷酸位置V。对于显示的代表性19碱基对21聚体双链体，位置W可以是在来自过客链的3’末端中的9个核苷酸。然而，在具有不同长度的双链体中，位置V基于引导链的5末端进行确定，其通过从引导链的5末端计数11个核苷酸位置且挑选过客链中相应的碱基配对核苷酸实现。通过Ag〇2的切割在如箭标指出的位置10和11之间发生。在另外的实施方案中，在基于引导链的5’-末端的位置10和11处存在2个核糖核苷酸，層，其通过从引导链的5’-末端计数10和11个核苷酸位置且挑选过客链中相应的碱基配对核苷酸实现。[0086]图5显示了不同稳定化学物（1-10的非限制性实例，所述稳定化学物可以例如用于稳定本发明的SiNA序列的5’和或3’-末端，包括1[3-3’]_反向脱氧核糖；（2脱氧核糖核苷酸；⑶[5’-3’]-3’-脱氧核糖核苷酸；⑷[5’-3’]-核糖核苷酸；（5[5’-3’]-3’-0-甲基核糖核苷酸；⑹3’-甘油基；（7[3’-5’]-3’-脱氧核糖核苷酸；（8[3’-3’]-脱氧核糖核苷酸；⑼[5’-2’]-脱氧核糖核苷酸;和（10[5-3’]_二脱氧核糖核苷酸（当X=0。除了该图中指出的修饰的和未修饰的主链化学物外，这些化学物可以与如本文所描述的不同糖和碱基核苷酸修饰组合。[0087]图6显示了用于鉴定本发明化学修饰的SiNA构建体的策略的非限制性实例，所述SiNA构建体是核酸酶抗性的同时保留介导RNAi活性的能力。基于教导的设计参数将化学修饰引入siNA构建体内（例如，引入2’-修饰、碱基修饰、主链修饰、末端帽修饰等）。修饰的构建体在合适的系统中进行测试例如，关于核酸酶抗性的人血清，显示的，或关于PK递送参数的动物模型）。平行地，siNA构建体就RNAi活性例如在细胞培养系统例如萤光素酶报道分子测定和或针对内源mRNA中进行测试。随后鉴定具有特定特征同时维持RNAi活性的引导SiNA构建体，且其可以再次进行进一步修饰和测定。相同方法可以用于鉴定具有改善的药物代谢动力学特征、递送和RNAi活性的siNA-缀合物分子。[0088]图7显示了本发明的磷酸化siNA分子的非限制性实例，包括线性和双链体构建体及其不对称的衍生物。[0089]图8显示了本发明的化学修饰的末端磷酸酯基团的非限制性实例。[0090]图9显示了胆固醇连接的亚磷酰胺的非限制性实例，其可以用于合成本发明的胆固醇缀合的siNA分子。显示了具有与siNA分子的有义链5’-末端连接的胆固醇部分的实例。[0091]图10描述了与核酸链连接的5’和3’反向脱碱基帽的实施方案。[0092]发明详述[0093]A.术语和定义[0094]下述术语和定义如在本申请中使用的应用。[0095]如本文所使用的，术语“脱碱基”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指在糖部分的Γ位置处缺乏核碱基nucleobase或具有氢原子⑹或其他非核碱基化学基团代替核碱基的糖部分，参见例如Adamic等人，美国专利号5，998，203。在一个实施方案中，本发明的脱碱基部分是核糖、脱氧核糖或双脱氧核糖。[0096]如本文所使用的，术语“无环核苷酸”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指具有无环核糖的任何核苷酸，例如其中核糖碳碳或碳氧键中任何一个独立地或组合地在核苷酸中不存在。[0097]如本文所使用的，术语“烷基”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指饱和或未饱和烃，包括直链、支链、烯基、炔基基团和环状基团，但排除芳族基团。尽管如此，烷基还指非芳族杂环基团。优选地，烷基具有1个-12个碳。更优选地，它是1个-7个碳的低级烷基，更优选地1个-4个碳。烷基可以是取代或未取代的。当取代时，一个或多个取代基团优选是羟基、卤素、氰基、Cl-C4烷氧基、=0、=S、N02、SH、NH2或NR1R2,其中RjPR2独立地是H或C1-C4烷基。[0098]短语“干扰细胞周期检查点的试剂”是指抑制转导细胞周期检查点信号的蛋白激酶，并从而使癌细胞对DNA损伤剂敏感的化合物。[0099]短语“干扰受体酪氨酸激酶RTK的试剂”是指抑制RTK并因此抑制参与肿瘤发生和肿瘤进展的机制的化合物。[0100]短语“雄激素受体调节剂”是指无论机制而干扰或抑制雄激素与受体的结合的化合物。[0101]短语“血管生成抑制剂”是指无论机制而抑制新血管形成的化合物。[0102]如本文所使用的，术语“芳基”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指芳族基团，其具有含共辄π电子系统的至少一个环且包括碳环芳基、杂环芳基和联芳基，所有这些可以是任选取代的。芳基的一种或多种优选取代基是卤素、三卤甲基、羟基、SH、0H、氰基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、NH2和NR1R2基团，其中RjPR2独立地是H或C1-C4烷基。[0103]如本文所使用的，术语“烷芳基”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指与芳基如上所述共价连接的烷基如上所述）。碳环芳基是其中芳族环上的环原子都是碳原子的基团。碳原子是任选取代的。杂环芳基是在芳族环中具有1个-3个杂原子作为环原子的基团，且剩余环原子是碳原子。合适的杂原子包括氧、硫和氮，且具有此类杂原子的杂环芳基的实例包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低级烷基吡咯并、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等，全部任选取代。优选地，烷基基团是Cl-C4烷基基团。[0104]如本文所使用的，术语“酰胺”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指-C⑼-NH-R，其中R是烷基、芳基、烷芳基或氢。[0105]如本文所使用的，短语“反义区”是指其如本领域一般接受的意义。关于本发明的示例性核酸分子，该术语是指与目标核酸序列具有互补性的SiNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的反义区可以任选包含与siNA分子的有义区具有互补性的核酸序列。在一个实施方案中，siNA分子的反义区称为反义链或引导链。[0106]短语“不对称发夹”指包含反义区、可以包含核苷酸或非核苷酸的环部分、和有义区的线性siNA分子，所述有义区包含比反义区更少的核苷酸，其程度为有义区具有足够的互补核苷酸以与反义区碱基配对且形成具有环的双链体。例如，本发明的不对称的发夹siNA分子可以包含具有足够的长度以在细胞或体外系统中介导RNAi的反义区（例如约15个-约30个，或约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸和包含约4个-约12个例如，约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个核苷酸的环区域、和具有与反义区互补的约3个-约25个例如，约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸的有义区。不对称的发夹siNA分子还可以包含5’-末端磷酸酯基团，其可以是化学修饰的。不对称的发夹siNA分子的环部分可以包含如本文所描述的核苷酸、非核苷酸、接头分子或缀合分子。[0107]如本文所使用的，术语“生物可降解的”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指生物系统中的降解，例如酶促降解或化学降解。[0108]如本文所使用的，术语“生物可降解的接头”是指其如本领域一般接受的意义。关于本发明的示例性核酸分子，该术语是指接头分子，其被设计为使一种分子与另一种分子连接，其易受生物系统的降解。该接头可以是基于核酸或非核酸的接头。例如，可以用生物可降解的接头将配体或生物活性的分子与本发明的siNA分子连接。可替代地，生物可降解的接头可用于连接本发明的siNA分子的有义和反义链。生物可降解的接头被这样设计，使得它的稳定性可以就特定目的进行调节，例如递送给特定组织或细胞类型。基于核酸的生物可降解的接头分子的稳定性可以通过使用各种化学物进行调节，例如核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和化学修饰的核苷酸的组合，所述化学修饰的核苷酸例如2’-0-甲基、2氟、2氨基、2’-0-氨基、2’-C-烯丙基、2’-0-烯丙基、和其他2修饰的或碱基修饰的核苷酸。生物可降解的核酸接头分子可以是二聚物、三聚物、四聚物或更长的核酸分子，例如长度为约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸的寡核苷酸，或可以包含具有基于磷的键例如氨基磷酸酯或磷酸二酯键的单个核苷酸。生物可降解的核酸接头分子还可以包含核酸主链、核酸糖、或核酸碱基修饰。[0109]如本文所使用的，短语“生物活性分子”是指其如本领域一般接受的意义。关于本发明的示例性核酸分子，该术语是指能够引起或修饰系统中的生物反应和或能够调节其他生物活性分子的药代动力学和或药效动力学的化合物或分子。生物活性分子包括单独的siNA分子或siNA分子与其他分子的组合，所述其他分子包括但不限于治疗活性分子，例如抗体、胆固醇、激素、抗病毒剂、肽、蛋白质、化疗剂、小分子、维生素、辅因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶核酸、反义核酸、三链体形成寡核苷酸、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、其他聚醚、2-5A嵌合体、siNA、dsRNA、同种异型酶、适配体、诱饵及其类似物。[0110]如本文所使用的，短语“生物系统”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指来自生物源的纯化或未纯化形式的材料，所述生物源包括但不限于人或动物，其中所述系统包含对RNAi活性所需的组分。因此，该短语包括例如，细胞、组织、受试者或生物、或其提取物。该术语还包括可以由生物来源重构的材料。[0111]如本文所使用的，短语“平末端”是指其如本领域一般接受的意义。关于本发明的示例性核酸分子，该术语是指不具有突出端核苷酸的双链SiNA分子的末端。例如，具有平末端的双链SiNA分子的两条链彼此比对，在末端具有匹配的碱基对，而不具有突出端核苷酸。本发明的siNA双链体分子在双链体的一个或两个末端如位于双链体的反义链5’-末端的末端，双链体的有义链5末端的末端，或双链体的反义链和有义链5末端的末端可以包含平末端。[0112]如本文所使用的，在本文也被称为“末端帽”的术语“帽”是指其如本领域一般接受的意义。关于本发明的示例性核酸分子，该术语是指部分，所述部分可以是可以被引入在一种或多种本发明的核酸分子的一个或多个末端的化学修饰的核苷酸或非核苷酸。这些末端修饰保护核酸分子不受外切核酸酶降解，且可以帮助在细胞内的递送和或定位。帽可以存在于5’-末端处5’_帽）或3’-末端处3’_帽），或可以存在于本发明的任何核酸分子的2个末端上。帽可以存在于本发明的核酸分子的有义链的5末端、3’-末端和或5和3’-末端。此外，帽可以任选地存在于本发明的核酸分子的反义链的3’-末端。在非限制性实例中，5’_帽包括但不限于，LNA;甘油基；反向脱氧脱碱基残基（部分）；4’，5’_亚甲基核苷酸；1-Φ-D-呋喃型赤藓糖基核苷酸，4’-硫代核苷酸;碳环核苷酸；1，5_失水己糖醇核苷酸;L-核苷酸;α-核苷酸;修饰的碱基核苷酸;二硫代磷酸酯键;苏糖型-呋喃型戊糖基核苷酸;无环3’，4断裂核苷酸;无环3，4-二羟丁基核苷酸;无环3，5-二羟戊基核苷酸;3’-3反向核苷酸部分;3’-3’_反向脱碱基部分;3’-2’_反向核苷酸部分;3’-2’_反向脱碱基部分；1，4_丁二醇磷酸酯;3氨基磷酸酯;己基磷酸酯;氨己基磷酸酯;3磷酸酯;3硫代磷酸酯;二硫代磷酸酯；或桥连或非桥连甲基膦酸酯部分。3’-帽的非限制性实例包括但不限于，LNA;甘油基；反向脱氧脱碱基残基部分）；4’，5’-亚甲基核苷酸；1-β-D-呋喃型赤藓糖基）核苷酸，4硫代核苷酸;碳环核苷酸;5氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯;3-氨丙基磷酸酯;6-氨己基磷酸酯；1，2-氨基十二烷基磷酸酯;羟丙基磷酸酯；1，5-失水己糖醇核苷酸;L-核苷酸;α-核苷酸;修饰的碱基核苷酸;二硫代磷酸酯;苏糖型-呋喃型戊糖基核苷酸;无环3’，4断裂核苷酸;3，4-二羟丁基核苷酸;3，5-二羟戊基核苷酸;5’-5反向核苷酸部分;5’-5’_反向脱碱基部分;5’-氨基磷酸酯;5’-硫代磷酸酯；1，4_丁二醇磷酸酯;5’-氨基;桥连或非桥连5氨基磷酸酯;硫代磷酸酯和或二硫代磷酸酯;桥连或非桥连甲基膦酸酯；和5疏基部分关于更多细节参见Beaucage和Iyer，1993，Tetrahecimn49,1925;通过引用并入本文）。图5显示了各种帽的一些非限制性实例。[0113]如本文所使用的，术语“细胞”是指其如本领域一般接受的意义。关于本发明的示例性核酸分子，该术语用于其通常的生物学意义上，并且不指完整多细胞生物，例如具体地不指人类。细胞可以存在于生物内，例如鸟类、植物和哺乳动物，例如人、牛、羊、猿、猴、猪、狗和猫。细胞可以是原核的（例如，细菌细胞或真核的（例如，哺乳动物或植物细胞）。细胞可以是体细胞或种系来源的、全能或多能的、分裂或非分裂的。细胞还可以衍生自或可以包含配子或胚胎、干细胞、或完全分化的细胞。[0114]如本文所使用的，短语“化学修饰”是指其如本领域一般接受的意义。关于本发明的示例性核酸分子，该术语指一般与天然SiRNA或RNA的核苷酸不同的核苷酸的化学结构的任何修饰。术语“化学修饰”包含在糖、碱基或核苷酸间键上的天然siRNA或RNA如本文所描述的或如本领域其他方面已知的添加、取代或修饰。在某些实施方案中，术语“化学修饰”可以是指在某些生物系统中天然存在的RNA的某些形式，例如2’-0_甲基修饰或肌苷修饰。[0115]如本文所使用的，术语“互补性”或“互补的”是指其如本领域一般接受的意义。关于本发明的示例性核酸分子，该术语一般是指通过传统沃森-克里克或如本文所述的其他非常规类型的键合在一种核酸序列和另一种核酸序列之间形成或存在一个或多个氢键。提及本发明的核酸分子，关于核酸分子与其互补序列的结合自由能足以允许核酸的相关功能得以进行，例如RNAi活性。关于核酸分子的结合自由能的测定是本领域众所周知的（参见，例如，Turner等人，1987，CS7分即·0ua_nt.Bioi.LII第123-133页；Frier等人，1986，_Proc.iVat.Acad.Sci.USA83:9373-9377;Turner等人，1987，.Soc.109:3783-3785。完全互补意指核酸序列的所有邻接残基将与第二种核酸序列中相同数量的邻接残基氢键合。部分互补性可以包括在核酸分子内的各种错配或非碱基配对的核苷酸例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多错配，非核苷酸接头或非碱基配对的核苷酸），其可以导致在核酸分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间或在核酸分子的反义链或反义区和相应的目标核酸分子之间产生的凸起、环或突出端。这种部分互补性可以通过由根据涉及的核苷酸的总数的非碱基配对的核苷酸的数量测定的%互补性来代表，即，约50%、60%、70%、80%、90%等。此类部分互补性允许的程度是，核酸分子例如，siNA保持其功能，例如介导序列特异性RNAi的能力。[0116]如本文所使用的，术语“组合物”或“制剂”是指其如本领域一般接受的意义。这些术语一般是指以适合于施用，例如全身或局部施用到细胞或受试者内的形式的组合物或制剂如在药学上可接受的载体或稀释剂中，所述受试者包括例如人。合适的形式部分取决于用途或进入途径，例如经口、经皮、吸入或通过注射。此类形式不应阻止组合物或制剂达到目标细胞即，需要给其递送带负电荷核酸的细胞）。例如，注射到血流内的组合物应当是可溶的。其他因素是本领域已知的，且包括考虑，如阻止组合物或制剂发挥其作用的毒性和形式。如本文所使用的，药物制剂包括用于人和兽医学用途的制剂。适合于与本发明的核酸分子一起配制的试剂的非限制性实例包括:脂质纳米颗粒（参见例如Semple等人，2010，iVatSioteciMoJ.，Feb;282:172-6.;P-糖蛋白抑制剂（例如PluronicP85;生物可降解聚合物，例如用于持续释放递送的DL-丙交酯-乙交酯共聚物微球体Emerich，DF等人，1999，CeHTranspJani，8,47-58;和装载的纳米颗粒，例如由聚丁基氰基丙稀酸酯制成的那些。关于本发明的核酸分子的递送策略的其他非限制性实例包括在下述参考文献中描述的材料:Boado等人，1998，.Sci.，87，1308-1315;Tyler等人，1999，^：β5Lett.，421，280-284;Pardridge等人，1995.，92，5592-5596;Boado，1995Jdv.价收iteJiveiy15,73-107;Aldrian-Herrada等人，1998，iVucieicAcidsi?es.，26,491〇-4916;和Tyler等人，1999，PM4Si4.，96，7053-7058。“药学上可接受的组合物”或“药学上可接受的制剂”可以是指允许本发明的核酸分子在最适合于其所需活性的物理位置中有效分布的组合物或制剂。[0117]短语“细胞毒性剂细胞抑制剂”是指，主要通过直接干扰细胞功能或抑制或干扰细胞减数分裂myosis而引起细胞死亡或抑制细胞增殖的化合物，包括烷化剂、肿瘤坏死因子、插入剂、低氧活化的化合物hypoxiaactivatablecompounds、微管抑制剂微管稳定剂、有丝分裂驱动蛋白的抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、参与有丝分裂进程中的激酶的抑制剂、抗代谢物;生物应答调节剂;激素抗激素治疗剂、造血生长因子、单克隆抗体靶向治疗剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、和泛素连接酶抑制剂。[0118]短语“雌激素受体调节剂”是指无论机制而干扰或抑制雌激素与受体的结合的化合物。[0119]如本文所使用的，术语“基因”或“目标基因”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指包含对于多肽生产必需的部分长度或整个长度的编码序列的核酸例如DNA或RNA序列。目标基因也可以包括核酸序列的UTR或非编码区域。基因或目标基因还可以编码功能RNAtfRNA或非编码RNAncRNA，例如小时序RNAStRNA、微小RNAmiRNA、小核RNAsnRNA、短干扰RNAsiRNA、核仁小RNAsnRNA、核糖体RNArRNA、转移RNAtRNA及其前体RNA。此类非编码RNA可以充当在调节参与功能或调节性细胞过程的fRNA或ncRNA活性中SiNA介导的RNA干扰的目标核酸分子。导致疾病的异常fRNA或ncRNA活性因此可以通过本发明的siNA分子进行调节。革El向fRNA和ncRNA的siNA分子也可以用于操作或改变受试者、生物或细胞的基因型或表型，其通过干预细胞过程例如遗传印记、转录、翻译或核酸加工例如，转氨基作用、甲基化等实现。目标基因可以是衍生自细胞、内源基因、转基因或外源基因的基因，所述外源基因例如在其感染后存在于细胞中的病原体例如病毒的基因。包含目标基因的细胞可以衍生自或包含在任何生物中，例如植物、动物、原生动物、病毒、细菌或真菌。植物的非限制性实例包括单子叶植物、双子叶植物或裸子植物。动物的非限制性实例包括脊椎动物或无脊椎动物。真菌的非限制性实例包括霉菌或酵母。关于综述，参见例如Snyder和Gerstein，2003,Sciance，300,258-260。[0120]短语“HMG-CoA还原酶抑制剂”是指3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶的抑制剂。如本文所使用的，术语HMG-CoA还原酶抑制剂包括具有HMG-CoA还原酶抑制活性的化合物的所有药学上可接受的内酯和开放酸open-acid形式（S卩，其中内酯环打开形成游离酸）以及盐和酯形式，并且因此此类盐、酯、开放酸和内酯形式的应用包括在本发明的范围内。[0121]术语“HBV”是指乙型肝炎病毒，其基因编码HBV蛋白、HBV肽、HBV多肽、HBV调节性多核苷酸例如，HBVmiRNA和siNA、突变型HBV基因和HBV基因的剪接变体，以及参与HBV基因表达和或活性的途径的其他基因。因此，本文就术语“HBV”而言描述的每个实施方案可应用于由术语“HBV”涵盖的所有蛋白质、肽、多肽和或多核苷酸分子，如该术语在本文中定义的。总之，此类基因目标在本文中一般也称为“目标”序列包括表Ia中所列的目标序列）。[0122]短语“高度保守的序列区域”是指在一代与其他代之间或一个生物系统与其他生物系统之间不显著变化的目标基因中的一个或多个区域的核苷酸序列。[0123]如本文所使用的，术语“同源序列”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指由一个或多个多核苷酸序列例如基因、基因转录物和或非编码多核苷酸共享的核苷酸序列。例如，同源序列可以是由编码相关但不同的蛋白质的2个或更多基因共享的核苷酸序列，例如基因家族的不同成员，不同的蛋白质表位，不同的蛋白质同种型或完全趋异的基因。同源序列可以是由2种或更多非编码多核苷酸共享的核苷酸序列，例如非编码DNA或RNA、调节序列、内含子、和转录控制或调节位点。同源序列还可以包括由超过一种多核苷酸序列共享的序列区。同源性无需是完全同一性例如，100%的，因为部分同源的序列也由本发明预期且在本发明的范围内（例如，至少95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%等）。同一性百分比是2个序列之间的匹配核苷酸数量除以待比较的总长乘以100。[0124]短语“改善的RNAi活性”是指在体外和或体内测量的RNAi活性的增加，其中RNAi活性是SiNA介导RNAi的能力和本发明SiNA的稳定性的反映。在本发明中，与全RNASiNA或包含多个核糖核苷酸的siNA相比较，这些活性的产物可以在体外和或体内得到增加。在一些情况下，SiNA分子的活性或稳定性可以是减少的（S卩，小于10倍），但SiNA分子的总体活性在体外和或体内得到增强。[0125]如本文所使用的，术语“抑制”、“下调”或“降低”是指其如本领域一般接受的意义。关于本发明的示例性核酸分子，该术语一般指基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性中的降低，低于在不存在本发明的核酸分子例如，siNA的情况下观察到的那种。下调还可以与转录后沉默相关，例如RNAi介导的切割或通过DNA甲基化模式或DNA染色质结构中的改变。由siNA分子的抑制、下调或降低可以提及无活性分子、减弱的分子、具有杂乱序列的SiNA分子或具有错配的siNA分子，或可替代地，它可以提及在不存在核酸的情况下的系统。[0126]短语“细胞增殖和生存信号转递通路的抑制剂”是指抑制细胞表面受体和那些表面受体下游的信号转导级联的试剂。[0127]术语“亲和素阻滞剂”是指可以选择性拮抗、抑制或抵抗生理学配体与亲和素的结合的化合物、选择性拮抗、抑制或抵抗生理学配体与知，亲和素的结合的化合物、拮抗、抑制或对抗生理学配体与¾¾亲和素和咏_亲和素的结合的化合物、以及拮抗、抑制或抵抗在毛细管内皮细胞中表达的一种或多种特定亲和素活性的化合物。该术语还涉及…和蛛雜亲和素的诘抗剂。该术语还表示知和、WOVpu和亲和素任何组合的拮抗剂。[0128]如本文所使用的，术语“间歇的”或“间歇地”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般是指以规则或不规则的间隔定期地停止和开始。[0129]术语“核苷间键”或“核苷间接头”或“核苷酸间键”或“核苷酸间接头”在本文互换使用，是指在本领域中已知的两个核苷单位之间的任何接头或键，包括，例如但不限于，磷酸酯键、磷酸酯类似键、膦酸酯键、胍键、羟胺键、肼基键、酰胺键、氨基甲酸酯键、烷基键和取代的烷基键。核苷间键构成核酸分子的主链。[0130]如本文所使用的，术语“哺乳动物的”或“哺乳动物”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指任何温血脊椎动物物种，例如人、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠、兔、家畜等。[0131]短语“定量吸入器”或MDI是指包括罐、覆盖罐的安全盖和位于盖中的制剂计量阀门的单元。MDI系统包括合适的开槽装置。合适开槽装置包括例如阀门传动装置和圆筒状或圆锥样通道，通过其药物可以从填满的滤毒罐经由计量阀门递送至患者的鼻或口例如口状物传动装置。[0132]如本文所使用的，术语“微小RNA”或“miRNA”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指通过mRNA切割、翻译阻抑抑制或异染色质沉默调节目标信使RNA的表达的小双链RNA参见例如Ambros，2004,Nature，431，350-355;Bartel，2004，Cell，116,281-297;Cullen，2004，VirusResearch.，102,3_9;He等人，2004，Nat.Rev.Genet.，5,522_531;Ying等人，2004，Gene，342，25-28;和Sethupathy等人，2006，RNA，12:192-197。[0133]如本文所使用的，术语“调节”是指其如本领域一般接受的意义。关于本发明的示例性核酸分子，该术语一般是指当基因表达、或一种或多种RNA分子编码或非编码）的水平、或一种或多种RNA分子或蛋白质或蛋白质亚基的活性得到上调或下调，从而使得表达、水平或活性大于或小于在不存在影响调节的分子的情况下观察到的那种。例如，在一些实施方案中，术语“调节”可以是指例如基因表达的抑制，在其他实施方案中，可以是指例如基因表达的增强作用或上调。[0134]如本文所使用的，短语“修饰的核苷酸”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般是指如本领域一般已知的在未修饰的（或天然核苷酸的碱基、糖和或磷酸酯的化学结构中包含修饰的核苷酸。修饰的核苷酸的非限制性实例在本文和美国申请号12064,014中描述。[0135]用于本文目的的短语“选择性0^-2抑制剂吧410”是指奶410，通过细胞或微粒体评价的C0X-2的IC50与C0X-1的IC50的比值测量，其具有至少100倍的抑制C0X-2比⑶X-I的特异性。[0136]短语“非碱基配对”是指核苷酸在双链SiNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间不是碱基配对的核苷酸;并且可以包括例如但不限于错配、突出端、单链环等。[0137]术语“非核苷酸”是指任何基团或化合物，其可以掺入核酸链内代替一个或多个核苷酸单位，例如包括但不仅限于脱碱基部分或烷基链。基团或化合物是“脱碱基”的，因为它不包含通常公认的核苷酸碱基，例如腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶，且因此缺乏在Γ位置处的核碱基。[0138]术语“核苷酸”一般如本领域公认地使用。核苷酸一般包括核碱基、糖和核苷间连接，例如，磷酸酯。碱基可以是天然碱基标准或如本领域众所周知的修饰的碱基或碱基类似物。此类碱基一般位于核苷酸糖部分的1’位置处。另外，核苷酸可以是未修饰的或在糖、核苷间键和或碱基部分处修饰的，（也可互换地称为核苷酸类似物，修饰的核苷酸，非天然核苷酸，非标准核苷酸和其他核苷酸;参见例如，美国申请号12064，014。[0139]如本文所使用的，术语“突出端”是指其如本领域一般接受的意义。关于本发明的示例性双链核酸分子，该术语一般指在双链核酸分子的2条链之间不是碱基配对的核苷酸序列的末端部分参见例如图4。突出端，当存在时，一般在SiNA双链体的一条或两条链的3’_末端处。[0140]如本文所使用的，术语“肠胃外”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般是指以除通过消化道外的方式施用分子、药物、试剂或化合物的方法或技术，并且包括表皮、皮下、血管内（例如静脉内）、肌内、或鞘内注射或输注技术等。[0141]短语“通路目标”是指参与基因表达或活性通路的任何目标。例如，任何给定目标都可以具有相关通路目标，其可以包括生物通路中的上游、下游或修饰基因。这些通路目标基因可以在本文的疾病、状况和性状治疗中提供累加或协同作用。[0142]术语“硫代磷酸酯”是指包含一个或多个硫原子代替氧原子的核苷酸间磷酸酯键。因此，术语硫代磷酸酯是指硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键。[0143]“异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂”是指抑制任何一种异戊二烯基-蛋白转移酶或任何异戊二烯基-蛋白转移酶的组合的化合物，所述酶包括法呢基-蛋白转移酶FPTase、I型香叶基香叶基-蛋白转移酶GGPTase-I、和II型香叶基香叶基-蛋白转移酶GGPTase-II，也被称为RabGGPTase〇[0144]术语“维甲酸受体调节剂”是指无论机制而干扰或抑制维甲酸与受体的结合的化合物。[0145]如本文所使用的，术语“核糖核苷酸”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指在β-D-呋喃核糖部分的2’位置处具有羟基的核苷酸。[0146]如本文所使用的，术语“RNA”是指其如本领域一般接受的意义。通常，术语RNA是指包含至少一种呋喃核糖核苷ribofuranoside部分的分子。该术语可以包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA、以及通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和或改变而不同于天然存在的RNA的改变的RNA。此类改变可以包括添加非核苷酸物质，例如向siNA的一个或多个末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。本发明的RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为类似物或天然存在的RNA的类似物。[0147]短语“RNA干扰”或术语“RNAi”是指如本领域一般已知的且由短干扰核酸分子介导的抑制或下调细胞中的基因表达的生物过程，参见例如Zamore和Haley，2005,Science，309，1519-1524;Vaughn和Martienssen，2005，Science，309，1525-1526;Zamore等人，2000，CeH，101，25-33;Bass，2001，jVaiure，411，428-429;Elbashir等人，2001，jVaiure，411，494-498;和Kreutzer等人，国际PCT公开号TO0044895;Zernicka_Goetz等人，国际PCT公开号TO0136646;Fire，国际PCT公开号TO9932619;Plaetinck等人，国际PCT公开号WO0001846;Mello和Fire，国际PCT公开号TO0129058;Deschamps-Depaillette，国际PCT公开号WO9907409;和Li等人，国际PCT公开号WO0044914;Allshire，2002,Science，297，1818-1819;Volpe等人，2002,Science,297,1833-1837;Jenuwein，2002，Sciance，297，2215-2218;和Hall等人，2002,Science，297,2232-2237;Hutvagner和Zamore，2002，Sciance，297，2056-60;McManus等人，2002，i?應，8，842_850;Reinhart等人，2002，Gane，16,1616-1626;和ReinhartBartel，2002，Science，297，1831。此外，术语RNAi意在等价于用于描述序列特异性RNA干扰的其他术语，例如转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或表观遗传学epigenetics。例如，本发明的siNA分子可以用于在转录后水平或转录前水平上表观遗传地沉默基因。在非限制性实例中，基因表达通过本发明的siNA分子的表观遗传调节可以起因于siNA介导的染色质结构的修饰或甲基化模式以改变基因表达（参见，例如，Verdel等人，2004，1_印。6,303,672-676;卩31-81^1抑等人，2004，1_印。6,303，669-672;Allshire，2002,Science,297,1818-1819;Volpe等人，2002，1_如。6,297，1833_1837;Jenuwein，2002,Science,297,2215-2218;和Hall等人，2002,Science,297,2232-2237。在另一个非限制性实例中，如本领域已知的，基因表达通过本发明的siNA分子的调节可以起因于经由RISC的siNA介导的RNA编码或非编码RNA切割，或经由翻译抑制，或调节可以起因于转录抑制参见例如Janowski等人，2005，iYatureCfteffiicaJBioJogy，1，216_222〇[0148]短语“RNAi抑制剂”是指可以在细胞或生物中下调、降低或抑制RNA干扰功能或活性的任何分子。RNAi抑制剂可以下调、降低或抑制RNAi例如RNAi介导的目标多核苷酸的切害J、翻译抑制或转录沉默），其通过与RNAi通路的任何组分相互作用或干扰RNAi通路的任何组分的功能实现，所述组分包括蛋白质组分例如RISC、或核酸组分例如miRNA或siRNAANAi抑制剂可以是siNA分子、反义分子、适配体，或者与RISC、miRNA、或siRNA或细胞或生物中的RNAi通路的任何其他组分相互作用、或干扰RISC、miRNA、或siRNA或细胞或生物中的RNAi通路的任何其他组分的功能的小分子。通过抑制RNAi例如RNAi介导的目标多核苷酸的切割、翻译抑制或转录沉默），本发明的RNAi抑制剂可以用于调节（例如上调或下调）目标基因的表达。[0149]如本文所使用的，短语“有义区”是指其如本领域一般接受的意义。关于本发明的示例性核酸分子，该术语是指与SiNA分子的反义区具有互补性的SiNA分子的核苷酸序列。此外，SiNA分子的有义区可以包含与目标核酸序列具有同源性或序列同一性的核酸序列。在一个实施方案中，siNA分子的有义区也被称为有义链或过客链（thepassengerstrand〇[0150]短语“短干扰核酸”、“siNA”、“短干扰RNA”、“siRNA”、“短干扰核酸分子”、“短干扰寡核苷酸分子”或“化学修饰的短干扰核酸分子”是指能够通过介导RNA干扰（“RNAi”）或基因沉默以序列特异性方式抑制或下调基因表达或病毒复制的任何核酸分子。这些术语可以是指个别核酸分子、多个此类核酸分子、或此类核酸分子的合并物。SiNA可以是包含自我互补的有义和反义链的双链核酸分子，其中所述反义链包含与目标核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义链包含对应于目标核酸序列或其部分的核苷酸序列。SiNA可以是具有双链体、不对称的双链体、发夹或不对称的发夹二级结构、具有自我互补的有义和反义区的多核苷酸，其中所述反义区包含与分开的目标核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义区包含对应于目标核酸序列或其部分的核苷酸序列。SiNA可以是具有2个或更多环结构和包含自我互补的有义和反义区的茎的环状单链多核苷酸，其中所述反义区包含与目标核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义区包含对应于目标核酸序列或其部分的核苷酸序列，且其中环状多核苷酸可以在体内或体外进行加工以产生能够介导RNAi的活性SiNA分子。SiNA还可以包含具有与目标核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列的单链多核苷酸例如，其中此类SiNA分子不需要在SiNA分子内存在对应于目标核酸序列或其部分的核苷酸序列），其中所述单链多核苷酸可以进一步包含末端磷酸酯基团，例如5’-磷酸酯（参见例如Martinez等人，2002，CeW.，110,563-574和Schwarz等人，2002JfoJecuJarCeh，10,537-568或5’，3’-二磷酸酯。[0151]如本文所使用的，短语“受试者”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指本发明的核酸分子可以施用于其的生物。受试者可以是哺乳动物或哺乳动物细胞，包括人或人细胞。该术语还指其是外植细胞的供体或受体或细胞自身的生物。[0152]如本文所使用的，短语“全身施用”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指药物在血流中的体内全身性吸收或积累随后分布遍及整个身体。[0153]当其是指HBV时，术语“目标”是指任何HBV目标蛋白、肽或多肽，如表7中显示的Genbank登记号编码的。该术语还指编码任何目标蛋白、肽或多肽的核酸序列或目标多核苷酸序列，例如由具有表7中显示的Genbank登记号的序列编码的蛋白质、肽或多肽。目的目标可以包括目标多核苷酸序列，例如目标DNA或目标RNA。术语“目标”还意在包括其他序列，例如相异同种型、突变目标基因、目标多核苷酸的剪接变体、目标多态性和非编码（例如，ncRNA、miRNA、stRNA、sRNA或如本文所描述的其他调节多核苷酸序列。[0154]如本文所使用的，短语“目标位点”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般是指目标核酸分子例如，RNA内的序列，例如对于SiNA构建体所述SiNA构建体在其反义区域中包含与目标序列互补的序列介导的切割，所述序列被“靶向”。[0155]如本文所使用的，短语“治疗有效量”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般指由研究者、兽医、医学博士或其他临床医生寻求的，将引发细胞、组织、系统、动物或人的生物学或医学应答的化合物或组合物的量。例如，如果当与疾病或病症相关的可测量参数有至少25%的降低时给定的临床治疗被认为是有效的，那么用于治疗该疾病或病症的药物的治疗有效量是影响该参数的至少25%的降低所需的量。[0156]如本文所使用的，短语“通用碱基”是指其如本领域一般接受的意义。术语通用碱基一般指与每个天然DNARNA碱基形成碱基对的核苷酸碱基类似物，而在它们之间只有很少区别或没有区别。通用碱基的非限制性实例包括C-苯基、C-萘基和其他芳族衍生物、肌苷、唑甲酰胺和硝基唑衍生物例如如本领域已知的3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚（参见例如Loakes，2001，jVucieicXcidsi?esearch，29,2437-2447。[0157]如本文所使用的，术语“上调”是指其如本领域一般接受的意义。关于本发明的示例性核酸分子，该术语指基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平、或一种或多种RNA、蛋白质或蛋白质亚基的活性中的增加，高于在不存在本发明的核酸分子例如，siNA的情况下观察到的那种。在某些情况下，由SiNA分子上调或促进基因表达高于在无活性或减弱的分子的存在下观察到的那种水平。在其他情况下，由SiNA分子上调或促进基因表达高于在例如具有杂乱序列或具有错配的SiNA分子的存在下观察到的那种水平。在另外其他的情况下，由本发明的核酸分子上调或促进基因表达在核酸分子的存在下大于在不存在其的情况下。在一些情况下，基因表达的上调或促进与RNA介导的基因沉默抑制相关，例如RNAi介导的编码或非编码RNA目标的切割或沉默，其下调、抑制或沉默待上调的目的基因的表达。基因表达的下调可以例如由编码RNA或其编码的蛋白质进行诱导，例如通过负反馈或拮抗作用。基因表达的下调可以例如由对目的基因具有调节控制的非编码RNA进行诱导，例如通过经由翻译抑制、染色质结构、甲基化、RISC介导的RNA切割或翻译抑制而沉默基因表达。因此，下调、抑制或沉默目的基因的目标的抑制或下调可以用于上调目的基因朝向治疗用途表达。[0158]如本文所使用的，术语“载体”是指其如本领域一般接受的意义。术语载体一般指用于递送一种或多种核酸分子的任何基于核酸和或病毒的表达系统或技术。[0159]B.本发明的siNA分子[0160]本发明提供了包括靶向HBV的siNA的组合物和方法，所述siNA可以用于治疗疾病，例如与HBV表达相关的肝脏疾病或恶性肿瘤和或癌症，或者乙型肝炎感染导致的其他状况。在本发明的特定方面和实施方案中，本发明的核酸分子包括至少一个表Ia和表Ib中所示的序列中的15个核苷酸的序列。siNA可以以数种形式提供。例如，siNA可以作为一种或多种siNA化合物分离，或它可以是在DNA质粒中的转录盒的形式。siNA还可以是化学合成的或可以包括如例如但不限于表Ic和表8中所示的修饰。因此，在各个实施方案中，本发明的核酸的至少一条链或区域包含至少一个选自序列SEQIDNO:1-502的15个核苷酸的序列。siNA可以单独施用或与其他siNA分子或治疗HBV相关疾病或状况的常规药剂共同施用。[0161]本发明的siNA分子可以用于经由与RNA转录物相互作用或可替代地通过与特定基因序列相互作用而介导基因沉默，特定地HBV，其中此类相互作用导致在转录水平或转录后水平上的基因沉默的调节，例如但不限于用目标的核苷酸序列的RNAi或通过细胞过程，所述细胞过程调节目标的染色质结构或甲基化模式且阻止目标基因的转录，从而介导沉默。更特定地，目标是HBVRNA、DNA、或mRNA中的任何。[0162]在一个方面，本发明提供了在细胞或哺乳动物中抑制HBV基因表达的短干扰核酸siNA分子。siNA可以是单链的或双链的。当双链时，siNA包含有义链和反义链。反义链与HBV基因的表达中形成的mRNA的至少一部分互补。有义链包含与反义链互补的区域。在特定实施方案中，反义链包含至少一个表Ib中所述的反义序列的15个核苷酸的序列。通常，双链siNA包含至少一个表Ib中所述的有义链的15个核苷酸的序列和至少一个表Ib中所述的反义链的15个核苷酸的序列。本发明的siNA的一个或多个核苷酸是任选地修饰的。在具有修饰的进一步的实施方案中，本发明的一些siNA包含至少一个选自表Ic中提供的序列的核苷酸序列。在其他实施方案中，siNA包含至少两个选自表Ic中提供的序列的序列，其中所述至少两个序列之一与至少两个序列中的另一个是互补的，至少两个序列之一与HBV基因的表达中产生的mRNA的序列是互补的。本发明的某些修饰的siNA的实例如表Ic中所示。[0163]本发明的双链RNA分子可以包含2条不同且分离的链，其可以是对称或不对称的，并且是互补的，即2条单链RNA分子，或可以包含一个单链分子，其中2个互补部分例如有义区和反义区是碱基配对的，并且通过一个或多个单链“发夹”区域（即环共价连接，导致例如单链短发夹多核苷酸或环状单链多核苷酸。[0164]接头可以是多核苷酸接头或非核苷酸接头。在一些实施方案中，接头是非核苷酸接头。在一些实施方案中，本发明的发夹或环状siNA分子包含一个或多个环基序，其中siNA分子的至少一个环部分是生物可降解的。例如，这样设计本发明的单链发夹siNA分子，使得siNA分子的环部分在体内的降解可以生成具有3_’末端突出端的双链siNA分子，例如包含1个、2个、3个或4个核苷酸的3_’末端核苷酸突出端。或可替代地，这样设计本发明的环状siNA分子，使得siNA分子的环部分在体内的降解可以生成具有3_’末端突出端的双链siNA分子，例如包含约2个核苷酸的3-’末端核苷酸突出端。[0165]在本发明的对称siNA分子中，每条链，有义过客链和反义（引导链，独立地为约15个-约30个例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、或30个核苷酸长度。通常，本发明的对称siNA分子的每条链为约19个-24个S卩，约19个、20个、21个、22个、23个或24个核苷酸长度。[0166]在不对称siNA分子中，分子的反义区或链为约15个-约30个例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、或30个核苷酸长度，其中有义区为约3个-约25个例如约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸长度。通常，本发明的不对称siNA分子的每条链为约19个-24个（S卩，约19个、20个、21个、22个、23个或24个核苷酸长度。[0167]在另外其他的实施方案中，本发明的siNA分子包含单链发夹siNA分子，其中所述siNA分子为约25个-约70个例如约25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、40个、45个、50个、55个、60个、65个或70个核苷酸长度。[0168]在另外其他的实施方案中，本发明的SiNA分子包含单链环状SiNA分子，其中所述siNA分子为约38个-约70个例如约38个、40个、45个、50个、55个、60个、65个或70个核苷酸长度。[0169]在另外其他的实施方案中，本发明的SiNA分子包含单链非环状SiNA分子，其中所述siNA分子独立地为约15个-约30个例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸长度。[0170]在各种对称实施方案中，本发明的siNA双链体独立地包含约15-约30个例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、或30个碱基对。通常，本发明的siNA的双链体结构为15个-30个，更通常为18个-25个，还更通常为19个-24个，和最通常为19个-21个碱基对长度。[0171]在另外其他的实施方案中，其中本发明的双链体siNA分子是不对称的，所述siNA分子包含约3个-约25个例如约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个碱基对。通常，本发明的siNA的双链体结构为15个-25个，更通常为18个-25个，还更通常为19个-24个，和最通常为19个-21个碱基对长度。[0172]在另外其他的实施方案中，其中本发明的siNA分子是发夹或环状结构，所述siNA分子包含约15个-约30个例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个碱基对。[0173]本发明的siNA分子的有义链和反义链或有义区和反义区可以是互补的。此外，反义链或反义区可以与HBV目标RNA的核苷酸序列或其部分是互补的。siNA的有义链或有义区可以包含HBV基因或其部分的核苷酸序列。在某些实施方案中，本发明的siNA分子的有义区或有义链与siNA分子的反义区或反义链的该部分是互补的，所述反义区或反义链与HBV目标多核苷酸序列是互补的，例如但不限于表7中所示由GENBANK登记号表示的那些序列。[0174]在一些实施方案中，本发明的siNA分子在siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间具有完全互补性。在其他或相同实施方案中，本发明的siNA分子的反义链与相应目标核酸分子是完全互补的。[0175]在另外其他的实施方案中，本发明的siNA分子在siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区或在siNA分子的反义链或反义区和相应目标核酸分子之间具有部分互补性即，小于100%互补性）。因此，在一些实施方案中，本发明的双链核酸分子在一条链中具有与另一条链的核苷酸互补的约15个-约30个例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、或30个核苷酸。在其他实施方案中，分子在有义区中具有与双链核酸分子的反义区的核苷酸互补的约15个-约30个例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。在某些实施方案中，本发明的双链核酸分子在反义链中具有与其相应目标核酸分子的核苷酸序列互补的约15个-约30个例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。[0176]在其他实施方案中，siNA分子可以包含一个或多个核苷酸缺失、取代、错配和或添加;然而，条件是siNA分子维持其活性，例如以介导RNAi。在非限制性实例中，缺失、取代、错配和或添加可以导致环或凸起，或可替代地摆动或其他可替代（非沃森-克里克）碱基对。因此，在一些实施方案中，例如，本发明的双链核酸分子在一条链或一个区中具有与另一条链或另一个区错配或非碱基配对的1个或更多例如1个、2个、3个、4个、5个或6个核苷酸。在其他实施方案中，本发明的双链核酸分子在每条链或每个区中具有与另一条链或另一个区错配或非碱基配对的1个或更多（例如1个、2个、3个、4个、5个或6个核苷酸。在一个优选的实施方案中，本发明的SiNA包含不超过3个错配。如果SiNA的反义链包含与目标序列的错配，优选错配区域不位于互补区域的中心。[0177]在其他实施方案中，SiNA分子可以包含对于表Ib中的序列的一个或多个核苷酸缺失、取代、错配和或添加;然而，条件是SiNA分子维持其活性，例如以介导RNAi。在非限制性实例中，缺失、取代、错配和或添加可以导致环或凸起，或可替代地摆动或其他可替代非沃森-克里克碱基对。[0178]本发明还包含如上文其他地方描述的双链核酸siNA分子，其中第一条链和第二条链彼此互补，并且其中在高严格条件下，至少一条链可与表Ib中的序列的多核苷酸序列杂交，并且其中任何核苷酸是未修饰或化学修饰的。[0179]杂交技术是熟练技术人员众所周知的（参见例如，Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，N.Y.1989。优选严格杂交条件包括在包括下述的溶液中在4°C过夜孵育：50%甲酰胺、5xSSC150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠）、50mM磷酸钠（pH7·6、5χDenhardt’s溶液、10%硫酸葡聚糖和20微克ml变性剪切鲑精DNA;随后为在0.lxSSC中在约65°C洗涤滤膜。[0180]在一个特定实施方案中，第一条链具有与另一条链的核苷酸互补的约15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸，至少一条链可与表Ib中的多核苷酸序列杂交。在一个更优选的实施方案中，第一条链具有与另一条链的核苷酸互补的约15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸，并且在高严格条件下，至少一条链可与SEQIDNO:1、SEQIDN0:1210、SEQIDN0:2、SEQIDN0:1211、SEQIDN0:3、SEQIDN0:1212、SEQIDNO:4或SEQIDNO:1213杂交，并且其中任何核苷酸是未修饰或化学修饰的。[0181]在某些实施方案中，本发明的siNA分子包含约1个-约4个例如约1个、2个、3个或4个核苷酸的突出端。突出端中的核苷酸可以是相同或不同的核苷酸。在一些实施方案中，突出端在双链核酸分子的一条或两条链的3末端处出现。例如，本发明的双链核酸分子可以包含在双链核酸分子的反义链区的3’-末端、有义链区的3’-末端、或反义链区和有义链区处的核苷酸或非核苷酸突出端。[0182]在一些实施方案中，包含本发明siNA分子的突出端部分的核苷酸包含基于HBV目标多核苷酸序列的序列，其中包含本发明siNA分子的反义链区的突出端部分的核苷酸可以与HBV目标多核苷酸序列中的核苷酸互补，和或包含本发明siNA分子的有义链区的突出端部分的核苷酸可以包含在HBV目标多核苷酸序列中的核苷酸。因此，在一些实施方案中，突出端包含与HBV目标多核苷酸序列的部分互补的2个核苷酸的突出端。然而，在其他实施方案中，突出端包含与HBV目标多核苷酸序列的部分不互补的2个核苷酸的突出端。在某些实施方案中，突出端包含与HBV目标多核苷酸序列的部分不互补的3’-UU突出端。在其他实施方案中，突出端包含在反义链的3’末端处的UU突出端和在有义链的3’末端处的TT突出端。在其他实施方案中，突出端包含本文实施例、表格和附图中所述的核苷酸。[0183]在本文描述的具有3’-末端核苷酸突出端的SiNA分子的任何实施方案中，突出端在一个或多个核酸糖、碱基或主链位置处是任选化学修饰的。在本发明的双链核酸（siNA分子的突出端部分中修饰的核苷酸的代表性但非限制性实例包括2’-0_烷基例如2’-0_甲基）、2脱氧、2’-脱氧-2’-氣、2脱氧-2’-氣阿拉伯糖基FANA、4硫代、2’二氣甲基、2’-0_乙基-三氟甲氧基、2’-0_二氟甲氧基-乙氧基、通用碱基、无环或5-C-甲基核苷酸。在更优选的实施方案中，突出端核苷酸各自独立地是2’-0-烷基核苷酸、2’-0-甲基核苷酸、2脱氧-2氟核苷酸或2脱氧核糖核苷酸。在一些情况下，突出端核苷酸通过一个或多个硫代磷酸酯键连接。[0184]在另外其他的实施方案中，本发明的siNA分子包含具有平端的双链体核酸分子即不具有核苷酸突出端），其中2个末端都是平头的，或可替代地其中末端之一是平头的。在一些实施方案中，本发明的siNA分子可以包含一个平端，例如其中反义链的5’-末端和有义链的3’-末端不具有任何突出端核苷酸。在另一个实例中，siNA分子包含一个平端，例如其中反义链的3’-末端和有义链的5’-末端不具有任何突出端核苷酸。在其他实施方案中，本发明的siNA分子包含2个平端，例如其中反义链的3’-末端和有义链的5’-末端以及反义链的5末端和有义链的3末端不具有任何突出端核苷酸。[0185]在本发明的siNA分子的任何实施方案或方面中，有义链和或反义链可以在有义链和或反义链的3末端、5末端、或3’和5末端处进一步具有帽，例如本文描述或如本领域已知的。或者如在发夹siNA分子的情况下，帽可以在多核苷酸的末端核苷酸之一或两者处。在一些实施方案中，帽在双链siNA分子的有义链的一个或两个末端处。在其他实施方案中，帽在反义（引导链的3末端处。在优选实施方案中，帽在有义链的3末端和有义链的5’末端处。[0186]此类末端帽的代表性但非限制性实例包括反向脱碱基核苷酸、反向脱氧脱碱基核苷酸、反向核苷酸部分、图5中显示的基团、甘油基修饰、烷基或环烷基、杂环、或本领域熟知的任何其他帽。[0187]本发明的siNA分子的任何实施方案可以具有5’磷酸酯末端。在一些实施方案中，siNA分子缺乏末端磷酸酯。[0188]本发明的任何siNA分子或构建体可以包含一个或多个化学修饰。修饰可以用于改善体外或体内特征，例如稳定性、活性、毒性、免疫应答例如预防干扰素应答、炎症或促炎细胞因子应答或Toll样受体TlF应答的刺激和或生物利用度。[0189]申请人在本文中描述了与相应的未修饰的siNA分子相比具有改善的RNAi活性和或稳定性的化学修饰的siNA分子。本文公开的各种化学修饰的siNA基序提供了维持基本上类似于未修饰的或最低限度修饰的活性siNA的RNAi活性参见例如Elbashir等人，2001，EMBOJ.,20:6877-6888，同时提供适合于在治疗应用中使用的核酸酶抗性和药物代谢动力学性质的能力。[0190]在各个实施方案中，本发明的siNA分子包含修饰，其中有义和或反义链中存在的任何例如，一个或多个或所有核苷酸是修饰的核苷酸例如，其中一个核苷酸是修饰的，一些核苷酸（即，多个或多于一个是修饰的，或所有核苷酸都是修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本发明的siNA分子是被化学修饰部分修饰的例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个或59个核苷酸是修饰的）。在一些实施方案中，本发明的SiNA分子包含其为修饰的核苷酸的至少约8个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、32个、34个、36个、38个、40个、42个、44个、46个、48个、50个、52个、54个、56个、58个、或60个核苷酸。在其他实施方案中，本发明的siNA分子是被化学修饰完全修饰的（例如，100%修饰的），即siNA分子不包含任何核糖核苷酸。在一些实施方案中，本发明的SiNA分子的有义链中的一个或多个核苷酸是修饰的。在相同或其他实施方案中，本发明的siNA分子的反义链中的一个或多个核苷酸是修饰的。[0191]在单一siNA分子内的化学修饰可以是相同或不同的。在一些实施方案中，至少一条链具有至少一个化学修饰。在其他实施方案中，每条链具有至少一个化学修饰，这可以是相同或不同的，例如糖、碱基或主链（即，核苷酸间键修饰。在其他实施方案中，本发明的siNA分子包含至少2个、3个、4个、5个或更多不同的化学修饰。[0192]适合于在本发明中使用的化学修饰的非限制性实例公开于美国专利申请号10444,853;10981，966;12064,014和其中引用的参考文献中，并且包括糖、碱基和磷酸酯、非核苷酸修饰和或其任何组合。[0193]在本发明的某些特定实施方案中，至少一个修饰的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2烷基例如，2’-0_甲基核苷酸或锁定核酸LNA核苷酸，其是本领域公认的。[0194]在本发明另外其他的实施方案中，至少一个核苷酸具有核糖样、Northern或A形螺旋构型（参见例如，Saenger，PrinciplesofNucleicAcidStructure，Springer-Verlag编辑，1984。具有Northern构型的核苷酸的非限制性实例包括锁定核酸LNA核苷酸（例如，2’-0-，4’-C-亚甲基-D-呋喃核糖基）核苷酸）；2’-甲氧基乙氧基MOE核苷酸；2’-甲基-硫代-乙基核苷酸，2脱氧-2氟核苷酸;2脱氧-2氯核苷酸;2叠氮核苷酸;2’-〇-三氟甲基核苷酸；2’-0-乙基-三氟甲氧基核苷酸；2’-0-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸;4’-硫代核苷酸和2’-0-甲基核苷酸。[0195]在各种实施方案中，双链siNA分子中存在的大多数例如高于50%嘧啶核苷酸包含糖修饰。在一些相同和或其他实施方案中，双链siNA分子中存在的大多数（例如高于50%嘌呤核苷酸包含糖修饰。[0196]在一些实施方案中，反义链中的嘧啶核苷酸是2’-0-甲基或2脱氧-2氟嘧啶核苷酸，且反义链中存在的嘌呤核苷酸是2甲基核苷酸或2’-脱氧核苷酸。在其他实施方案中，有义链中存在的嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸，且有义链中存在的嘌呤核苷酸是2’-0-甲基或2脱氧嘌呤核苷酸。[0197]在本发明的某些实施方案中，有义链上的互补区中的所有嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’_氟嘧啶核苷酸。在某些实施方案中，反义链的互补区中的所有嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2氟嘧啶核苷酸。在某些实施方案中，有义链上的互补区中的所有嘌呤核苷酸是2脱氧嘌呤核苷酸。在某些实施方案中，反义链上的互补区中的所有嘌呤是2’-0_甲基嘌呤核苷酸。在某些实施方案中，有义链上的互补区中的所有嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸;反义链的互补区中的所有嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸;有义链上的互补区中的所有嘌呤核苷酸是2脱氧嘌呤核苷酸，并且反义链上的互补区中的所有嘌呤是2’-O-甲基嘌呤核苷酸。[0198]在一些实施方案中，在一条或两条链中的至少5个或更多的嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，在一条或两条链中的至少5个或更多的嘧啶核苷酸是2’-0-甲基嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，在一条或两条链中的至少5个或更多的嘌呤核苷酸是2’-脱氧-2’-氟嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，在一条或两条链中的至少5个或更多的嘌呤核苷酸是2’-0-甲基嘌呤核苷酸。[0199]在某些实施方案中，嘌呤和嘧啶在2’-糖位置处是差别修饰的（S卩，至少一个嘌呤具有与在相同或不同链中2’_糖位置上的至少一个嘧啶不同的修饰）。例如，在一些情况下，在一条或两条链中的至少5个或更多的嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸，并且在一条或两条链中的至少5个或更多的嘌呤核苷酸是2’-0-甲基嘌呤核苷酸。在其他情况下，在一条或两条链中的至少5个或更多的嘧啶核苷酸是2’-0-甲基嘧啶核苷酸，并且在一条或两条链中的至少5个或更多的嘌呤核苷酸是2’-脱氧-2’-氟嘌呤核苷酸。[0200]进一步地，具有各种修饰的此类SiNA分子的有义和反义链和修饰模式的非限制性实例显示于图2和3中。[0201]任何上述修饰或其组合包括引用的参考文献中的那些可以应用于本发明的任何siNA分子。[0202]本发明的修饰的SiNA分子可以包含在SiNA分子内的各个位置上的修饰。在某些实施方案中，本发明的双链siNA分子包含在siNA双链体内的内部碱基配对位置上修饰的核苷酸。在其他实施方案中，本发明的双链siNA分子包含在siNA分子的非碱基配对或突出端区域上修饰的核苷酸。在另外其他的实施方案中，本发明的双链siNA分子包含在siNA分子的末端位置上修饰的核苷酸。例如，此类末端区域包括siNA分子的有义和或反义链或区的3位置和或5位置。另外，本发明的所有修饰的siNA分子可以具有在siNA双链体的一条或两条寡核苷酸链中的修饰，例如在有义链、反义链或两条链中。此外，就本发明的siNA分子的化学修饰而言，本发明的双链siNA分子的每条链可以具有一个或多个化学修饰，从而使得每条链包含不同模式的化学修饰。[0203]在某些实施方案中，本发明的双链siNA分子的每条链包含不同模式的化学修饰，如本文所述的任何Stab修饰化学物参见表8或其任何组合，即确定的稳定化学物Stab有义和反义链的不同组合。进一步地，可以产生不同修饰模式的修饰方案的非限制性实例显示于表8中。在表8中称为Stab的稳定化学物可以以有义反义化学物的任何组合，例如Stab78、Stab7ll、Stab88、Stab188、Stab18ll、Stab1213、Stab713、Stab1813、Stab719、Stab819、Stab1819、Stab720、Stab820、Stab1820、Stab732、Stab832或Stab1832或稳定化学的任何其他组合来组合。[0204]在本发明的任何siNA中，siNA分子的引导链或引导区（也称为反义链或反义区）的5’-末端处的一个或多个例如1个、2个、3个、4个或5个核苷酸是核糖核苷酸。[0205]在某些实施方案中，本发明提供了调节HBV表达的双链短干扰核酸siNA分子，其中siNA包括有义链和反义链;每条链独立地是15-30个核苷酸长度;反义链包含与下列中任一个具有序列互补性的至少15个核苷酸：[0208]在一些实施方案中，本发明的siNA分子的反义链包含至少一个下列的15个核苷酸：[0211]在一些实施方案中，本发明的siNA分子的有义链包含至少一个下列的15个核苷酸：[0214]在一些实施方案中，本发明的siNA分子包含下列中的任一个：[0217]任何上述修饰或其组合包括引用的参考文献中的那些可以应用于这些实施方案中的任一个。[0218]在某些实施方案中，SEQIDN0:1、SEQIDN0:452、SEQIDN0:2、SEQIDN0:453、SEQIDN0:3、SEQIDN0:454、SEQIDN0:4或SEQIDN0:455中的至少一个15个核苷酸序列的核苷酸形成一段连续的核苷酸。[0219]在一些实施方案中，siNA分子可以包含对于SEQIDNO:1、SEQIDN0:452、SEQIDN0:2、SEQIDN0:453、SEQIDN0:3、SEQIDN0:454、SEQIDN0:4或SEQIDN0:150中的至少15个核苷酸序列的一个或多个核苷酸缺失、取代、错配和或添加;然而，条件是siNA分子维持其活性，例如以介导RNAi。在非限制性实例中，缺失、取代、错配和或添加可以导致环或凸起，或可替代地摆动或其他可替代非沃森-克里克碱基对。[0220]在本发明的某些实施方案中，提供了双链SiNA分子，其中所述分子具有有义链和反义链且包括下式A:[0222]其中，上链是双链核酸分子的有义链，下链是双链核酸分子的反义链;其中所述反义链包含SEQIDN0:452，SEQIDN0:453，SEQIDN0:454,或SEQIDN0:455中的至少一个15个核苷酸序列，有义链包含与所述反义链具有互补性的序列；[0223]每个N独立地是未修饰或化学修饰的核苷酸或非核苷酸；[0224]每个B是存在或不存在的末端帽；[0225]⑽代表突出端核苷酸，其各自独立地是未修饰或化学修饰的；[0226][N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；[0227]Π和X2独立地是0-4的整数；[0228]X3是15-30的整数；[0229]X4是9-30的整数；和[0230]X5是0-6的整数，条件是X4和X5的总和是15-30。[0231]在某些实施方案中，SEQIDN0:452、SEQIDN0:453、SEQIDN0:454或SEQIDN0:455中的至少一个15个核苷酸序列的核苷酸形成一段连续的核苷酸。[0232]在一些实施方案中，式A的siNA分子可以包含对于SEQIDN0:452、SEQIDNO:453、SEQIDN0:454、SEQIDN0:455的至少15个核苷酸序列的一个或多个核苷酸缺失、取代、错配和或添加;然而，条件是siNA分子维持其活性，例如以介导RNAi。在非限制性实例中，缺失、取代、错配和或添加可以导致环或凸起，或可替代地摆动或其他可替代非沃森-克里克碱基对。[0233]在一个实施方案中，本发明的特征在于式㈧的双链短干扰核酸siNA;其中[0234]aNm位置中的一个或多个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-0-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；[0235]⑹Nm位置中的一个或多个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-0-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；[0236]cNx3位置中的一个或多个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-0-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合;和[0237]⑹Nx3位置中的一个或多个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-0-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合。[0238]在某些实施方案中，本发明的特征在于式㈧的双链短干扰核酸siNA分子;其中[0239]aNm位置中的1、2、3、4、5或更多个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；[0240]⑹Nm位置中的1、2、3、4、5或更多个嘌呤核苷酸是2’-0-烷基核苷酸；[0241]cNx3位置中的1、2、3、4、5或更多个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟核苷酸;和[0242]dNx3位置中的1、2、3、4、5或更多个嘌呤核苷酸是2’-脱氧核苷酸。[0243]在某些实施方案中，本发明的特征在于式㈧的双链短干扰核酸SiNA分子;其中[0244]aNx4位置中的1、2、3、4、5或更多个嘧啶核苷酸是2’-0_烷基核苷酸；[0245]⑹Nx4位置中的1、2、3、4、5或更多个嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；[0246]cNx3位置中的1、2、3、4、5或更多个嘧啶核苷酸是2’-0-烷基核苷酸;和[0247]dNx3位置中的1、2、3、4、5或更多个嘌呤核苷酸是核糖核苷酸。[0248]在某些实施方案中，本发明的特征在于式㈧的双链短干扰核酸SiNA分子;其中[0249]aNx4位置中的1、2、3、4、5或更多个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；[0250]⑹Nx4位置中的1、2、3、4、5或更多个嘌呤核苷酸是2’-0-烷基核苷酸；[0251]cNx3位置中的1、2、3、4、5或更多个嘧啶核苷酸是2’-0-烷基核苷酸;和[0252]dNx3位置中的1、2、3、4、5或更多个嘌呤核苷酸是2’-脱氧-2’-氟核苷酸。[0253]在某些实施方案中，本发明的特征在于式㈧的双链短干扰核酸SiNA分子，其进一步包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。[0254]在一些实施方案中，具有式A的siNA分子包含在核酸分子的反义链或反义区的5’-末端处的末端磷酸酯基团。[0255]在各种实施方案中，具有式A的siNA分子包含X5=0、1、2或3;Π和X2各自=1或2;Χ3=18、19、20、21、22或23，和父4=17、18、19、20、21、22或23。[0256]在某些实施方案中，具有式A的siNA分子包含Χ5=3。在其他实施方案中，具有式A的siNA分子包含Χ5=0。[0257]在某些实施方案中，具有式A的siNA分子包含Π=2和Χ2=2。[0258]在各种实施方案中，具有式A的siNA分子包含Χ5=0、Χ1=2、和Χ2=2。在其他实施方案中，具有式A的siNA分子包含Χ5=3、Χ1=2、和Χ2=2。[0259]在一个特定实施方案中，具有式A的siNA分子包含Χ5=3;Χ1和Χ2各自=2;Χ3=19,和Χ4=16。[0260]在另一个特定实施方案中，具有式A的siNA分子包含Χ5=0;Π和Χ2各自=2;Χ3=19,和Χ4=19。[0261]在某些实施方案中，具有式A的siNA分子包含在有义链或有义区的3’和5’末端处的帽⑻。[0262]在某些实施方案中，具有式A的siNA分子包含在反义链或反义区的3’-末端处的帽⑻。[0263]在各种实施方案中，具有式A的siNA分子包含在有义链或有义区的3’和5’末端处的帽⑻和在反义链或反义区的3’-末端处的帽⑻。[0264]在另外其他的实施方案中，具有式A的siNA分子包含仅在双链核酸分子的有义上部链的5’-末端处的帽⑻。[0265]在一些实施方案中，具有式A的siNA分子在核苷酸之间进一步包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。在某些实施方案中，具有式A的siNA分子包含在核酸分子的有义链、反义链、或有义链和反义链的3’末端上的第一个末端N和邻近核苷酸之间的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。例如，双链核酸分子可以包含具有含硫代磷酸酯核苷酸间键的突出端核苷酸位置的Xl和或Χ2=2,例如NsN其中“s”指示硫代磷酸酯。[0266]在一些实施方案中，具有式A的siNA分子的一个或多个核苷酸具有通用碱基。[0267]在某些实施方案中，当在来自反义链的5’-末端的14位处的核苷酸是嘌呤时，具有式A的SiNA分子在该14位具有核糖核苷酸。在其他实施方案中，当在来自反义链的5’-末端的14位处的核苷酸是嘧啶核苷酸时，具有式A的siNA分子在该14位具有核糖核苷酸、2’-脱氧-2氟核苷酸或2’-0-甲基核苷酸。[0268]在一些实施方案中，具有式A的siNA分子包含在反义链下部链）中的⑽核苷酸，其与HBV目标多核苷酸序列中的核苷酸互补，所述HBV目标多核苷酸序列中的核苷酸也与反义下部链的N和[N]核苷酸具有互补性。[0269]上面讨论的适用于本发明的siNA的任何上述修饰或其组合包括引用的参考文献中的那些可以应用于具有式A的siNA分子的任何实施方案。[0270]C·siNA分子的生成合成[0271]本发明的siNA可以使用本领域技术人员已知的许多技术获得。例如，siNA可以是化学合成的，或可以由质粒编码（例如转录为自动折叠成具有发夹环的双链体的序列）。siNA还可以通过较长dsRNA例如，长度超过约25个核苷酸的dsRNA经由大肠杆菌RNA酶II或切酶Dicer切割而生成。这些酶将dsRNA加工成生物活性的siNA参见例如，Yang等人，PNASUSA99:9942-99472002;Calegari等人PNASUSA99:142362002Byron等人AmbionTechNotes;101:4-62009;Kawaski等人，NucleicAcidsRes.，31:981-9872003，Knight和Bass，Science，293:2269-22712001和Roberston等人，J.Biol.Chem243:821969。[0272]I.化学合成[0273]优选地，本发明的siNA是化学合成的。寡核苷酸（例如，某些修饰的寡核苷酸或缺乏核糖核苷酸的寡核苷酸的部分使用本领域已知的方案合成，例如如下述参考文献中所述:Caruthers等人，1992，Methodsi_nfezyffloiogy211，3_19，Thompson等人，国际PCT公开号TO9954459，Wincott等人，1995，McieicAcidsi?es.23,2677-2684，Wincott等人，1997,MethodsMoJ.Bio.，74,59，13代1111已11等人，1998，_61_〇仏；_1〇〇]_61_〇〇§'.，61，33-45，和Brennan，美国专利号6，001，311。寡核苷酸的合成利用常见的核酸保护和偶联基团，例如在5末端处的二甲氧三苯甲基，和在3末端处的亚磷酰胺。[0274]不含修饰的siNA分子使用如Usman等人，1987，.Cheffi.Soc.，109，7845;Scaringe等人，1990，iVucieicicicsi?es.，18,5433中描述的程序合成。这些合成利用可用于本发明的某些siNA分子的常见的核酸保护和偶联基团，所述核酸保护和偶联基团例如在5末端处的二甲氧三苯甲基，和在3末端处的亚磷酰胺。[0275]在某些实施方案中，本发明的siNA分子根据下述专利中描述的方法进行合成、脱保护和分析:美国专利号6,995,259、6,686,463、6,673,918、6,649,751、6,989,442和美国专利申请号10190,359。[0276]在非限制性合成实例中，小规模的合成在394AppliedBiosystems，Inc.合成仪上进行，其使用〇.2μπιοί规模方案，对于2’-0-甲基化核苷酸使用2.5分钟的偶联步骤和对于2’-脱氧核苷酸或2’-脱氧-2’-氟核苷酸使用45秒的偶联步骤。表9概述了在合成循环中使用的试剂的量和接触时间。[0277]可替代地，本发明的siNA分子可以分开合成且在合成后连接在一起，例如通过连接（Moore等人，1992，Science256,9923;Draper等人，国际PCT公开号WO9323569;Shabarova等人，1991，iVucieicAcidsi?esearc_h19,4247;Bellon等人，1997，iVucieosicesiVucieoi;ices，16,951;Bellon等人，1997，ΰι_〇；ουΥ§·3ί；θCfteΏ.8,204，或通过在合成和或脱保护后杂交。[0278]本发明的各种siNA分子还可以使用Scaringe等人，美国专利号5,889，136;6,008，400;和6，111，086的教导合成。[0279]2.载体表达[0280]可替代地，与编码目标HBV分子的基因相互作用且下调其的本发明的SiNA分子可以由插入到DNA或RNA载体内的转录单位渗见例如Couture等人，1996，TIG.，12,510表达且递送。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。表达siNA的病毒载体可以基于但不限于下述进行构建:腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒。[0281]在一些实施方案中，基于polIII的构建体用于表达本发明的核酸分子。siNA分子序列的转录可以由用于真核RNA聚合酶IpolI、RNA聚合酶IIpolII、或RNA聚合酶IIIpolIII的启动子驱动。（参见例如，Thompson,美国专利号5,902,880和6,146,886。（还参见，Izant和Weintraub，1985,Science，229,345;McGarry和Lindquist，1986，_Proc.iVatJ.Acad.Sci.，USA83,399;Scanlon等人，1991，_Proc.iVati.Acad.Sci.ί4,88，10591-5;Kashani_Sabet等人，1992，Antisansei?es.，2,3-15;Dropulic等人，1992，.KiroJ.，66，1432-41;Weerasinghe等人，1991，.KiroJ.，65，5531-4;Ojwang等人，1992，_Proc.iVatJ.Acad.Sci.ί4,89,10802-6;Chen等人，1992，McJeicAcidsi?es.，20，4581-9;Sarver等人，1990Science,247,1222-1225;Thompson等人，1995，iVucJeicicicsi?es.，23,2259;Good等人，1997，Gane^erap_F，4,45。来自polII或polIII启动子的转录物在所有细胞中以高水平表达;给定polπ启动子在给定细胞类型中的水平取决于附近存在的基因调节序列（增强子、沉默基因等）的性质。也使用原核RNA聚合酶启动子，只要原核RNA聚合酶在合适的细胞中表达Elroy-Stein和Moss，1990，_Proc.iVatJ.icac.Sci.iS4,87,6743-7;Gao和Huang1993，McieicAcidsi?es.，21，2867-72;Lieber等人，1993，枷诎〇心£：似3^〇』.，217,47-66;211〇11等人，1990，¥〇』.（^』』._〇』.，10,4529-37。数位研究者已证实由此类启动子表达的核酸分子可以在哺乳动物细胞中起作用（例如，Kashani-Sabet等人，1992，Antisansei?es.Itev.，2,3-15;0jwang等人，1992，_Proc.jVaiJ.4cad.Sci.iS4,89，10802-6;Chen等人，1992，McieicAcidsi?es.，20,458卜9;Yu等人，1993,Proc.jVaiJ.4cad.Sci.iS^4,90,6340-4;1肋11116『等人，1992，£：燃〇.，11，4411_8;Lisziewicz等人，1993，_Proc.iVatJ.icac.Sci.i.S.4，90,8000_4;Thompson等人，1995，iVucieicAcidsi?es.，23,2259;SullengerCech，1993，Sciance，262,1566。更特定地，转录单位例如衍生自编码U6小核snRNA、转移RNAtRNA和腺病毒VARNA的基因的那些在细胞中产生高浓度的所需RNA分子例如siNA方面是有用的Thompson等人，同上；Couture和Stinchcomb，1996，同上；Noonberg等人，1994，iVucJeici?es.，22,2830;Noonberg等人，美国专利号5,624,803;Good等人，1997，Gene^er.，4,45;Beigelman等人，国际PCT公开号WO9618736。上述siNA转录单位可以掺入多种载体内用于引入哺乳动物细胞内，包括但不限于，质粒DNA载体、病毒DNA载体例如，腺病毒或腺相关病毒载体）、或病毒RNA载体例如逆转录病毒或甲病毒载体）（关于综述参见Couture和Stinchcomb，1996,同上）。[0282]用于表达本发明的SiNA分子的载体可以编码SiNA双链体的一条或两条链，或自我杂交成SiNA双链体的单一自我互补链。编码本发明的SiNA分子的核酸序列可以以允许SiNA分子表达的方式可操作地连接参见例如Paul等人，2002,iVatureSioteciMoiogy，19，505;Miyagishi和Taira，2002,iVatureBiotechnoiOgy，19,497;Lee等人，2002,iVatureBiotechnoJogy，19,500;和Novina等人，2002,iVatureMedici_ne，预先在线公开doi:10.1038nm725。[0283]D.载体递送系统[0284]本发明的siNA分子可以直接加入，或可以与阳离子脂质复合，包装在脂质体内，或作为表达SiNA分子的重组质粒或病毒载体，或以其他方式递送给目标细胞或组织。用于递送核酸分子的方法在下述参考文献中得到描述:Akhtar等人，1992，TrendsCeiiBio.，2，139；DeliveryStrategiesforAntisenseOligonucleotideTherapeutics,AkhtarHi辑，1995，Maurer等人，1999，MoJ.Menbr.BioJ.，16,129-140;Hofland和Huang，1999，iandfci.p.Pharffiacoi.，137,165-192;和Lee等人，2000dCSSy_mp.Ser.，752,184-192。Beigelman等人，美国专利号6,395,713和Sullivan等人，PCTWO9402595进一步描述了用于递送核酸分子的一般方法。这些方案可以用于递送事实上任何核酸分子。核酸分子可以通过本领域技术人员已知的多种方法施用于细胞，包括但不限于，被封装在脂质体中，通过离子电渗，或通过掺入其他媒介物内，所述其他媒介物例如生物可降解聚合物、水凝胶、环糊精（参见例如Gonzalez等人，1999，_Bioco_njYgateCfteffi.，10,1068_1074;Wang等人，国际PCR公开号WO0347518和WO0346185、乳酸-乙醇酸共聚物PLGA和PLCA微球体参见例如美国专利6,447,796和美国专利申请公开号US2002130430、生物可降解纳米胶囊nanocapsule和生物粘附微球体，或通过蛋白样载体0’Hare和Normand，国际PCT公开号WO0053722〇[0285]在一个方面，本发明提供了包含本文描述的SiNA分子的载体系统。在一些实施方案中，载体系统是基于脂质的载体系统、阳离子脂质、或脂质体核酸复合物、脂质体、胶粒、病毒体、脂质纳米颗粒或其混合物。在其他实施方案中，载体系统是基于聚合物的载体系统，例如阳离子聚合物-核酸复合物。在另外的实施方案中，载体系统是基于环糊精的载体系统，例如环糊精聚合物-核酸复合物。在进一步的实施方案中，载体系统是基于蛋白质的载体系统，例如阳离子肽-核酸复合物。优选地，载体系统是脂质纳米颗粒（“LNP”）制剂。[0286]在某些实施方案中，本发明的SiNA分子与脂质纳米颗粒组合物如美国专利申请号11353,630、11586，102、61189,295、61204,878、61235,476、61249,807、61298,022、61351373、61347640、61345754、61322054、12640342、和12617079和卩：1'申请号？：1'US10020013和PCTUS09053336中所述的那些共同配制。在某些实施方案中，siNA与本文实施例6中所述并例举的组分和比例共同配制也参见表1011。[0287]在各个实施方案中，表10中所述的脂质纳米颗粒制剂应用于本文的任何siNA分子或siNA分子的组合。在一些实施方案中，本发明的特征在于包含本发明的siNA分子的组合物，所述siNA分子被配制为包括阳离子脂质化合物编号1-46中任一种或其组合的组合物。[0288]在某些其他实施方案中，本发明的特征在于包含本发明的siNA分子的组合物，所述siNA分子与美国专利申请号61189,295、61204,878、61235,476、61249,807和61298,022中所述的阳离子脂质制剂中任一种一起配制。[0289]在其他实施方案中，本发明的特征在于本发明的SiNA分子的缀合物和或复合物。此类缀合物和或复合物可以用于促进SiNA分子递送到生物系统例如细胞内。由本发明提供的缀合物和复合物可以赋予治疗活性，其通过将治疗化合物转移经过细胞膜，改变药物代谢动力学和或调节本发明的核酸分子的定位实现。此类缀合物的非限制性实例在美国公开号US20080152661Al和US20040162260Al例如，CDM-LBA、CDM-Pip-LBA、CDM-PEG、CDM-NAG等和美国专利申请号10427,16010201，394、61322422和61315223;和美国公开号6,528,631;6,335,434;6,235,886;6,153,737;5,214,136;和5,138,045中描述。[0290]在各种实施方案中，聚乙二醇PEG可以与本发明的SiNA化合物共价结合。结合的PEG可以是任何分子量，优选约100-约50,000道尔顿Da。[0291]在另外其他的实施方案中，本发明的特征在于包含表面修饰的脂质体的组合物或制剂，所述表面修饰的脂质体包含聚乙二醇脂质（PEG修饰的，或长循环脂质体或隐形stealth脂质体和本发明的SiNA分子，如在例如国际PCT公开号TO9610391;Ansell等人，国际PCT公开号WO9610390;Holland等人，国际PCT公开号WO9610392中所公开的。[0292]在一些实施方案中，本发明的SiNA分子还可以用聚乙烯亚胺及其衍生物配制或与聚乙烯亚胺及其衍生物复合，例如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺PEI-PEG-GAL或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺PEI-PEG-triGAL衍生物。在一个实施方案中，本发明的核酸分子如美国专利申请公开号20030077829中所述进行配制。[0293]在其他实施方案中，本发明的SiNA分子与膜破裂试剂例如美国专利申请公开号20010007666中描述的那些复合。在还其他的实施方案中，一种或多种膜破裂试剂和SiNA分子还与阳离子脂质或辅助脂质分子例如美国专利号6,235,310中描述的那些脂质复合。[0294]在某些实施方案中，本发明的SiNA分子与如下述专利中描述的递送系统复合:美国专利申请公开号2003077829;20050287551;20050164220;20050191627;20050118594;20050153919;20050085486;和20030158133;以及国际PCT公开号WO0003683和WO02087541。[0295]在一些实施方案中，本发明的脂质体制剂包含用下述专利中描述的化合物和组合物配制，或与下述专利中描述的化合物和组合物复合的本发明的siNA分子例如，siNA:美国专利号6,858,224;6,534,484;6,287,591;6,835,395;6,586,410;6,858,225;6,815，432;6,586,001;6，120,798;6,977,223;6,998，115;5,981，501;5,976,567;5,705,385;以及美国专利申请公开号20060019912;20060019258;20060008909;20050255153;20050079212；20050008689；20030077829,20050064595,20050175682,20050118253；20040071654;20050244504;20050265961和20030077829。[0296]可替代地，表达本发明的siNA的如上文讨论的重组质粒和病毒载体可以用于递送本发明的分子。表达siNA分子的载体的递送可以是全身性的，例如通过静脉内或肌内施用，通过施用于从受试者外植的目标细胞随后重新引入受试者内，或通过将允许引入所需目标细胞内的任何其他方式关于综述参见Couture等人，1996,TIG.，12,510。此类重组质粒还可以直接或与合适的递送试剂结合施用，所述合适的递送试剂包括例如MirusTransitLTl亲脂试剂；lipofectin;lipofectamine;cellfectin;聚阳离子例如聚赖氨酸或基于脂质体脂质的载体系统、阳离子脂质、或脂质体核酸复合物、胶粒、病毒体、脂质纳米颗粒。[0297]E.试剂盒[0298]本发明还提供了以试剂盒形式的核酸。试剂盒可以包含容器。试剂盒一般包含本发明的核酸连同关于其施用的说明书。在某些情况下，核酸可以具有结合的靶向部分。结合靶向部分例如抗体、蛋白质）的方法是本领域技术人员已知的。在某些情况下，核酸是化学修饰的。在其他实施方案中，试剂盒包含超过一种本发明的SiNA分子。试剂盒可以包含本发明的SiNA分子连同药学上可接受的载体或稀释剂。试剂盒可以进一步包含赋形剂。[0299]F.治疗用途药物组合物[0300]HBV研究中现有的大量知识指出需要用于研究、诊断和治疗用途的测定HBV活性的方法和可以调节HBV表达的化合物。如下文所描述的，本发明的核酸分子可以在测定中用于诊断与HBV水平有关的疾病状态。此外，核酸分子和药物组合物可以用于治疗与HBVRNA水平有关的疾病状态。[0301]1.与HBV相关的疾病状态[0302]可以与HBV表达调节相关的具体疾病状况包括肝脏疾病和癌症。此类疾病的非限制性实例包括肝硬化和肝细胞癌。[0303]应当理解，本发明的SiNA分子可以降解目标HBVmRNA且从而抑制上述疾病）。疾病的抑制可以通过直接测量受试者中的疾病进展进行评价。它还可以通过观察与疾病相关的状况中的改变或逆转进行推断。另外，本发明的SiNA分子可以用作预防。因此，本发明的核酸分子和药物组合物的使用可以用于改善、治疗、预防和或治愈与HBV基因表达的调节相关的这些疾病及其他疾病。[0304]2.药物组合物[0305]本发明的SiNA分子提供了用于多种治疗、预防、化妆品、兽医、诊断、目标确认、基因组发现、基因工程和药物基因组学pharmacogenomic应用的有用试剂和方法。[0306]a.[0307]因此，在一个方面，本发明还提供了所述siNA分子的药物组合物，S卩，药学上可接受的载体或稀释剂中的组合物。这些药物组合物包括上述化合物的盐、酯、或此类酯的盐，例如，酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、乙酸和苯磺酸的盐。其他盐包括，例如，钠盐、钾盐、锰盐、铵盐和钙盐。这些制剂或组合物可以包含本领域通常已知的药学上可接受的载体或稀释剂。[0308]在一个实施方案中，本发明的特征在于包含SiNA分子的药物组合物，所述SiNA分子包含至少一个SEQIDNO:1的15个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含至少一个SEQIDN0:452的15个核苷酸。在又另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述SiNA分子包含至少一个SEQIDNO:2的15个核苷酸。在仍另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含至少一个SEQIDN0:453的15个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含至少一个SEQIDNO:3的15个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含至少一个SEQIDN0:454的15个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含至少一个SEQIDNO:4的15个核苷酸。在又另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含至少一个SEQIDN0:455的15个核苷酸。在另外一个实施方案中，本发明的特征在于包含SiNA分子的药物组合物，所述SiNA分子包含式A。[0309]根据本领域已知的技术，本发明的SiNA分子优选在施用于受试者之前配制为药物组合物。本发明的药物组合物表征为至少无菌和无热原的。用于制备本发明的药物组合物的方法在本领域的技术内，例如如’sPharffiaceuticaiScience，第17版，MackPublishingCompany，Easton，Pa.1985中所述。[0310]在一些实施方案中，本发明的药物组合物例如SiNA和或其LNP制剂进一步包含常规药学赋形剂和或添加剂。合适的药学赋形剂包括防腐剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、摩尔渗透压浓度调节剂、缓冲剂和pH调节剂。合适的添加剂包括生理学生物相容性缓冲剂例如三甲胺盐酸盐），螯合剂例如DTPA或DTPA-双酰胺或钙螯合物复合物例如钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺）的添加，或任选地，钙或钠盐例如氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙的添加。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。[0311]用于局部施用的各种类型制剂的非限制性实例包括软膏、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、泡沫剂、用于通过经皮贴剂递送的制剂、粉末、喷雾剂、气溶胶、用于在吸入器或吹入器中使用的胶囊或药液筒或滴剂例如眼或鼻滴剂）、用于喷雾化的溶液悬浮液、栓剂、子宫托、保留灌肠剂和可咀嚼或可吮吸片剂或丸剂例如用于治疗口疮性溃疡或脂质体或微胶囊制剂。[0312]软膏、乳膏剂和凝胶剂可以例如用水或油基质配制，伴随合适增稠剂和或胶凝剂和或溶剂的添加。此类基质的非限制性实例因此可以例如包括水和或油例如液体石蜡或植物油例如花生油或蓖麻油、或溶剂例如聚乙二醇。各种的增稠剂和胶凝剂可以根据基质的性质使用。此类试剂的非限制性实例包括软石蜡、硬脂酸铝、鲸蜡硬脂醇、聚乙二醇、羊毛月旨、蜂蜡、羧聚乙烯和纤维素衍生物、和或单硬脂酸甘油酯和或非离子型乳化剂。[0313]在一个实施方案中，洗剂可以用水或油基质配制，并且一般而言还将包含一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂或增稠剂。[0314]在一个实施方案中，用于外用的粉末可以借助于任何合适的粉末基质例如滑石、乳糖或淀粉形成。滴剂可以用水或非水基质配制，还包括一种或多种分散剂、增溶剂、悬浮剂或防腐剂。[0315]预期用于经口使用的组合物可以根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法进行制备，并且此类组合物可以包含一种或多种此类甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂以便提供药学上精致和可口的制剂。片剂包含与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分，所述赋形剂适合于制备片剂。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂;例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠;粒化和崩解剂，例如玉米淀粉、或藻酸;粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶;和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包被的，或它们可以通过已知技术进行包被。在一些情况下，此类包被可以通过已知技术进行制备，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收且因此提供经过较长时间段的持续作用。例如，可以使用时间延迟材料例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。[0316]用于经口使用的制剂也可以呈现为其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合的硬明胶胶囊，或呈现为其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊。[0317]水性悬浮液包含与适合于制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性材料。此类赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶;分散或湿润剂可以是天然存在的磷脂例如卵磷脂，或烯化氧与脂肪酸的缩合产物例如聚氧乙烯硬脂酸酯;或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物例如十七乙稀氧基鲸錯醇heptadecaethyleneoxycetanol，或环氧乙烧与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物例如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。水性悬浮液还可以包含一种或多种防腐剂例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂例如蔗糖或糖精。[0318]油性悬浮液可以通过使活性成分悬浮于植物油或矿物油例如液体石蜡中来制备，所述植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油。油性悬浮液可以包含增稠剂例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂和调味剂以提供可口的经口制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸进行防腐。[0319]本发明的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油或矿物油或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶，天然存在的磷脂例如大豆、卵磷脂，以及衍生自脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯partialester，例如山梨糖醇酐单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。[0320]糖浆和酏剂可以用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖进行配制。此类制剂还可以包含缓和剂、防腐剂以及调味剂和着色剂。药物组合物可以是无菌可注射的水性或含油悬浮液的形式。这种悬浮液可以根据已知技术进行配制，其中使用上文已提及的那些合适的分散或湿润剂和悬浮剂。无菌可注射的制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1，3_丁二醇中的溶液。在可以使用的可接受的媒介物和溶剂中有水、林格液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的、固定油常规用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以使用任何温和的固定油包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸在可注射物的制备中发现用途。[0321]本发明的核酸分子也可以以栓剂的形式施用，例如用于药物的直肠施用。这些组合物可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合进行制备，所述赋形剂在常温下是固体的但在直肠温度下是液体的，并且因此在直肠中将融化以释放药物。此类材料包括可可脂和聚乙二醇。[0322]本发明的核酸分子可以在无菌介质中肠胃外施用。取决于使用的媒介物和浓度，药物可以悬浮于或溶解于媒介物中。有利地，佐剂例如局部麻醉药、防腐剂和缓冲剂可以溶解于媒介物中。[0323]在其他实施方案中，本文提供的用于在肺递送中使用的SiNA和LNP组合物和制剂进一步包含一种或多种表面活性剂。用于增强本发明的组合物摄取的合适表面活性剂或表面活性剂组分包括合成和天然以及完整和截短形式的表面活性蛋白A，表面活性蛋白B，表面活性蛋白C，表面活性蛋白D和表面活性蛋白E，二饱和磷脂酰胆碱除二棕榈酰外），二棕榈酰磷脂酰胆碱，磷脂酰胆碱，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸;磷脂酸，泛醌，溶血磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰胆碱，棕榈酰-溶血磷脂酰胆碱，脱氢表雄酮，多碗醇，sulfatidicacid，甘油-3-磷酸，二轻丙酮磷酸，甘油，甘油-3-磷酸胆碱，二轻丙酮，棕榈酸盐，胞苷二磷酸CDP二酰甘油，CDP胆碱，胆碱，磷酸胆碱；以及天然和人造片层体，其是关于表面活性剂组分的天然载体媒介物，ω-3脂肪酸，聚稀酸polyenicacid，多稀酸，卵磷脂，棕榈酸，氧化乙烯或氧化丙烯的非离子嵌段共聚物，聚氧丙烯、单体和聚合的，聚氧乙烯、单体和聚合的，具有葡聚糖和或烷酰基侧链的聚乙烯胺，Brij35，TritonX-100和合成表面活性剂ALEC，Exosurf，Survan和Atovaquone，等等。这些表面活性剂可以在制剂中作为单一表面活性剂或多组分表面活性剂的部分使用，或作为与本文的药物组合物的核酸组分的5’和或3’末端共价结合的附加物使用。[0324]b.组合[0325]可以将本发明的SiNA和药物制剂单独施用给受试者，或者与一种或多种其他治疗剂例如抗病毒剂或抗肿瘤剂组合使用或者包括一种或多种其他治疗剂例如抗病毒剂或抗肿瘤剂）。因此，本发明公开的化合物与其他抗病毒或抗癌剂或化疗剂的组合在本发明的范围内。[0326]在V.T.Devita和S.Hellman主编）的Cancer_Pri_ncipJesa_ndPracticeofCtacoJogy，第6版（2001年2月15日），LippincottWilliamsWilkinsPublisher中，可以发现抗癌或化疗剂的实例。根据所述药物和所涉及的癌症的特定特性，本领域普通技术人员能辨别哪个试剂组合是有用的。此类抗癌剂包括但不仅限于下列:雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、类视色素受体调节剂、细胞毒性剂细胞抑制剂、抗增生剂、异戊二烯基_蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂和其他血管生成抑制剂、细胞增殖和存活信号传递的抑制剂、凋亡诱导剂和干扰细胞周期检验点的试剂。本发明的SiNA也可用于和HCC治疗中使用的任何治疗剂例如但限于索拉非尼组合。[0327]因此，在进一步的实施方案中，本发明提供了包含本发明的SiNA分子或其药学上可接受的盐、溶剂化物或具有生理功能的衍生物以及一种或多种抗病毒剂的组合物，所述siNA分子例如，但不限于，包含SEQIDN0:1、SEQIDN0:1210、SEQIDN0:2、SEQIDNO:1211、SEQIDN0:3、SEQIDN0:1212、SEQIDN0:4或SEQIDN0:1213;或式㈧中的至少一个15个核苷酸序列的siNA分子。在一些实施方案中，抗病毒剂是另一种HBV抑制剂。[0328]在某些实施方案中，本发明的siNA分子可用于与包括下列的已知HBV抗病毒剂组合:拉米夫定2’，3’-二脱氧-3’-硫代胞苷，通常称为3TC、聚乙二醇化干扰素_a2a、替诺福韦、恩替卡韦、替比夫定、阿德福韦。[0329]此外，本发明提供了包含本发明的siNA分子或其药学上可接受的盐、溶剂化物或具有生理功能的衍生物以及一种或多种抗癌剂或化疗剂的组合物，所述siNA分子例如，但不限于，包含SEQIDN0:1、SEQIDN0:452、SEQIDN0:2、SEQIDN0:453、SEQIDN0:3、SEQIDN0:454、SEQIDN0:4或SEQIDN0:455;或式A中的至少一个15个核苷酸序列的siNA分子。[0330]在某些实施方案中，本发明的siNA分子可用于与包括下列的已知抗肿瘤剂组合：雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、维甲酸受体调节剂、细胞毒性剂、抗增殖剂、异戊二烯基蛋白转移抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂和其他血管生成抑制剂。[0331]可以与本发明的化合物组合使用的雌激素受体调节剂的实例包括、但不限于:他莫昔芬、雷洛昔芬、艾多昔芬、1^353381、1^117081、托瑞米芬、氟维司群、4-[7-2,2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-1-昵啶基）乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯基-2，2-二甲基丙酸酯、4，4’-二羟基二苯甲酮-2，4-二硝基苯基-腙、和SH646。[0332]可以与本发明的化合物组合使用的雄激素受体调节剂的实例包括、但不限于:非那雄胺和其他5α_还原酶抑制剂、尼鲁米特、氟他胺、比卡鲁胺、利阿唑、和醋酸阿比特龙。[0333]可以与本发明的化合物组合使用的此类维甲酸受体调节剂的实例包括、但不限于：贝沙罗汀、维甲酸、13-顺式-视黄酸、9-顺式-视黄酸、α-二氟甲基鸟氨酸、ILX23-7553、反式-N-4’-轻基苯基视黄酰胺retinamide、和Ν-4-羧基苯基视黄酰胺。[0334]可以与本发明的化合物组合使用的细胞毒性剂的实例包括、但不限于:sertenef、恶病质素、异环磷酰胺、他索纳明、氯尼达明、卡铂、六甲密胺、泊尼莫司汀、二溴卫矛醇、雷莫司汀、福莫司汀、奈达铂、奥沙利铂、替莫唑胺、heptaplatin、雌莫司汀、英丙舒凡甲苯磺酸盐tosilate、曲磷胺、尼莫司汀、二溴螺氯铵、嘌嘧替派、洛铂、沙铂、甲基丝裂霉素、顺铀、伊罗夫文、右异环磷酰胺dexifosfamide、顺式-胺化二氯2-甲基-啦啶铀、节基鸟噪呤、葡磷酰胺、GPX100、（反式，反式，反式-二-mu-己烧-1,6-二胺-mu-[二胺-铀（II]二[二胺氯）铀（Π]四氯化物、diarizidinylspermine、三氧化二砷、1-11-十二烧基氨基-10-羟基十一烷基-3,7_二甲基黄嘌呤、佐柔比星、伊达比星、柔红霉素、比生群、米托蒽醌、吡柔比星、吡萘非特、戊柔比星、氨柔比星、抗瘤酮antineoplaston、3’-脱氨基-3’-吗啉代-13-脱氧代-10-羟基洋红霉素、annamycin、加柔比星、依利奈法德、MEN10755、和4-脱甲氧基-3-脱氨基-3-氮丙啶基-4-甲磺酰基-柔红霉素参见WO0050032。[0335]可以与本发明的化合物组合使用的缺氧活化的化合物的实例是替拉扎明。[0336]可以与本发明的化合物组合使用的蛋白酶抑制剂的实例包括但不限于乳胞素和硼替佐米。[0337]可以与本发明的化合物组合使用的微管抑制剂微管稳定剂的实例包括、但不限于:紫杉醇、硫酸长春地辛、3’，4’-二脱氢-4’-脱氧-8’-去长春花碱、docetaxol、根霉素、多拉司他汀、米伏布林羟乙基磺酸盐、auristatin、西马多丁、RPR10988UBMS184476、长春氟宁、cryptophycin、2，3，4，5,6-五氟-N-3-氟-4-甲氧基苯基）苯磺酰胺、无水长春碱anhydrovinblastine、N，N-二甲基-L-结I氨酰基-L-结I氨酰基-N-甲基-L-结I氨酰基-L-脯氨酰基-L-脯氨酸-叔-丁酰胺、10乂258、叩〇他11〇1^8参见例如美国专利号6,284,781和6，288,237*BMS188797。[0338]可以与本发明的化合物组合使用的拓扑异构酶抑制剂的一些实例包括但不限于托泊替康、hycaptamine、伊立替康、卢比替康、6-乙氧基丙酰基-3’，4’-0-外-亚苄基-教酒菌素、9-甲氧基-N，N-二甲基-5-硝基吡唑并[3,4,5-kl]吖啶-2-6H丙胺、1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-IH，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’：b，7]-吲嗪并[I，2b]喹啉-10,139H，15H二酮、勒托替康、7-[2-N-异丙基氨基）乙基]-20S喜树碱、BNP1350、BNPI1100、BN80915、BN80942、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、索布佐生、2’-二甲基氨基-2’-脱氧-依托泊苷、GL331、N-[2-二甲基氨基）乙基]-9-羟基-5，6-二甲基-6H-吡啶并[4，3-b]咔唑-1-甲酰胺、asulacrine、（5a，5aB，8aa，9b-9-[2-[N-[2-二甲基氨基）乙基]-N-甲基氨基]乙基]-5-[4-羟基-3，5-二甲氧基苯基]-5，5a，6，8，8a，9-六氢furo3’，4’：6，7萘并2，3-d-1，3-间二氧杂环戊烯-6-酮、2,3-亚甲二氧基-5-甲基-7-羟基-8-甲氧基苯并[c]-啡啶鑰、6，9_二[2-氨基乙基氨基]苯并[g]异喹啉-5，10-二酮、5-3-氨基丙基氨基-7，10-二羟基-2-2-羟基乙基氨基甲基-6H-吡唑并[4，5，Ι-de]吖啶-6-酮、N-[1-[2二乙基氨基）乙基氨基]-7-甲氧基-9-氧代-9H-噻吨-4-基甲基]甲酰胺、N-2-二甲基氨基）乙基）吖啶-4-甲酰胺、6-[[2-二甲基氨基）乙基]氨基]-3-羟基-7H-茚并[2，1-c]喹啉-7-酮、和地美司钠。[0339]可以与本发明的化合物组合使用的有丝分裂驱动蛋白、尤其是有丝分裂驱动蛋白KSP的抑制剂的实例包括但不限于PCT公开WO0130768、W00198278、W003050,064、W003050，122、W003049,527、W003049,679、W003049,678、TO04039774、W003079973、TO03099211、TO03105855、TO03106417、TO04037171、TO04058148、TO04058700、W004126699、W005018638、W005019206、W005019205、W005018547、W005017190、US20050176776中所述的抑制剂。在一个实施方案中，有丝分裂驱动蛋白的抑制剂包括但不限于KSP的抑制剂、MKLP1的抑制剂、CENP-E的抑制剂、MCAK的抑制剂、KiΠ4的抑制剂、Mphosph1的抑制剂和Rab6-KIFL的抑制剂。[0340]可以与本发明的化合物组合使用的“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”的实例包括、但不限于：TSA、oxamfIatiruPXDlOl、MG98、丙戊酸和scriptaid。在下面的原稿;Miller，T·Α·等人.Med.CAeΏ.4624:5097-51162003中，可以发现其他组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的另外一些参考。[0341]可以与本发明的化合物组合使用的参与有丝分裂进程的激酶的抑制剂包括、但不限于:极光激酶抑制剂、Polo-样激酶PLK的抑制剂（特别是PLK-I的抑制剂）、bub-l的抑制剂和bub-Rl的抑制剂。[0342]可以与本发明的化合物组合使用的抗增殖剂包括、但不限于:反义RNA和DNA寡核苷酸如G3139、0DN698、RVASKRAS、GEM231、和INX3001，以及抗代谢物如依诺他滨、卡莫氟、替加氟、喷司他丁、去氧氟尿苷、曲美沙特、氟达拉滨、卡培他滨、加洛他滨、阿糖胞苷烷磷酯、fosteabinesodium水合物、雷替曲塞、paltitrexid、乙喃替氣、噻卩坐呋林（tiazofurin、地西他滨、诺拉曲塞、培美曲塞、nelZarabine、2’-脱氧-2’-亚甲基胞苷、2’-氟亚甲基-2’-脱氧胞苷、N-[5-2，3-二氢-苯并呋喃基）磺酰基]-Ν’-3，4-二氯苯基脲、N6-[4-脱氧-4-[Ν2-[2⑹，4⑹-十四碳二烯酰基]甘氨酰基氨基]-L-甘油-B-L-甘露糖-庚糖吡喃糖基]腺噪呤、8卩111;[116、海鞘素6^6；[1^8^1;[11、曲沙他滨、4-[2-氨基-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3Η-嘧啶并[5,4-b][1，4]噻嗪-6-基-S-乙基]-2,5-噻吩酰基-L-谷氨酸、氨基蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿拉诺新、11-乙酰基-8-氨基甲酰氧基甲基）-4-甲酰基-6-甲氧基-14-氧杂-1，11-二氮杂四环7.4.1.0.0-十四碳-2，4,6_二稀-9-基乙酸酯、苦马显碱、洛美曲索、右雷佐生、蛋氨酸酶、2’-氰基-2’-脱氧-M-棕榈酰基-I-B-D-阿糖呋喃糖基胞嘧啶、和3-氨基吡啶-2-醛缩氨基硫脲。[0343]可以与本发明的化合物组合使用的单克隆抗体靶向的治疗剂的实例包括:具有与癌细胞特异性的或目标细胞特异性的单克隆抗体相连的细胞毒性剂或放射性同位素的那些治疗剂，例如，Bexxar。[0344]可以与本发明的化合物组合使用的HMG-CoA还原酶抑制剂的实例包括、但不限于：洛伐它汀MEVACOR®;参见美国专利号4，231，938、4，294，926和4，319，039、辛伐它汀Z0C0R®;参见美国专利号4,444,784、4,820,850和4,916,239、普伐它汀屮1仏¥厶0101^®;参见美国专利号4,346，227、4,537,859、4,410,629、5,030,447和5,180,589、氟伐它汀LESCOL®;参见美国专利号5,354,772、4,911，165、4,929,437、5，189，164、5，118,853、5，290,946和5,356,896和阿伐它汀（LIPITOR®;参见美国专利号5,273,995、4,681，893、5，489，691和5，342，952。可用于本发明方法中的这些和其他HMG-CoA还原酶抑制剂的结构式描述在：M.Yalpani,“CholesterolLoweringDrugs”，ChemistryIndustry,第85—89页（1996年2月5日）的第87页和美国专利号4，782，084和4，885，314中。[0345]可以与本发明的化合物组合使用的异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂的实例，包括、但不限于，可参见下面的公开和专利:W09630343、W09718813、W09721701、W09723478、W09738665、W09828980、W09829119、W09532987、美国专利号5,420,245、美国专利号5,523,430、美国专利号5,532,359、美国专利号5,510,510、美国专利号5，589,485、美国专利号5,602,098、欧洲专利公开0618221、欧洲专利公开0675112、欧洲专利公开〇604181、欧洲专利公开0696593、W09419357、W09508542、W09511917、W09512612、W09512572、W09510514、美国专利号5,661，152、W09510515、W09510516、W09524612、W09534535、W09525086、W09605529、W09606138、TO9606193、W09616443、W09621701、W09621456、W09622278、W09624611、W09624612、W09605168、W09605169、W09600736、美国专利号5,571，792、W09617861、W09633159、W09634850、W09634851、W09630017、W09630018、W09630362、W09630363、W09631111、W09631477、W09631478、W09631501、W09700252、W09703047、W09703050、W09704785、W09702920、W09717070、W09723478、W09726246、W09730053、W09744350、W09802436、和美国专利号5,532,359。关于异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂对血管生成的作用的实例，参见EuropeanJ·ofCancer，第35卷，第9期，第1394-1401页（1999。[0346]可以与本发明的化合物组合使用的血管生成抑制剂的实例包括、但不限于:酪氨酸激酶抑制剂，如酪氨酸激酶受体Flt-IVEGFRl和Flk-1KDRVEGFR2的抑制剂、表皮衍生的、成纤维细胞衍生的、或血小板衍生的生长因子的抑制剂、MMP基质金属蛋白酶抑制剂、亲和素阻滞剂、干扰素-α、白介素-12、戊聚糖聚硫酸酯、环氧合酶抑制剂，包括非留体抗炎药NSAID如阿司匹林和布洛芬以及选择性环氧合酶-2抑制剂如塞来考昔和罗非考昔PNAS，第89卷，第7384页（1992;JNCI，第69卷，第475页（1982;Arch.Opthalmol.，第108卷，第573页（1990;Anat.Rec.，第238卷，第68页（1994;FEBSLetters,第372卷，第83页1995;Clin,Orthop.第313卷，第76页（1995;J.Mol.Endocrinol·,第16卷，第107页1996;Jpn.J.Pharmacol·,第75页，第105页（1997;CancerRes.，第57卷，第1625页1997;Cell，第93卷，第705页（1998;Intl.J.Mol.Med.,第2卷，第715页（1998;J.Biol.Chem.，第274卷，第9116页（1999、甾体抗炎药如皮质类固醇、盐皮质激素、地塞米松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、倍他米松）、羧基酰氨基三唑、考布它汀A-4、角鲨胺、6-0-氯乙酰基-羰基_烟曲霉醇、沙利度胺、血管它汀、肌钙蛋白-1、血管紧张素II拮抗剂参见Fernandez等人，J.Lab.Clin.Med.105:141-1451985、和VEGF抗体（参见，NatureBiotechnology，第17卷，第963-968页（1999年10月）；Kim等人，Nature,362，841-8441993;W00044777;和WO0061186。[0347]调节或抑制血管生成的其他治疗剂也可以与本发明的化合物组合使用，包括调节或抑制凝血和纤维蛋白溶解系统的试剂参见Ciin.Chefl.La.Med.38:679-6922000中的综述）。可以与本发明的化合物组合使用的这种调节或抑制凝血和纤维蛋白溶解系统的试剂实例包括、但不限于:肝素参见Thromb.Haemost.80:10-231998、低分子量肝素和羧肽酶U抑制剂池被称为活性凝血酶活化的纤维蛋白溶解抑制剂[TAFIa]的抑制剂）参见ThrombosisRes.101:329-3542001ACT公开和美国系列号60349,9252002年1月18日提交）已经描述了TAFIa抑制剂。[0348]可以与本发明的化合物组合使用的干扰细胞周期检查点的试剂包括、但不限于：ATR、ATM、Chkl和Chk2激酶的抑制剂以及cdk和cdc激酶抑制剂，并且其特定的实例有7-羟基星形孢菌素、夫拉平度、CYC202Cyclacel和BMS-387032。[0349]可以与本发明的化合物组合使用的干扰受体酪氨酸激酶RTK的试剂包括、但不限于：c-Kit、Eph、PDGF、Flt3和HBV的抑制剂。另一些试剂包括如Bume-Jensen和Hunter，Nature,411:355-365，2001所述的RTK的抑制剂。[0350]可以与本发明的化合物组合使用的细胞增殖和生存信号传递通路的抑制剂包括但不限于EGFR的抑制剂（例如，吉非替尼，厄洛替尼）、ERB-2的抑制剂（例如曲妥珠单抗）、IGFR的抑制剂、细胞因子受体的抑制剂、HBV的抑制剂，PI3K的抑制剂例如，LY294002、丝氨酸苏氨酸激酶（包括但不限于Akt的抑制剂，如WO02083064、W002083139、W002083140、US2004-0116432、W002083138、US2004-0102360、W003086404、W003086279、W003086394、W003084473、W003086403、W02004041162、W02004096131、TO2004096129、W02004096135、W02004096130、W02005100356、W02005100344中所述的）、Raf激酶的抑制剂例如，BAY-43-9006、MEK的抑制剂例如CI-1040和Η-098059和mTOR的抑制剂例如WyethCCI-779。此类试剂包括小分子抑制剂化合物和抗体拮抗剂。[0351]可以与本发明的化合物组合使用的凋亡诱导剂包括但不限于TNF受体家族成员包括TRAIL受体的活化剂。[0352]可以与本发明的化合物组合使用的选择性C0X-2抑制剂NSAID，包括但不限于美国专利5，474,995、美国专利5,861,419、美国专利6,001,843、美国专利6,020,343、美国专利5,409,944、美国专利5,436,265、美国专利5,536,752、美国专利5,550,142、美国专利5，604,260、1].5.5,698,584、美国专利5,710，140、冊9415932、美国专利5,344,991、美国专利5,134,142、美国专利5,380,738、美国专利5,393,790、美国专利5，466,823、美国专利5，633，272和美国专利5，932，598中公开的那些NSAID，其所有通过引用并入本文。[0353]尤其用于与本发明的化合物组合的C0X-2的抑制剂包括:3_苯基-4-4-甲基磺酰基苯基-2-5丑-呋喃酮;和5-氯-3-4-甲基磺酰基-苯基-2-2-甲基-5-吡啶基）吡啶；或其药学上可接受的盐。[0354]已经被描述为⑶X-2的特异性抑制剂并且因此可用于本发明中的化合物包括、但不限于:帕瑞考昔、CELEBREX®和BEXTRA®或其药学上可接受的盐。[0355]可以与本发明的化合物组合使用的血管生成抑制剂包括、但不限于：内皮它汀、ukrain、豹蛙酶、頂862、5_甲氧基-4-[2-甲基-3-3-甲基-2-丁烯基环氧乙烷基]-1-氧杂螺环[2，5]辛-6-基（氯乙酰基）氨基甲酸酯、aceyldinanaline、5-氨基-1-[[3，5-二氯Ια-氯苯甲酰基）_苯基]甲基]-1H_1，2,3-三唑-4-甲酰胺、CM101、角鲨胺、布考它汀、RPI4610、NX31838、硫酸盐化甘露糖戊糖磷酸盐（sulfatedmannopentaosephosphate、7，7-羰基-二[亚氨基-N-甲基-4，2-吡咯羰基亚氨基[N-甲基-4，2-吡咯]-羰基亚氨基]_二_1，3-萘二磺酸酯）、和3-[2，4-二甲基吡咯-5-基亚甲基]-2-二氢吲哚酮SU5416。[0356]可以与本发明的化合物组合使用的酪氨酸激酶抑制剂，包括但不限于N-三氟甲基苯基）-5-甲基异噁唑-4-甲酰胺、3-[2,4-二甲基吡咯-5-基）亚甲基）二氢吲哚-2-酮、17-稀丙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素、4-3-氯-4-氟苯基氨基-7-甲氧基-6-[3-4-吗啉基）丙氧基]喹唑啉、N-3-乙炔基苯基）-6，7_二（2-甲氧基乙氧基）-4-喹唑啉胺、BIBX1382、2，3，9，10，11，12-六氢-10-轻基甲基-10-羟基-9-甲基-9，12-环氧-IH-二吲哚并[l，2,3-fg:3’，2’，1’-kl]吡咯并[3,4-i][1，6]苯并二氮杂环辛间四烯-1-酮、SH268、染料木素、伊马替尼（STI571、CEP2563、4-3-氯苯基氨基-5,6-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶甲磺酸酯、4-3-溴-4-羟基苯基氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、4-4’-羟基苯基氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、31]6668、31'1571厶、14-氯苯基-4-4-吡啶基甲基）-1-酞嗪胺、和EMD121974。[0357]在本发明的组合物和方法中还包括与除抗癌化合物之外的化合物的组合。例如，本发明要求保护的化合物与PPAR-γ即，PPAR-γ激动剂和PPAR-δ即，PPAR-δ激动剂的组合可以用于治疗某些恶性肿瘤。PPAR-γ和PPAR-δ是核过氧化物酶体增生子-活化的受体γ和δ。在文献中已经报道了PPAR-γ在内皮细胞上进行表达并且参与血管生成（参见J.Cardiovasc.Pharmacol.31:909-9131998；.Biol.Chem.274:9116-91211999OpMhahoJKis.Sci.41:2309-23172000。最近，已经表明PPAR-γ激动剂可在体外抑制对VEGF的血管生成响应；曲格列酮和罗格列酮马来酸盐都可以抑制小鼠视网膜新血管形成的发育C4roh.119:709-7172001。可以与本发明的化合物组合使用的PPAR-γ激动剂和PPAR-γa激动剂的实例包括、但不限于:噻唑烷二酮类如DRF2725、CS-011、曲格列酮、罗格列酮、和吡格列酮）、非诺贝特、吉非贝特、氯贝特、GW2570、SB219994、AR-H039242、JTT-501、MCC-555、GW2331、GW409544、NN2344、KRP297、NP0110、DRF4158、NN622、GI262570、PNU182716、DRF552926、2-[5,7-二丙基-3-三氟甲基-l，2-苯并异噁唑-6-基氧基]-2-甲基丙酸（公开在USSN09782,856中）和2⑻-7-3-2-氯-4-4-氟苯氧基苯氧基）丙氧基-2-乙基色满-2-甲酸（公开在USSN60235，708和60244,697中）。[0358]本发明另一个实施方案是本发明所公开的化合物与基因疗法组合用于治疗癌症的用途。治疗癌症的遗传学策略的综述可参见Hall等人0½丑™Genet61:785-789，1997和Kufe等人（CancerMedicine,第5版，第876-889页，BCDecker,Hamilton2000。可以用基因疗法来传递任何抑制肿瘤的基因。此类基因的实例包括、但不限于:p53其可以通过重组病毒-介导的基因转移来递送例如参见美国专利号6,069,134、uPAuPAR拮抗剂（“uPAuPAR拮抗剂腺病毒介导的传递抑制了小鼠体内依赖于血管生成的肿瘤生长和扩散（Adenovirus-MediatedDeliveryofauPAuPARAntagonistSuppressesAngiogenesis-DependentTumorGrowthandDisseminationinMice’’GeneTherapy,8月58:1105-131998、以及γ干扰素（I腦164:217-2222000。[0359]本发明的化合物还可以与固有的多药抗药性MDR抑制剂，特别是与运载蛋白表达水平高有关的MDR抑制剂组合施用。此类MDR抑制剂包括P-糖蛋白（P-gp的抑制剂，如1^335979、父1?9576、0：144-093、1?101922、¥父853和？5〇833伐司朴达）。[0360]本发明的化合物可以与用于治疗恶心或呕吐的止吐药联用，所述的呕吐包括急性、延迟的、晚期、和前期发生的（anticipatory呕吐，其可能是由于单独使用本发明的化合物或者将本发明的化合物与放疗联用所导致的。为了预防或治疗呕吐，可以将本发明的化合物与其他止吐药，尤其是神经激肽-1受体拮抗剂、5HT3受体拮抗剂，如奥坦西隆、格拉司琼、托卩比西隆、和zatisetron、GABAB受体激动剂，如巴氯芬、皮质类固醇如地卡特隆地塞米松）、曲安缩松、Aristocort、鼻松Nasalide、Preferid、Benecorten或其他试剂如在美国专利2,789，118、2,990,401、3,048,581、3，126,375、3,929,768、3,996,359、3,928,326和3,749,712中所公开的试剂、抗多巴胺能药，如吩噻嗪类试剂例如丙氯拉嗪、氟奋乃静、硫利哒嗪和美索达嗪）、甲氧氯普胺或屈大麻酚联用。在一个实施方案中，施用选自神经激肽1受体拮抗剂、5HT3受体拮抗剂和皮质类固醇的抗呕吐剂，所述抗呕吐剂作为在施用本发明的化合物后可以导致治疗或预防呕吐的佐剂。[0361]与本发明化合物联用的神经激肽-1受体拮抗剂被充分描述在下列参考文献中，例如：美国专利号5,162，339、5,232,929、5,242,930、5,373，003、5,387,595、5,459,270、5，494,926、5,496,833、5,637,699、5,719，147;欧洲专利公开号EP0360390、0394989、0428434、0429366、0430771、0436334、0443132、0482539、0498069、0499313、0512901、0512902、0514273、0514274、0514275、0514276、0515681、0517589、0520555、0522808、0528495、0532456、0533280、0536817、0545478、0558156、0577394、0585913、0590152、0599538、0610793、0634402、0686629、0693489、0694535、0699655、0699674、0707006、0708101、0709375、0709376、0714891、0723959、0733632和0776893;PCT国际专利公开号WO9005525、9005729、9109844、9118899、9201688、9206079、9212151、9215585、9217449、9220661、9220676、9221677、9222569、9300330、9300331、9301159、9301165、9301169、9301170、9306099、9309116、9310073、9314084、9314113、9318023、9319064、9321155、9321181、9323380、9324465、9400440、9401402、9402461、9402595、9403429、9403445、9404494、9404496、9405625、9407843、9408997、9410165、9410167、9410168、9410170、9411368、9413639、9413663、9414767、9415903、9419320、9419323、9420500、9426735、9426740、9429309、9502595、9504040、9504042、9506645、9507886、9507908、9508549、9511880、9514017、9515311、9516679、9517382、9518124、9518129、9519344、9520575、9521819、9522525、9523798、9526338、9528418、9530674、9530687、9533744、9605181、9605193、9605203、9606094、9607649、9610562、9616939、9618643、9620197、9621661、9629304、9629317、9629326、9629328、9631214、9632385、9637489、9701553、9701554、9703066、9708144、9714671、9717362、9718206、9719084、9719942和9721702;和英国专利公开号2266529、2268931、2269170、2269590、2271774、2292144、2293168、2293169、和2302689。在上述专利和公开中对此类化合物的制备进行了充分描述，这些专利和公开通过引用并入本文。[0362]在一个实施方案中，与本发明化合物联用的神经激肽-1受体拮抗剂选自：2_〇?-卜⑻-3，5_二二氣甲基苯基）乙氧基_3_⑸-4-氣苯基_4_3-5-氧代-IH，4H_1，2，4-三唑并）甲基吗啉或其药学上可接受的盐，在美国专利号5,719，147中对其进行了描述。[0363]本发明的化合物还可以与用于治疗贫血的试剂一起施用。此类贫血治疗剂是例如连续的红细胞生成受体活化剂如阿尔法依伯汀）。[0364]本发明的化合物还可以与用于治疗嗜中性粒细胞减少症的试剂一起施用。此类嗜中性粒细胞减少症治疗剂是例如，调节嗜中性粒细胞的产生和功能的造血生长因子，如人粒细胞集落刺激因子G-CSFX-CSF的实例包括非格司亭和PEG-非格司亭。[0365]本发明的化合物还可以与免疫增强药物如左旋咪唑、异丙肌苷和日达仙）一起施用。[0366]本发明的化合物也可用于与其他SiNA疗法组合用于治疗或预防肝脏疾病或癌症。[0367]本发明的化合物还可以与γ-分泌酶抑制剂和或NOTCH信号传递的抑制剂组合施用。此类抑制剂包括在WO0190084、W00230912、W00170677、W003013506、W00236555、W003093252、W003093264、W003093251、W003093253、W02004039800、W02004039370、W02005030731、W02005014553、USSN10957，251、W0200408991I、W002081435、W002081433、W003018543、W02004031137、W02004031139、W02004031138、W02004101538、W02004101539和WO0247671中所述的化合物（包括LY-450139。[0368]本发明的化合物还可以与PARP抑制剂组合用于治疗或预防癌症。[0369]本发明的化合物还可以与下面的治疗剂组合用于治疗癌症：阿巴瑞克Plenaxisdepot®;阿地白介素（Prokine®;阿地白介素（Proleukin®;AlemtuzumabbCampath®;阿利维A酸Panretin®;别噪醇Zyloprim®;六甲密胺Hexalen®;氨磷汀Ethyol®;阿那曲挫Arimidex®;三氧化二砷Trisenox®;天门冬酰胺酶Gilspar®;阿扎胞苷Vidaza;苯达莫司汀盐酸盐（Treanda®;bevacuzimabAvastin®;贝沙罗汀胶囊（Targretin®;贝沙罗汀凝胶TargretirT;博来霉素Blenoxane®;bortezomibVelcade®;brefeldinA;静脉内的白消安Busulfex®;口服的白消安Myleran®;卡普睾酮Methosarb®;卡培他滨Xeloda®;卡铂Paraplatin®;卡莫司汀BCNU'BiCNlT;卡莫司汀Gliader;使用Polifeprosan20Implant的卡莫司汀（GliadelWafer®;赛拉考昔（Celebrex®;西安昔单抗Erbitux®;苯丁酸氮芥Leukeran®;顺铀Platinol®;克拉屈滨Leustatin®，2_CdA®;clofarabineClolar®;环磷酰胺（Cytoxan®，Neosar®;环磷酰胺（CytoxanInjection®;环磷酰胺（CytoxanTablet®;阿糖胞苷（Cytosar-U®;阿糖胞苷脂质体DepoCyt®;达卡巴嗪（DTIC-Dome®;更生霉素，放线菌素DCosmegene;达肝素钠注射液Fragmin®;促红细胞生成素DarbepoetinalfaAranesp®;达沙替尼（Sprycel®;柔红霉素脂质体（DanuoXomee;柔红霉素，柔毛霉素（柔红霉素®;柔红霉素，柔毛霉素Cerubidine®;degarelixFirmagon®;地尼白介素-毒素连接物（DenileukindiftitoxOntak®;右雷佐生（ZinecarcT;右丙亚胺盐酸盐（Totect®;didemninB;17_DMAG;多西紫杉醇（Taxotere®;多柔比星（AdriamycinPFS®;多柔比星（Adriamycin®，Rubex®;多柔比星AdriamycinPFSInjection®;多柔比星脂质体Doxil®;丙酸屈他雄酮（Dromostanolone®;丙酸屈他雄酮（MasteroneInjection®;艾库组单抗注射液Soliris®;Elliott’sB溶液（Elliott’sBSolution®;伊屈泼帕（Promacta®;表柔比星Ellence®;阿尔法依泊汀epogen®;埃罗替尼Tarceva®;雌莫司汀Emcyt®;炔雌醇;磷酸依托泊苷Btopophos®;依托泊苷，VP-16Vepesid®;依维莫司片剂Afinitor®;依西美坦AromasirT;ferumoxytolFerahemeInjection®;非格司亭（NeupogerT;氣尿苷（动脉内的）（FUDR®;氟达拉滨（Fludara®;氟尿喃啶，5-FUAdrucil®;氟维司群Faslodex®;吉非替尼（Iressa®;格尔德霉素；吉西他滨Gemzar®;吉姆单抗奥佐米星gemtuzumabozogamicinMylotarg®;醋酸戈舍瑞林（ZoladexImplant®;醋酸戈舍瑞林（Zoladex®;醋酸组氨瑞林（Histrelinimplant®;轻基脲（Hydrea®;替伊莫单抗Zevalin®;伊达比星（Idamycin®;异环磷酰胺（IFEX®;甲磺酸伊马替尼Gleevec®;干扰素a2aRoferonA®;干扰素a-2bIntronA®;碘节胍123注射液AdreView®;依立替康Camptosar®;伊沙匹隆（Ixempra®;拉帕替尼片剂Tykerb®;雷利度胺RevlimicT;来曲卩坐Femara®;亚叶酸Wellcovorin®,LeucovorirT;醋酸亮丙瑞林Eligard®;左旋咪挫Brgamisol®;罗莫司汀，CCNUCeeBUe;二氯甲基二乙胺，氮芥Mustargen®;醋酸甲地孕酮（]^8〇^;美法仑，1^-?4]\1411^111，；疏基噪呤，6-]\^?111'；[1161:1101，；美司钠Mesnex®;美司钠Mesnextabs®;甲氨蝶呤Methotrexate®;甲氧沙林（Uvadex®;8-甲氧基补骨脂素;丝裂霉素CMutamycine;米托坦Lysodren®;米托蒽醌Novantrone®;光辉霉素（mitramycin;苯丙酸诺龙（Durabolin-50®;奈拉滨（Arranon®;尼洛替尼Tasigna®;诺非单抗Verluma®;ofatumumabArzerra®;奥普瑞白介素Neumega®;奥沙利铀（Eloxatin®;紫杉醇（Paxene®;紫杉醇（Taxol®;紫杉醇蛋白结合的微粒Abraxane®;帕利夫明（Kepivance®;氨轻二磷酸二钠Aredia®;帕尼单抗Vectibix®;帕挫帕尼片剂（Votrienttm®;培加酶（AdagenPegademaseBovine®;天门冬酰胺酶Oncaspar®;聚乙二醇非格司亭Neulasta®;培美曲塞二钠Alimta®;喷司他丁Nipent;昵泊溴烧Vercyte®;普乐沙福Mozobil®;普卡霉素，光辉美塞Mithracin®卜吩姆钠Photofrin®;普拉曲沙注射液Folotyn®;丙卡巴肼Matulane®;奎那克林Atabrineβ;雷帕霉素;拉布立酶EliteO;盐酸雷洛昔芬Evistae;利妥昔单抗RituxarO;罗米地辛（Istodax®;罗米司亭Nplate®;沙格司亭Leukine®;沙格司亭Prokine®;索拉非尼Nexavar®;链佐星Zanosar®;苹果酸舒尼替尼（Sutent®;滑石粉Sclerosol®;他莫昔芬Nolvadex®;替莫卩坐胺Temodar®;替西罗莫司（Torisel®;替尼泊昔，VM-26Vumon;睾内酯（Teslac®;硫鸟噪呤，6_TGThioguanine®;疏基噪呤；噻替昵（Thioplex®;托泊替康Hycamtin®;托瑞米芬Fareston®;托西莫单抗Bexxar®;托西莫单抗1-131托西莫单抗Bexxar®;反式维甲酸；曲妥单抗Herceptin®;维甲酸，ATRAVesanoide;三乙撑蜜胺；乌拉莫司汀UracilMustardCapsules®;戊柔比星Valstar®;长春碱Velban;长春新碱Oncovin®;长春瑞滨Navelbine®;伏立诺他Zolinza®;渥曼青霉素;和挫来膦酸盐Zometa®。[0370]上文提及的组合可以方便地呈现用于以药物制剂的形式使用，并且因此包括如上定义的组合连同药学上可接受的稀释剂或载体的药物组合物代表本发明的一个进一步方面。[0371]此类组合的个别化合物可以在分开或组合药物制剂中顺次或同时施用。在一个实施方案中，个别化合物将在组合药物制剂中同时施用。[0372]因此，所描述的分子可以与一种或多种已知化合物、治疗或程序组合用于预防或治疗如本领域已知的受试者或生物中疾病、病症、状况和性状，例如其他HBV抑制剂。[0373]3.治疗应用[0374]HBV研究中现有的大量知识指出需要可以调节HBV表达用于治疗用途的方法。[0375]因此，本发明的一个方面包括治疗受试者包括但不限于患有HBV感染或状况的人的方法，所述状况通过HBV基因表达的作用介导，所述方法包括给所述受试者施用有效量的本发明的双链SiNA分子。在该方面的一个实施方案中，SiNA分子包括至少一个SEQIDNO:1、SEQIDN0:452、SEQIDN0:2、SEQIDN0:453、SEQIDN0:3、SEQIDN0:454、SEQIDN0:4或SEQIDN0:455;或式㈧中的15个核苷酸序列。[0376]在该方面的一些实施方案中，状况是癌症。因此，在某些实施方案中，本发明的分子和组合物用于治疗癌症，和特别是治疗肝细胞癌HCC的方法中。[0377]在一些实施方案中，状况是肝脏疾病。因此，在某些实施方案中，本发明的分子和组合物用于治疗肝脏疾病，和特别是治疗肝硬化的方法中。[0378]在某些实施方案中，SiNA分子的施用是经由局部施用或全身施用的。在其他实施方案中，本发明的特征在于例如经由肺递送经由给相关组织或细胞例如肺细胞和组织的局部施用，使受试者或生物与本发明的SiNA分子接触。在另外其他的实施方案中，本发明的特征在于经由给相关组织或细胞的全身施用（例如经由SiNA的静脉内或皮下施用）使受试者或生物与本发明的SiNA分子接触，所述组织或细胞例如受试者或生物中的肝脏、癌组织或细胞。[0379]本发明的siNA分子还用作先体外后体内应用中的试剂。例如，为了疗效将siNA试剂引入移植到受试者内的组织或细胞内。细胞和或组织可以得自随后接受外植体的生物或受试者，或可以得自移植前的另一种生物或受试者。SiNA分子可以用于调节细胞或组织中的一种或多种基因的表达，从而使得细胞或组织当体内移植时获得所需表型或能够行使功能。在一个实施方案中，从患者中提取某些HBV目标细胞。在适合于经由这些细胞摄取SiNA的条件下（例如，使用递送试剂例如阳离子脂质、脂质体等，或使用技术例如电穿孔以促进SiNA递送到细胞内），使这些提取的细胞与靶向细胞内的特定核苷酸序列的HBVSiNA接触。随后将细胞再引回到相同患者或其他患者内。[0380]对于治疗应用，给受试者施用药学有效剂量的本发明的SiNA分子或药物组合物。药学有效剂量是预防、抑制疾病状态发生、或治疗使症状减轻至某一程度，优选所有症状）疾病状态所需的那种剂量。本领域技术人员可以容易地决定待施用于给定受试者的治疗有效剂量的本发明的siNA，通过考虑下述因素，例如受试者的大小和重量，疾病进展或穿透的程度，受试者的年龄、健康和性别，施用途径和施用是局部还是全身的。一般地，取决于带负电荷聚合物的效力，施用0.1ygkg-100mgkg体重天的活性成分量。可以从患者体内的药物累积的测量计算最佳给药时间安排。本发明的SiNA分子可以在单次剂量或多次剂量中施用。[0381]本发明的SiNA分子的施用可以每月一次，每周一次，每天一次QD，或者分为每月多次剂量，每周多次剂量，或每日多次剂量，如，例如，但不限于，每天两次BID、每日三次TID，每两周一次。本领域普通技术人员可以基于药物在体液或组织中测量的停留时间和浓度很容易地估计给药的重复率。[0382]此外，施用可以是连续的，即每隔一天或间歇性地。例如，本发明的化合物的间歇性施用可以每周1-6天施用，它可以意味着周期性施用（例如，每天施用连续的2-8周，然后不施用最长达一周的休息时间），或者它可以意味着隔天地施用。[0383]G.施用[0384]组合物或制剂可以以多种方式施用。本发明的施用方法的非限制性实例包括经口、经颊、舌下、肠胃外（即关节内、静脉内、腹膜内、皮下或肌内）、局部直肠施用或其他局部施用。在一个实施方案中，本发明的组合物可以通过吹入和吸入施用。施用可以经由单次或分份剂量完成。在一些实施方案中，药物组合物通过大剂量注射进行静脉内或腹膜内施用参见例如，美国专利号5,286,634。脂质核酸颗粒可以通过直接注射在疾病部位或通过注射在远离疾病部位的部位进行施用（参见例如，Culver，HUMANGENETHERAPY，MaryAnnLiebert，Inc·,Publishers，NewYork.第70-71页（1994。在一个实施方案中，本发明的SiNA分子及其制剂或组合物如本文描述和如本领域一般已知的施用于细胞、受试者或生物。[0385]1.体内施用[0386]在本发明的任何一种治疗方法中，SiNA可以如本文所描述的或本领域其他方面已知的全身性地给受试者施用，单独作为单一疗法或与本文描述的或本领域已知的另外疗法组合。全身施用可以包括例如，如本领域一般已知的肺吸入、喷雾法等静脉内、皮下、肌内、导管插入、鼻咽、经皮和或经口胃肠施用。[0387]在本发明的任何一种治疗或预防方法中，SiNA可以如本文描述的或本领域其他方面已知的局部地施用于受试者或施用于局部组织，单独作为单一疗法或与本领域已知的另外疗法组合。局部施用可以包括例如，如本领域一般已知的吸入、喷雾法、导管插入、植入、直接注射、皮肤经皮应用、贴剂、支架、滴耳剂滴眼剂、或门静脉施用于相关组织，或任何其他局部施用技术、方法或程序。[0388]在一个实施方案中，本发明的SiNA分子及其制剂或组合物如本领域一般已知的施用于肝脏（参见例如Wen等人，20CmricGastroenteroi.，10,244_9;Murao等人，2002，Pharffii?es.，19,1808-14;Liu等人，2003，ganeTher.，10,180-7;Hong等人，2003，PharffiPharffiacoJ.，54，51-8;Herrmann等人，2004，Arc_hKiroJ.，149，1611-7;和Matsuno等人，2003,ge_neTAer.,10,1559-66〇[0389]在一个实施方案中，本发明的特征在于将本发明的siNA分子递送给造血细胞，包括单核细胞和淋巴细胞的方法的用途。这些方法由Hartmann等人，1998，.PhaffiacoJ.p.Ther.，2852，920-928;Kronenwett等人，1998，B]ood，913，852-862;Filion和Phillips，1997,Biochin.Biopi^s.4cia.，13292，345-356;Ma和Wei，1996，LeuA.i?es.,201112，925-930;和Bongartz等人，1994，iVucJeicAcidsResearch，2222，4681-8详细描述。[0390]在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物如本领域一般已知的直接或局部性地例如，局部地施用于真皮或滤泡参见例如Brand，2001，Curr.Opin.MoJ.Tier.，3，244-8;Regnier等人，1998，.Target，5，275-89;Kanikkannan，2002，Bioftrugs，16，339-47;Wraight等人，2001,3AarffiacoJ.Tier.，90，89-104;和Preat和Dujardin，2001，STPPharmaSciences，11，57-68。在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物直接或局部性地施用，其中使用包含醇例如，乙醇或异丙醇）、水且任选包括另外试剂例如肉豆蔻酸异丙酯和卡波姆980的含水醇凝胶制剂。在其他实施方案中，siNA配制为局部性地施用于鼻腔。局部制剂可以通过每天一次或多次应用施用于受影响区域;在皮肤区域上可以有利地使用封闭敷料。连续或延长递送可以通过粘着储库系统实现。[0391]在一个实施方案中，本发明的SiNA分子离子电渗地例如施用于特定器官或区室例如，眼、眼后、心脏、肝、肾、膀胱、前列腺、肿瘤、CNS等）。离子电渗递送的非限制性实例在例如WO03043689和WO03030989中得到描述，所述专利完整地通过引用并入本文。[0392]在一个实施方案中，本发明的SiNA分子及其制剂或组合物如本文描述和如本领域一般已知的施用于肺。在另一个实施方案中，本发明的SiNA分子及其制剂或组合物如美国专利公开号20060062758;20060014289;和20040077540中所述施用于肺组织和细胞。[0393]2.气溶胶和递送装置[0394]a.气溶胶制剂[0395]单独或与其他合适组分组合的本发明的组合物可以制备成气溶胶制剂（S卩，它们可以“喷雾化”），以经由吸入例如，鼻内或气管内）施用参见，Brigham等人，山?2..Sci.，298:2781989。气溶胶制剂可以放置到增压可接受的推进剂内，例如二氯二氟甲烷、丙烧、氣等。[0396]在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂经由肺递送施用，例如通过经由吸入设备或喷雾器施用的气溶胶或喷雾干燥制剂的吸入，从而提供核酸分子快速的局部摄取进入相关肺组织内。包含微粉化核酸组合物的可吸收干燥颗粒的固体微粒组合物可以通过下述制备:将干燥或冷冻干燥的核酸组合物研磨，且随后使微粉化组合物通过例如400目筛以破碎或分出大聚集物。包含本发明的SiNA组合物的固体微粒组合物可以任选包含分散剂，所述分散剂用于促进气溶胶以及其他治疗化合物的形成。合适的分散剂是乳糖，其可以与核酸化合物以任何合适的比值例如按重量计的1:1比值掺合。[0397]包含本发明的siNA分子或组合物的喷雾组合物可以例如配制为水溶液或悬浮液，或配制为由增压包例如计量吸入器递送的气溶胶，其使用合适的液化推进剂。在一个实施方案中，适合于吸入的本发明的气溶胶组合物可以是悬浮液或溶液，并且一般包含SiNA分子和合适的推进剂，例如氟代烃或含氢含氯氟烃或其混合物，特别是氢氟烷，特别是1，1，1，2-四氟乙烷、1，1，1，2，3，3，3-六氟正丙烷或其混合物，所述SiNA分子包含至少一个下述的15个核苷酸序列：SEQIDNO:1、SEQIDNO:452、SEQIDNO:2、SEQIDNO:453、SEQIDNO:3、SEQIDN0:454、SEQIDN0:4、SEQIDN0:455;或式㈧。气溶胶组合物可以任选包含本领域众所周知的另外配制赋形剂，例如表面活性剂。非限制性实例包括油酸、卵磷脂或寡聚乳酸或衍生物例如W09421229和W09834596中所述的那些、和共溶剂例如乙醇。在一个实施方案中，本发明的药物气溶胶制剂包括本发明的化合物和氟代烃或含氢含氯氟烃或其混合物作为推进剂，任选与表面活性剂和或共溶剂组合。[0398]本发明的气溶胶制剂可以通过加入合适缓冲剂进行缓冲。[0399]气溶胶制剂可以包括任选的添加剂，包括防腐剂，如果制剂未制成无菌的。非限制性实例包括羟苯甲酯、抗氧化剂、调味剂、挥发性油、缓冲剂和乳化剂及其他制剂表面活性剂。在一个实施方案中，氟代烃或全氟代烃载体用于减少降解且提供本发明的组合物例如SiNA和或其LNP制剂更安全的生物相容性非液体微粒悬浮液。在另一个实施方案中，包括喷雾器的装置递送包括含氟化合物的本发明的组合物例如SiNA和或其LNP制剂），所述含氟化合物是抑菌的，从而减少在相容装置中的微生物生长可能性。[0400]可以配制用于在例如胶质的吸入器或吹入器中使用的包含本发明组合物的胶囊和药液筒，其包含用于吸入本发明的化合物和合适粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。在一个实施方案中，每个胶囊或药液筒包含SiNA分子和一种或多种赋形剂，所述SiNA分子包含至少一个下述的15个核苷酸序列：SEQIDN0:1、SEQIDN0:452、SEQIDN0:2、SEQIDN0:453、SEQIDN0:3、SEQIDN0:454、SEQIDN0:4、或SEQIDN0:455,或式（A。在另一个实施方案中，本发明的化合物可以不含赋形剂例如乳糖呈现。[0401]本发明的气溶胶组合物可以作为包括可吸收大小的颗粒的制剂施用到呼吸系统内，例如大小足够小的颗粒以在吸入后经过鼻、口和喉以及通过肺的支气管和肺泡。一般而言，可吸收颗粒大小范围为约0.5-10微米。在一个实施方案中，颗粒范围可以是1-5微米。在另一个实施方案中，颗粒范围可以是2-3微米。包括在气溶胶中的不可吸收大小的颗粒倾向于沉积在喉中且被吞咽，并且气溶胶中不可吸收颗粒的量因此降到最低。对于鼻施用，10-500um范围的粒度是优选的，以确保保留在鼻腔中。[0402]在一些实施方案中，本发明的SiNA组合物局部施用于鼻例如用于治疗鼻炎，经由增压气溶胶制剂，通过增压栗或通过喷雾化施用于鼻的水性制剂。合适的制剂包含水作为稀释剂或载体用于这个目的。在某些实施方案中，用于将本发明的组合物施用于肺或鼻的水性制剂可以与常规赋形剂例如缓冲剂、张度修饰剂等一起提供。[0403]b.装置[0404]本发明的SiNA分子可以如上文讨论的作为颗粒和或气溶胶进行配制且递送，并且通过本领域技术人员已知的多种气溶胶化aerosolization装置进行分配。[0405]包含本发明的SiNA分子或制剂的液体或非液体颗粒的气溶胶可以通过任何合适的方法产生，例如用包括喷雾器的装置参见例如U.S.Pat.4,501，729，例如超声或空气喷射喷雾器。[0406]包含本发明的SiNA分子或制剂和表面活性剂的固体颗粒气溶胶可以用任何固体微粒气溶胶发生器来生产。与本发明的SiNA分子一起使用的一类固体微粒气溶胶发生器是吹入器。第二种类型的举例说明性气溶胶发生器包含计量剂量吸入器"MDI"。包含本文教导的siNA分子或制剂的MDI可以通过本领域方法进行制备（例如参见Byron上文和W09632099〇[0407]siNA分子也可以被配制为用于从液体分配器递送的液体制剂，如W005044354中所述和所示的那些。[0408]在本发明的某些实施方案中，喷雾器装置在用于有意识、自主呼吸的受试者和用于所有年龄的控制换气ventilated受试者的应用中使用。喷雾器装置可以用于对于肺的靶向局部和全身性药物递送。在一个实施方案中，包括喷雾器的装置用于将本发明的siNA分子或制剂局部递送至肺或肺组织。在另一个实施方案中，包括喷雾器的装置用于全身地递送本发明的siNA分子或制剂。[0409]H.本发明的siNA分子的其他应用用途[0410]本发明的siNA分子还可以用于诊断应用、研究应用和或试剂制备。[0411]在一个方面，本发明的特征在于用于诊断受试者中的疾病、性状或状况的方法，其包括在适合于诊断受试者中的疾病、性状或状况的条件下，给受试者施用本发明的组合物。[0412]在一个实施方案中，本发明的siNA分子用于下调或抑制起于单倍型多态性的HBV蛋白质的表达，所述单倍型多态性与受试者或生物中的性状、疾病或状况相关。HBV基因、或HBV蛋白质或RNA水平的分析可以用于鉴定具有此类多态性的受试者或处于发展本文描述的性状、状况或疾病的危险中的那些受试者。这些受试者顺应此类治疗，例如用本发明的siNA分子和在治疗与目标基因表达相关的疾病中有用的任何其他组合物的治疗。因此，HBV蛋白质或RNA水平的分析可以用于确定受试者治疗中的治疗类型和疗程。HBV蛋白质（例如，乙型肝炎核心抗原，或HbcAg、HBV表面抗原（例如，HBsAg或RNA水平的监测可以用于预测治疗结果和测定化合物和组合物的效力，所述化合物和组合物调节与性状、病症、状况或疾病相关的某些HBV蛋白质的水平和或活性。[0413]在另一个实施方案中，本发明包括根据本发明的双链核酸用于在药物制备中使用的用途。在一个实施方案中，药物用于在治疗通过HBV的作用介导的HBV感染或状况中使用。在一个实施方案中，药物用于在治疗HBV感染中使用。在一些实施方案中，药物用于在治疗癌症中使用。在一个特定的实施方案中，本发明的化合物用于治疗肝细胞癌。在一个实施方案中，药物用于在治疗肝癌中使用。在一个特定的实施方案中，本发明的化合物用于治疗肝硬化。[0414]在某些实施方案中，其中至少一条链包含SEQIDN0:1、SEQIDN0:452、SEQIDN0:2、SEQIDN0:453、SEQIDN0:3、SEQIDN0:454、SEQIDN0:4或SEQIDN0:455;或式㈧中的至少一个15个核苷酸序列的siNA用于在治疗HBV感染的方法中使用。[0415]在某些实施方案中，其中至少一条链包含SEQIDN0:1、SEQIDN0:452、SEQIDN0:2、SEQIDN0:453、SEQIDN0:3、SEQIDN0:454、SEQIDN0:4或SEQIDN0:455;或式A中的至少一个15个核苷酸序列的siNA用于在治疗癌症的方法中使用。[0416]在某些实施方案中，其中至少一条链包含SEQIDN0:1、SEQIDN0:452、SEQIDN0:2、SEQIDN0:453、SEQIDN0:3、SEQIDN0:454、SEQIDN0:4或SEQIDN0:455;或式A中的至少一个15个核苷酸序列的siNA用于在治疗肝脏疾病的方法中使用。[0417]I.实施例[0418]本发明现在将由下述非限制性实施例进行举例说明。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修饰的多种非关键参数，以产生基本相同的结果。[0419]实施例1:针对HBV有活性的SiNA的设计、合成和鉴定[0420]HBVsiNA分析[0421]设计和合成一系列siNA分子并评价其针对HBV基因表达的效力。通过从HBV基因组血清型adw2登记号X02763选择所有可能的19个核苷酸序列，然后将这些序列与表7中显示的22种其他HBV亚型的基因组序列相比较而设计并选择HBV序列。保留了与所有22个基因组具有完美匹配，或在22个基因组的21个中具有完美匹配，或与剩余的基因组具有1个或2个错配的19个核苷酸序列。这些序列进行标准过滤器例如，对人基因组的脱靶，相同碱基的运行，与人miRNA种子序列的匹配）（关于序列设计方法和标准过滤器，参见美国专利申请号60182,605。通过专用沉默预测评分aproprietarysilencingpredictionscore分选剩余的候选并选择某些序列。[0422]对于设计人siNA的HBV序列的主要标准是⑴多种HBV基因型和血清型之间的同源性和（ii通过专有算法确定的高效力评分。选择的siNA的目标序列如表Ia目标序列）中所示。对应于表Ia中的目标序列的siNA序列的有义和反义链如表Ib中所示。合成的各种化学修饰的siNA如表Ic中所示。[0423]表la:HBV目标序列，注明目标位点。[0427]表lb.对应于表Ia中鉴定的目标序列的各种HBVSiNA有义和反义序列。[0428][0429][0430]对于目标序列的每种寡核苷酸，使用固相合成分开合成SiNA的2条单个的、互补链，随后通过反相固相萃取（SPE分开进行纯化。使互补链退火以形成双链双链体），且以所需浓度和在选择的缓冲剂中进行递送。[0431]简言之，使用本领域通常已知的程序使用亚磷酰胺化学法在自动化固相合成仪上合成单链寡核苷酸（参见例如美国申请号12064,014。将合成柱装填由第一个核苷残基自然或化学修饰的）衍生的固体支持体。通过酸不稳定的5’-0_二甲氧三苯甲基的脱三苯甲基作用以释放5’-羟基来起始合成。将溶于乙腈的合适的受保护的亚磷酰胺和合适的活化剂同时递送给合成柱，从而导致亚磷酰胺amidite与5’-羟基的偶联。随后用溶剂如乙腈洗涤柱。将氧化溶液如碘溶液栗过柱以使亚磷酸三酯键PIII氧化成其磷酸三酯PV类似物。在2，6-二甲基吡啶和N-甲基咪唑的存在下，未反应的5羟基使用试剂例如乙酸酐进行加帽。对于下一个亚磷酰胺掺入，延伸循环由脱三苯甲基作用步骤重新开始。重复这个过程直至所需序列合成。用最后的5’-末端保护基团（三苯甲基或5’-0-二甲氧三苯甲基终止合成。[0432]—旦合成结束，就使固体支持体和结合的寡核苷酸在氩压力或真空下干燥。添加水性碱且使混合物加热，以实现琥珀酰键的切割，氰乙基磷酸保护基团的去除和环外胺保护的脱保护。[0433]对不包含核糖核苷酸的单链进行下述过程。用水性碱处理固体支持体后，过滤混合物以使固体支持体和脱保护的粗合成材料分开。随后用水漂洗固体支持体，将其与滤液组合。获得的碱性溶液允许保有5’-0-二甲氧三苯甲基基团，以保留在5’末端位置上三甲苯基存在）。[0434]对包含核糖核苷酸的单链进行下述过程。用水性碱处理固体支持体后，过滤混合物以使固体支持体和脱保护的粗合成材料分开。随后用二甲亚砜DMSO漂洗固体支持体，将其与滤液组合。将氟化物试剂例如三氢氟酸三乙胺加入混合物中，并使溶液加热。用合适的缓冲液淬灭反应，以提供在最后的5’末端位置上具有5’-O-二甲氧三苯甲基基团的粗制单链的溶液。[0435]每种粗制单链的三苯甲基存在溶液使用层析纯化例如SPERPC纯化进行纯化。三苯甲基基团的疏水性质允许所需全长寡核苷酸比非三苯甲基化的截短的失败序列的更强保留。失败序列用合适溶剂例如低百分比的乙腈从树脂中选择性洗涤。保留的寡核苷酸随后用三氟乙酸在柱上进行脱三苯甲基，以去除酸不稳定的三苯甲基基团。从柱中洗涤残留酸，进行盐交换，并且开始材料的最后脱盐。全长寡核苷酸用水性-有机溶剂以纯化的形式回收。最终产物随后就纯度HPLC、同一性Maldi-TOFMS和得率UVA26q进行分析。寡核苷酸经由冷冻干燥或真空浓缩进行干燥。[0436]退火.·基于产物的分析，将干燥的寡核苷酸溶解于合适的缓冲液中，随后混合等摩尔量的使用理论消光系数计算的有义和反义寡核苷酸链。溶液随后通过层析法就双链体的纯度和所需终浓度进行分析。如果分析指出任一链的过量，那么滴定另外的非过量链直至双链体形成完成。当分析指出已达到目标产物纯度时，材料进行递送且准备用于使用。[0437]下表显示了使用这种方案合成的或者可以使用这种方案或使用本领域已知的方法合成的各种修饰的siNA。[0438]表Ic:合成的HBVSiNA链反义序列很容易被鉴定为与显示的目标序列具有完全或部分互补性）。[0439][0455][0456]其中：[0457]A、C、G、和U=核糖A、C、G或U[0458]4、。和11=2’-脱氧-2’-氟八、6、：或1][0459]△、仏㉔喂=2，-0-甲基（2，_0MeA、U、C、或G[0460]瓜i、C、和G=脱氧A、U、C、或G[0461]B=反向脱碱基[0462]T=胸苷[0463]s=硫代磷酸酯键。[0464]用于商业制备的进一步合成步骤[0465]—旦分析指出在退火步骤后已达到目标产物纯度，就将材料转移至切向流过滤TFF系统用于浓缩和脱盐，与在退火步骤之前完成这点成对比。[0466]超滤：退火的产物溶液使用包含合适的分子量截留膜的TFF系统进行浓缩。浓缩后，产物溶液经由渗滤使用Mi11i-Q水进行脱盐，直至滤液的传导性是水的那种。[0467]冷冻干燥:将浓缩的溶液转移至瓶，速冻且与冷冻干燥机连接。随后将产物冷冻干燥成粉末。从冷冻干燥机中取出瓶且现在准备用于使用。IQ468]起始筛选方案（9明I板转染[0469]细胞培养制备：[0470]人肝癌细胞系HepG2或小鼠肝癌细胞系Hepal-6在改良的Eagle培养基中生长。所有培养基都补充1〇%胎牛血清、1〇^81^链霉素、1001]1111青霉素和1%碳酸氢钠。[0471]转染和筛选[0472]生成质粒pSiCheck-HepB-Partial,RefID:1104，其中将部分HBV基因组插入pSiCheck2质粒Promega，Madison,WI的海肾荧光素酶基因下游的XtolWotl位点。然后表达HBV转录物上游的海肾荧光素酶mRNA转录物，因此，靶向针对HBV基因组并引起HBV转录物敲低的SiNA也将导致海肾荧光素酶转录物的敲低。可以通过直接测定海肾荧光素酶活性的量而确定海肾荧光素酶转录物的水平。质粒还表达萤火虫荧光素酶基因，该基因不受HBVSiNA影响，可用于将数据均一化以考虑转染进细胞中的质粒的量的任何变化。[0473]部分HBV基因组由adw2基因型AHBV病毒的2270ntnt158-2427,其中〇似位点是ntl组成。[0474]部分HBVDNA序列（SEQIDNO:503:[0475][0477]细胞以在IOOyL合适培养基中10000个细胞孔的最终计数在组织培养处理的、96孔板的所有孔中铺板。细胞在铺平板后在5%C02存在的情况下在37°C培养。[0478]第二天，如下制备包含siNA、pSiCheck-HepB_Partial质粒和LipofectamineInvitrogen的复合物。产生包含500nMsiNA和30ngul质粒的siNA和质粒的溶液。平行地，制备OPTI-MEM中33倍稀释的Lipofectamine的溶液。在RNAiMaxOPTI-MEM溶液于室温孵育5分钟后，对于每种siNA—起加入等体积的siNA溶液和RNAiMax溶液。[0479]混合导致siNARNAiMax的溶液，其中siNA的浓度为60nM，质粒的浓度为3.6ngy1。这种溶液在室温孵育20分钟。在孵育后，将20yL溶液加入每个相关孔中。每个孔中siNA的终浓度是10nM，质粒的终浓度是0.6ngyl。每个孔中Lipofectamine的终体积为0.3ul。[0480]对于12点剂量响应曲线研究，siNA系列为在30nM开始的6倍系列稀释或在40nM开始的4倍系列稀释。所有转染设置为多份生物重复。[0481]与Lipofectamine-siNA复合物孵育的时间为48小时，对于筛选和剂量响应曲线研究，在转染和收获之间的培养基中没有任何变化。[0482]荧光素酶测定[0483]将50μ1Dual-Glo™萤火虫试剂Promega，Madison,WI加入96孔板的每个孔中，然后将板在室温下孵育10分钟。然后使用萤光素酶方案在WallacEnvison酶标仪上读出萤火虫发光。将50μ11:100稀释的StopGlo底物（Promega,Madison,WI加入96孔板的每个孔中，然后将板在室温下孵育10分钟。然后使用萤光素酶方案在WallacEnvison酶标仪上读出海肾发光。[0484]计算[0485]使用比较法计算目的基因的表达水平和基因表达的％抑制%KD:[0486]L_萤火虫=log2萤火虫荧光光度）[0487]Lj每肾=log2海肾荧光光度）[0488]dL=L_萤火虫-Lj每肾[0489]ddLlog2倍数变化）=dL_siRNA-dL_NTC[0490]相对表达水平=2_ddL[0491]%KD=100XI-2_ddL〇[0492]除非另有说明，否则选择非靶向对照siNA作为针对其计算基因表达的百分比抑制敲低）的值，因为它是最相关的对照。[0493]另外，仅检查反映细胞的总体健康以及质粒和siNA的质量的均一化数据。这通过考察处理细胞中2种不同mRNA的水平来完成，第一种是目标mRNA，并且第二种是均一化物mRNA。这通过相对于关于整块板的萤火虫焚光均一化物的log2发光比较在每个孔中关于海肾荧光酶（目标的l〇g2发光来完成。这允许消除对于细胞具有潜在毒性而不是仅仅敲低目的基因的siNA。[0494]使用R.2.9.2软件进行IC5q的所有计算。使用用于简单配体结合的S形剂量应答变量斜度）方程分析数据。在百分比抑制（敲低）的所有计算中，相对于用非靶向对照（对照siNA处理的样品中的目的基因表达的均一化水平进行计算，除非另有说明。[0495]结果:[0496]如前所述设计且合成HBVsiNA。在用pSiCheck-HepB-Partial质粒转染的HepG2或Hepal-6细胞中筛选各种siNA。各种修饰的HBVsiNA处理后在人细胞中HBVmRNA表达水平的log2倍数变化表示在表3a和b中。使用荧光素酶测定方法在48hr进行每次筛选。[0497]表3a:在用pSiCheck-HepB-partial转染的HepG2细胞中的初始筛选数据η=2，记录为HBVmRNA表达水平的log2倍数变化）。[0501]表3b:在用pSiCheck-HepB-partial转染的HepG2细胞中的初始筛选数据η=2，记录为HBVmRNA表达水平的log2倍数变化）。[0505]将初始筛选中来自表3a和表3b的具有大log2倍数变化）的SiNA的亚组一式三份重设到单一96孔板上，并在用pSiCheck_HepB-partial转染的人HepG2细胞中再次筛选以验证敲低并直接比较在不同板上合成的SiNA。表4总结数据。基于HBVmRNA表达水平中的log2倍数变化对siNAs排序。[0506]表4.在重设板上测试的各种SiNA的Log2倍数变化）。[0509]在用pSiCheck-HepB-partial质粒转染的HepG2细胞中进一步分析从表4选择的高排序更大log2倍数变化值SiNA的功效和效力。用SiNA的1:6系列剂量滴定处理细胞以建立值。效力50是计算的产生50%目标mRNA敲除的SiNA转染浓度。这些SiNA的结果示于表5中。[0510]表5:在用口3;[01601^-!16口13-口31'1:131转染的!16口62-人肝癌细胞系中各种81嫩的剂量响应数据。从剂量响应曲线确定计算的最大log2倍数变化）。[0512]然后在过客链和引导链上以各种化学修饰合成基于来自表5的高排序更大log2倍数变化））值和低效力50值的先前筛选中鉴定的选择的顶级表现序列。然后在用口3；[01601-]^口13131'1：丨31转染的]^口31-6细胞中分析这些8丨财的功效和效力。各种修饰的HBVSiNA处理后在人细胞中HBVmRNA表达水平的log2倍数变化表示在表6A中。使用荧光素酶测定方法在48hr进行每次筛选。[0513]表6六。在用口5;[01601-!16口13-口31'1:丨31转染的!16口31-6细胞中领先优化的冊¥序列的初始筛选数据η=2，记录为HBVmRNA表达水平的log2倍数变化）。[0521]将初始筛选中来自表6a的具有大log2倍数变化）的SiNA的亚组一式三份重设到单一96孔板上，并在用口5;[01601^_!16口13-口31'1^31转染的小鼠!163口1-6细胞中再次筛选以验证敲低并直接比较在不同板上合成的siNA。表6B.总结数据。基于HBVmRNA表达水平中的log2倍数变化对siNAs排序。[0522]表6B.在重设板上测试的各种SiNA的Log2倍数变化）。[0526]在用口3;[01601^-!16。8131^31质粒转染的!16。31-6细胞中进一步分析从表613选择的高排序更大log2倍数变化值siNA的功效和效力^用以嫩的1:6系列剂量滴定处理细胞以建立值。效力50是计算的产生50%目标mRNA敲除的SiNA转染浓度这些SiNA的结果不于表6c中D[0527]表63:在用口3;[0^01^-^口8-口31^31转染的!^口31-6小鼠肝癌细胞系中各种81嫩的剂量响应数据。从剂量响应曲线确定计算的最大log2倍数变化。[0530]实施例2:确定SiNA的体外血清稳定性[0531]用H2O将SiNA重构为50μΜ-100μΜ储存溶液，并加入预先温热至37°C的人血清至终浓度为20ygmL。然后将混合物在37°C孵育0、1和2小时。在每个时间点结束时，通过用等体积的Phenomenex裂解-上样缓冲液混合而终止反应。通过Phenomenex固相萃取在96孔形式中纯化寡核苷酸，用LabconcoTriadLyo-00417冷冻干燥直至干燥。将冷冻干燥的样品重构在用无RNase的H2O制备的150yLImMEDTA中。然后用ImMEDTA将样品溶液稀释5倍用于ThermoFisherOrbitrap上的液相层析质谱LCMS分析。基于测得的分子量确定siNA的血清代谢物。[0532]实施例3:细胞因子诱导的测试[0533]为了评价装载在脂质纳米颗粒中的本发明的各种SiNA的免疫刺激效果例如，以4048210比例的DLinDMA胆固醇S-PEG-C-DMADSPC，通过尾静脉注射用LNP配制的siNA的单一3mpk剂量给药于C57B16小鼠。在给药后3和24小时收集血清或血浆样品。根据制造商的说明书，用来自AushonBiosciences的SearchLightIR细胞因子测定来测量在这些样品中的细胞因子和趋化因子水平。测量的细胞因子和趋化因子为IL-la、IL-li3、IL_6、KC、IL-10、IFNγ、TNF、GMCSF、MIP-1β、MCP-1JE和RANTES。[0534]实施例4:小鼠中的功效研究[0535]在具有人源化肝脏并随后用HBV注射的SCID小鼠中进行体内功效研究。用人原代肝细胞注射具有病变肝脏的转基因小鼠，这允许具有最高达70%人肝细胞的小鼠肝脏的增殖repopulation。然后用人HBV分离株接种小鼠。使用单一3mpk剂量用LNP封装siNA或媒介物对照经由尾静脉注射IV给药于感染的小鼠。在给药后各个时间点采集血清样品，然后通过qPCR测量血清中循环的HBV基因组的水平而确定siNA对病毒载量的影响。[0536]实施例5:在非人灵长类动物中的药效动力学研究[°537]通过静脉内输注用在装载siNA的脂质纳米颗粒的单一2.5mpk剂量给药于HBV感染的黑猩猩。为了监测HBV病毒载量，在给药前和后各个时间点采集血清样品，并通过qPCR确定HBV基因组的水平。所有程序符合USDA动物福利法案9CFR，第1、2和3部分）中所述的规定和TheGuideforCareandUseofLaboratoryAnimalsILARpublication,1996，NationalAcademyPress中指定的条件。[0538]实施例6:siNAsLNP制剂[0539]A.用于DLinDMA制剂的一般LNP方法描述:[0540]通过碰撞射流方法制备脂质纳米颗粒。通过将醇中溶解的脂质和柠檬酸盐缓冲液中溶解的SiNA混合形成颗粒。脂质与SiNA的混合比例的目标为45-55%脂质和65-45%siNA。脂质溶液含有在醇例如乙醇）中的阳离子脂质、辅助脂质胆固醇）、PEG例如PEG-C-DMA、PEG-DMG脂质和DSPC，浓度为5-15mgmL，目标为9-12mgmL。脂质比例对于阳离子脂质具有25-98的摩尔百分比范围，目标为35-65,辅助脂质具有0-75的摩尔百分比范围，目标为30-50，PEG脂质具有1-15的摩尔百分比范围，目标为1-6，DSPC具有0-15的摩尔百分比范围，目标为O-UdiNA溶液含有在柠檬酸钠缓冲的盐溶液中浓度范围为0.3至1.0mgmL目标为0.3-0.9mgmL的一种或多种SiNA序列，pH范围为3.5-5。将两种液体加热至15-40°C范围的温度，目标为30-40°C，然后在碰撞射流混合器中混合以立即形成LNPaeeID具有0.25至1.0mm的范围，总流速为10-600mL分钟。流速和管道ID的组合具有控制LNP的颗粒大小在30至200nm之间的效应。然后将溶液以1:1至1:3vol:vol范围但目标为1:2vol:vol的混合比例与更高pH的缓冲溶液混合。该缓冲溶液处于15-40°C、目标为30-40°C的温度。在阴离子交换过滤步骤前将混合的LNP保持30分钟至2小时。孵育期间的温度范围为15-40°C、目标为30-40°C。孵育后，溶液过滤通过0.8um滤器，其含有阴离子交换分离步骤。该过程使用ImmID至5mmID的管道ID和10至2000mL分钟的流速。浓缩LNP，并经由超滤过程渗滤，其中去除醇并将柠檬酸盐缓冲液交换为最终的缓冲液溶液，如磷酸盐缓冲盐水。超滤过程使用了切向流过滤形式TFF。该过程使用30-500KD的膜名义分子量截留值。膜形式为中空膜或平板盒。具有适当的分子量截留值的TFF过程将LNP保留在滞留物中，滤液或渗透液含有醇;柠檬酸盐缓冲液;和最终缓冲废液。TFF过程是多步骤过程，初始浓度至1-3mgmL的siNA浓度。浓缩后，LNP溶液针对最终缓冲液渗滤10-20个体积以除去醇并进行缓冲液交换。然后将材料浓缩额外的1-3倍。LNP过程的最终步骤是无菌过滤浓缩的LNP溶液并将产物装入小瓶。[0541]分析程序··[0542]IsiNA浓度[0543]使用具有2996PDA检测器的Waters2695Alliance系统（WaterCorporation,MilfordMA通过强阴离子交换高效液相层析法SAX-HPLC测定siNA双链体浓度。用0.5%TritonX-100将否则被称为RNAi递送媒介物RNAiDeliveryVehicles，RDVs的LNP处理为游离总siNA，并用具有在254nm处UV检测的DionexBioLCDNAPacPA2004X250mm柱通过SAX分离进行分析。流动相由以下组成：A:25mMNaCKk,10mMTris,20%EtOH,pH7.0和B:250mMNaCKk,10mMTris,20%EtOH,pH7·0,0-15min的线性梯度和Iml分钟的流速。通过与siNA标准曲线比较而测定siNA量。[0544]2封装率[0545]采用荧光试剂SYBRGold用于RNA定量以监测RDVs的封装率。使用有或没有TritonX-100的RDVs来测定游离的siNA和总siNA量。使用来自MolecularDevicesSunnyvale，CA的SpectraMaxM5e微孔板分光光度计进行测定。在485nm处激发样品并在530nm处测定测量焚光发射。通过与siNA标准曲线比较而测定siNA量。[0546]封装率=1-游离siNA总siNAX100%。[0547]3颗粒大小和多分散性[0548]用IXPBS将含有IygSiNA的RDVs稀释至3ml的终体积。使用ZetaPALS仪器BrookhavenInstrumentsCorporation,Holtsville,NY通过动态光散射法测定样品的颗粒大小和多分散性。在25°C用He-Ne激光以90°的散射角测量散射强度。[0549]4ζ电势分析[0550]用ImMTris缓冲液pH7.4将含有IygSiNA的RDVs稀释至2ml的终体积。使用具有电极和作为光源的He-Ne激光的ZetaPALS仪器（BrookhavenInstrumentsCorporation,Holtsville,NY测定样品的电泳迀移率。在ζ电势的计算中假设SmoIuchowski限值。[0551]5脂质分析[0552]使用具有电晕电雾式检测器（CADESABiosciences,Inc,Chelmsford,MA的Waters2695Alliance系统WaterCorporation,MilfordMA通过反相高效液相层析法RP-HPLC测定个别脂质浓度。在60°C使用具有CAD的AgilentZorbaxSB-C1850X4.6mm,1.8μπι颗粒大小）分析RDVs中的个别脂质。流动相由下列组成:A:H20中的0.1%TFA和B:IPA中的0.1%TFA。梯度从时间0的60%流动相A和40%流动相B变化至在1.00min的40%流动相A和60%流动相B;从1.00至5.00min的40%流动相A和60%流动相B;从时间5.00min的40%流动相A和60%流动相B变化至在10.00min的25%流动相A和75%流动相B;从时间10.00min的25%流动相A和75%流动相B变化至在15.00min的5%流动相A和95%流动相B;和从时间15.00的5%流动相A和95%流动相B变化至在20.00min的60%流动相A和40%流动相B，流速为Iml分钟。通过用二次曲线拟合将RDVs中的所有脂质组分与标准曲线比较测定个别脂质浓度。基于每种脂质的分子量计算其摩尔百分比。[0553]B.用于71.9:20.2:7.9的比例的CLinDMA胆固醇PEG-DMG的一般配制程序[0554]siNA溶液通过将SiNA以0.8mgmL的浓度溶解于25mM梓檬酸盐缓冲液pH4.0中进行制备。脂质溶液通过将比例为71.9:20.2:7.9的2S-〇ctyl-ClinDMA、胆固醇和PEG-DMG的混合物以约10mgmL的浓度溶解于无水乙醇中进行制备。相等体积的SiNA和脂质溶液用2个注射器栗以相同流速递送至混合T形连接器。获得的乳状混合物收集在无菌瓶中。然后该混合物用相等体积的柠檬酸盐缓冲液缓慢稀释，并且过滤通过大小排阻中空纤维滤筒以去除混合物中的任何游离siNA。用针对柠檬酸盐缓冲液pH4.0进行超滤用于去除乙醇来自ALCO筛选的测试条），且用针对PBSpH7.4进行超滤以更换缓冲液。最终LNP通过浓缩至所需体积获得，并且通过〇.2mm滤器无菌过滤。获得的LNP就颗粒大小、醇含量、总脂质含量、封装的核酸和总核酸浓度而言进行表征。[0555]C.用于表10中各种制剂的一般LNP$lJ剂[0556]表10中的siNA纳米颗粒悬浮液通过将SiNA和或载体分子以约0.40mgmL的浓度溶解于20mM柠檬酸盐缓冲液（pH5.0中进行制备。脂质溶液通过将阳离子脂质（例如137，167-叱1二甲基-3-壬基二十二烷基-13，16-二烯-1-胺，参见表11中的结构）、03卩：、胆固醇和PEG-DMG的混合物表10中所示的比值）以约8mgmL的浓度溶解于无水乙醇中进行制备。氮与磷酸盐比值是接近6:1。[0557]几乎相等体积的siNA载体和脂质溶液用2个FPLC栗以相同流速递送至混合T形连接器。背压阀用于调整至所需颗粒大小。获得的乳状混合物收集在无菌玻璃瓶中。然后该混合物用相等体积的柠檬酸盐缓冲液以及随后等体积的PBSpH7.4稀释，并且通过离子交换膜过滤，以去除混合物中的任何游离siNA载体。采用针对PBS7.4超滤以去除乙醇且更换缓冲液。最终LNP通过浓缩至所需体积获得，并且通过0.2μπι滤器无菌过滤。所获得的LNP就颗粒大小、ζ电势、醇含量、总脂质含量、封装的核酸和总核酸浓度而言进行表征。[0558]LNP制备过程[0559]在非限制性实例中，LNP如下批量制备。过程由下述组成：⑴制备脂质溶液；⑹制备siNA载体溶液；（3混合粒子形成；（4孵育；（5稀释；（6超滤和浓缩。[0560]1.脂质溶液的制备[0561]将2L玻璃试剂瓶和量筒去热原。使脂质加温至室温。用移液管将8.Og13Ζ，16Ζ-叱1二甲基-3-壬基二十二烷基-13，16-二烯-1-胺转移进玻璃试剂瓶，并加入1.28〇5卩：、3.5g胆固醇、0.9gPEG-DMG。向混合物中加入IL乙醇。将试剂瓶置于加热水浴中，温度不超过50°C。用搅拌棒搅拌脂质悬浮液。通过具有密封适配器的圆底烧瓶的一个颈将热电偶探头放到悬浮液内。使悬浮液在30—40°C加热直至它变得澄清。允许溶液冷却至室温。[0562]2.siNA载体溶液的制备[0563]将称重0.4g乘以水校正因子（约1.2的siNA粉末加入到无菌容器CorninglG存瓶）内。将siNA转移至去热原的2L玻璃试剂瓶。用柠檬酸盐缓冲液25mM，pH5.0将称重容器冲洗3x，并且将冲洗液置于2L玻璃瓶中，用柠檬酸盐缓冲液QS至IL。使用下述程序，用UV分光光度计测定siNA溶液的浓度。从溶液中取出20yL，稀释50倍至IOOOyU并且在用柠檬酸盐缓冲液确定空白后，记录在A260nm的UV读数。重复这点。注意，如果关于2个样品的读数是一致的，那么可以获得平均值且基于siNA的消光系数计算浓度。如果终浓度超出0.40±0.01mgmL的范围，那么可以通过加入更多siNA载体粉末或加入更多柠檬酸盐缓冲液调整浓度。如果适用，这个过程对于第二种siNA进行重复。[0564]当siNA载体溶液包含单一siNA双链体和或载体而不是2种或更多种siNA双链体和或载体的混合物，那么将siNA载体溶解于20mM柠檬酸盐缓冲液pH5.0中，以获得0.4mgmL的终浓度。[0565]使用MasterFlex蠕动栗模型7520-40,脂质和乙醇溶液随后通过PallAcropak200.80.2nm无菌滤器PN12203无菌过滤到去热原的玻璃容器内，以提供用于封装过程的无菌原材料。过滤过程以80mL规模用20cm2膜面积运行。流速是280mL分钟。这个过程可以通过增加管道直径和过滤面积扩大规模。[0566]3.粒子形成-混合步骤[0567]使用双桶注射器驱动栗Harvard33Twin注射器），将无菌脂质乙醇溶液和无菌siNA载体或siNA载体鸡尾酒柠檬酸盐缓冲液20mM柠檬酸盐缓冲液，pH5.0溶液在0.5mmIDT形混合器混合阶段I中以相等或几乎相等的流速混合。获得的出口LNP悬浮液含有40-50vol%乙醇。为了获得45vol%乙醇出口悬浮液，将无菌脂质乙醇和无菌siNA载体或siNA载体鸡尾酒柠檬酸缓冲溶液以分别54mLmin和66mLmin的流速混合，使得混合出口的总流速为120mLmin。[0568]4.稀释[0569]将混合阶段I的出口流直接进料进4mmIDT形混合器混合阶段II中，其中其用更高pH的缓冲溶液20mM柠檬酸钠，300mM氯化钠，pH6.0以1:1vol:V〇l%的比例稀释。该缓冲溶液处于30_40°C范围的温度，并且经由蠕动栗ColeParmerMasterFlexLS600RPM以120mLmin的流速递送至4mmT形混合器。[0570]将混合阶段II的出口流直接进料进6mmIDT形混合器混合阶段III中，其中其用更高pHPBS，pH7.4的缓冲溶液以1:1vol:vol%的比例稀释。该缓冲溶液处于15-25°C范围的温度，并且经由懦动栗（ColeParmerMasterFlexLS600RPM以240mLmin的流速递送至6mmT形混合器。[0571]5.孵育和游离SiNA去除[0572]在混合后保持混合阶段III的出口流孵育30分钟。在35-40°C的温度进行孵育并且进程中悬浮液避光。孵育后，用MustangQ层析滤器胶囊经由阴离子交换去除游离（未封装）siNA。使用前，依次用INNaOH、lMNaCl和最后I3BS中12.5vol%乙醇的溶液的冲洗预处理层析滤器。检查最终冲洗的pH以确保pH〈8。然后经由MustangQ滤器经由懦动栗（ColeParmerMasterFlexLS600RPM以约100mLmin的流速过滤孵育的LNP流。将过滤流接受进无菌玻璃容器中用于如下超滤和浓缩。[0573]6.超滤、浓缩和无菌过滤[0574]超滤过程是定时过程，并且必须小心地监测流速。这是2步过程;第一步是浓缩步骤，取稀释的材料并浓缩约8倍，至约0.3-0.6mgmLsiNA的浓度。[0575]在第一个步骤中，将具有安装的超滤膜100kDaPESSpectrumLabs的环立架ring-stand与懦动栗（SpectrumKrosFloIISystem连接。将9.2L无菌蒸馏水加入储库;3L排至废液，剩余的通过渗透排至废液。将5.3L0.25N氢氧化钠加入储库，1.5L排至废液，3.1L通过渗透排至废液。将剩余的氢氧化钠保持在系统中用于清洁（至少10分钟），然后排出栗。将9.2L70vv%异丙醇加入储库，1.5L排至废液，剩余的通过渗透排至废液。加入6L调节缓冲液磷酸缓冲盐水中的12.5%乙醇），1.5L排至废液，剩余的通过渗透排至废液，直至废液为中性pH7-8。记录膜通量值，然后排出栗。[0576]将稀释的LNP溶液置于储库内至1.1升标记。以2.3Lmin启动栗。再循环5分钟后，以62.5mLmin启动渗透物栗，液体水平在储库中恒定在约950mL。在140分钟内将稀释的LNP溶液从9.8L浓缩至1.1L，当所有稀释的LNP溶液已转移至储库时，将栗暂停。[0577]第二个步骤是渗滤步骤，将乙醇水性缓冲液更换为磷酸盐缓冲盐水。在该步骤过程中，使用约10-20渗滤体积的磷酸盐缓冲盐水。渗滤后，进行第二次浓缩以便将LNP悬浮液3倍浓缩至约1-1.5mgmLsiRNA。将浓缩的悬浮液收集进无菌的塑料PETG瓶。然后顺序经由Pall0.45umPES和Pall0.2umPES滤器过滤最终悬浮液，用于最终灭菌，然后装入小瓶。[0578]所获得的LNP就颗粒大小、ζ电势、醇含量、总脂质含量、封装的核酸和总核酸浓度而言进行表征。[0579]D.新的阳离子脂质的合成[0580]新的阳离子脂质的合成是从脂质酸（i开始的线性过程。与Ν，0_二甲基羟胺的偶联产生Weinreb酰胺iiXrignard加成生成酮iii。钛介导的还原胺化产生iv型的最终产物。[0581]一般方案I[0582][0583]单碳同系化（singlecarbonhomologated的阳离子脂质V的合成是从脂质酮iii开始的线性过程。所述酮向腈（iv的转化是通过用TOSMIC和叔丁醇钾的处理完成的。所述腈还原为伯胺以及随后还原胺化提供了最终的阳离子脂质V。[0584]一般方案2[0585][0586]二碳同系化的阳离子脂质Viii的合成是从脂质酮（iii开始的线性过程。所述酮向α，β-不饱和酰胺vi的转化是在Peterson条件下完成的。使用三戊基硼氢化锂（LS-Selectride进行α，β_不饱和化的共辄还原以产生酰胺vii。用氢化铝锂还原所述酰胺提供了最终的阳离子脂质viii。[0587]一般方案3[0588][0589]根据一般方案4制备含有环丙基的脂质。不饱和的Weinreb酰胺ii经受Simmons-Smith环丙烷化条件以产生含有环丙基的Weinreb酰胺ix。如一般方案1-3所示，这些继续至最终产物。[0590]一般方案4[0591][0592]烯丙基胺阳离子脂质XV的合成是用醛X开始的线性过程。添加乙酸叔丁酯（t_butylaceate产生β-羟基酯xi。羟基官能度转化氟代基团以及随后的酸处理产生β-氟代酸xii。所述酸转化为Weinreb酰胺以及随后的Grignard加成产生β-氟代酮xiv。还原胺化导致同时消除以产生所需烯丙基胺XV。[0593]一般方案5[0594][0595]20,23-二十九碳烷二烯-10-胺小，1二甲基-，（202,232化合物1[0596][0597]将11，14_二十碳二烯酸，（11Ζ，14Ζ-50g，162mmol、乂O-二甲基羟胺盐酸盐31.6g，324mmol、H0At44.1g，324mmol、Et3N45.2mL，324mmol和EDC62.1g，324mmol在DCM810mL中混合并在环境温度搅拌过夜。将反应物用5X700mL水洗涤，然后用IX600mLIMNaOH洗涤，用硫酸钠干燥，通过娃藻土过滤并蒸发，获得作为澄清金色油状物的53.06g93%11，14_二十碳二烯酰胺，甲氧基-W-甲基-，11Z，14ZO1HNMR400MHz,CDCl3δ5.35m，4H，3.68s，3H，3.18s，3H，2.77m,2H,2.41t,=7Hz,2H,2.05m,4H,1.63m,2H,1.40-1.26m，18H，0.89t，=7Hz,3H。[0598][0599]将11，14-二十碳二烯酰胺，^V-甲氧基τΥ-甲基-，（117,1切-I4g，11.38mmol溶解于250ml烧瓶中的无水THF50.0ml中，然后在环境温度氮气下添加IM壬基溴化镁22.76ml,22.76mmol。10min后，用过量NH4Cl饱和水溶液慢慢淬灭反应。用己烷和水将反应物洗涤进分液漏斗中，振摇，弃去下面水层，用硫酸钠干燥上层，过滤，并蒸发，以得到作为金色油状物的粗酮。将二甲胺THF中2M14.22ml,28.4mmol和随后的1^0_i-Pr46.67ml，22.76mmol加入上述粗酮，让其搅拌过夜。第二天，加入EtOH50ml和随后的NaBH40.646g，17.07mmol。搅拌5min后，直接将整个反应物注射至和330g硅胶柱连线的40g硅胶柱上。100%DCM洗脱10min，然后0-15%MeOHDCM30min，收集作为微弱金色油状物的20,23-二十九碳烷二烯-10-胺，N，N-二甲基-，（20Z，23Z12.45g，5.47mmol,48.1%产率）Η400MHz,CDCl3δ5.35m,4Η,2.78m,2Η,2.23m,1Η,2.21s,6Η,2.05m,4Η,1.45-1.16m,38Η,0.89m,6ΗARMS计算值为C31H61N448.4877,实测值为448.4872。[0600]化合物2-30为新的阳离子脂质并根据上述一般方案1制备。[0601][0604][0605]12Z，15刃-#，#-二甲基-2-壬基二^^一烷基-12，15-二烯-1-胺化合物31[0607]将二甲氧基乙烷（45mL中的酮iii4.0g,9.55mmol、T0SMIC2.4g，12.4mmol的溶液冷却至TC，并用叔丁醇钾（19.lmmol，19.ImL在tBuOH中的IM溶液处理。90分钟后，反应物在己烷和水之间分配。有机相用水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并真空蒸发。该物质通过快速层析法0-5%EtOAc己烷纯化，产生所需产物含有〜20%的s.m.。该混合物按照原来的样子进入下一步。LCMSM+H=430.6。[0609]将氢化铝锂（23.9mmol，23.9mLTHF中的IM溶液）在环境温度直接加入腈iv3.42g，8mmol，将反应搅拌20分钟。用IOOmLTHF稀释反应物，冷却至0°C，并用十水硫酸钠溶液小心淬灭。滤出固体并用THF洗涤。将滤液在真空中蒸发，并直接进入下一个粗反应。LCMSM+H=434.6。[0611]用甲醛（1.6mL,21.7mmol和随后的三乙酰氧基硼氢化钠6.6g,31mmol处理二氯乙烷（IOOmL中的伯胺3.45g，6.2mmol溶液。5分钟后，反应物在二氯甲烷和INNaOH之间分配。有机相在硫酸钠上干燥，过滤并真空蒸发。通过反相制备层析法C8柱纯化粗混合物以提供（122，15幻，，-二甲基-2-壬基二^^一烷基-12,15-二烯-1-胺。HRMS计算值462.5033,实测值462·5026ΗNMR400MHz,CDCl3δ5.35m,4H,2.782H,t,J=5·6Ηζ，2·18s,6H,2.05m,6H,1.3m,39H,0.89m,6H。[0612]13Z,16刃，,#_二甲基-3-壬基二十二烷基-13,16-二烯-1-胺化合物32[0614]将甲硅烷基酰胺Peterson试剂（3.Ig，16.7mmol溶解于THF35mL中，并冷却至-63°C。将nBuLi16.7mm〇l，6.7mL2.5M溶液加入该溶液中。将反应温热至环境温度持续30分钟。将酮5.Og，11.9mmol溶解在第二个烧瓶中的THF25ml中。将Peterson试剂转移至在-60°C的酮溶液。将反应温热至-40°C持续1小时，然后温热至0°C持续30分钟。反应用碳酸氢钠淬灭，用额外的水稀释，并在水己烷之间分配。有机相用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并真空蒸发。通过快速层析法0-40%MTBE己烧）的纯化产生α，β_不饱和酰胺vi。1HNMR400MHz,CDCl3δ5.75s，1H，5.36m，4H，3.01s，3H，2.99s，3H,2.78t,2H,2.28t,2H,2.05m,6H,1.35m,34H,0.89m,6H。[0616]在密封管中组合α,β-不饱和酰胺vilg,2.1mmol和三戊基硼氢化锂4.1mmol，4.ImLIM溶液），并加热至60°C持续24小时。将反应冷却至环境温度，并在氯化铵溶液和庚烷之间分配。有机相在硫酸钠上干燥，过滤并真空蒸发以产生酰胺vii。该中间产物直接进入下一个粗反应。[0618]13Z,16Z-#，#-二甲基-3-壬基二十二烷基-13，16-二烯-1-胺化合物32将氢化铝锂8.7mmol，8.7mLIM溶液）加入酰胺vii2.85g，5.8mmol的溶液。将反应在环境温度搅拌10分钟，然后通过缓慢加入十水硫酸钠溶液淬灭。过滤固体，并用THF洗涤，滤液真空蒸发。通过反相制备层析法C8柱纯化粗混合物以提供作为油状物的（13Z，16Z-^jV-二甲基-3-壬基二十二烷基-13,16-二烯-1-胺化合物32ARMSM+H计算值476.5190,实测值476·5189ΗNMR400MHz,CDCl3δ5.37m，4H，2.78t，2H，2.42m，8H，2.05q,4H,1.28m,41H,0.89m,6H。[0619]二甲基-I-2-辛基环丙基十七烷-8-胺化合物33[0621]将CDI0.63g,3.9mmol加入冷却至0°C的DCM500mL中的油酸（lg,3.5mmol溶液。将反应温热至环境温度持续30分钟，然后冷却至TC，首先用三乙胺0.39g，3.9mmol处理，然后用二甲基轻胺盐酸盐0.38g,3.9mmol处理。1小时后，反应物在水和庚烷之间分配。有机相在硫酸镁上干燥，过滤并真空蒸发以产生粗Weinreb酰胺vii，后者直接进入下一个反应。[0623]将二氯甲烷（130mL中的二乙基锌溶液70.3mmol，70.3mLIM溶液冷却至-1°C，并用TFA8.0g，70.3mmol逐滴处理。30分钟后，加入二碘甲烷（18.8g，70.3mmol，其在冰浴中老化30分钟。将Weinreb酰胺ii7.6g，23.4mmo1加入该溶液。将反应温热至环境温度并搅拌1小时。用氯化铵溶液（IOOmL淬灭反应，分配出有机层，用10%硫代硫酸钠洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并真空蒸发。通过快速层析法0-30%MTBE庚烷）的纯化产生所需产物ixHNMR400MHz,CDCl3δ3.72s，3H，3.22s，3H，2.48t，2H，1.65m,2H,1.39m,22H,1.18m,2H,0.91t,3H,0.68m,2H,0.59m,1H,-0.32m,1H。[0625]以类似于上述化合物I所述的方式进行Weinreb酰胺ix至化合物33的转化（壬基Grignard加成，随后为还原胺化hLCMSM+H=436.6。咕MlR400MHz,CDCl3δ2.25s,6H,1.30m,45H,0.91m,6H,0.68m,2H,0.59m,1H,-0.31m,1H。[0626]化合物34-43为新的阳离子脂质并根据上述一般方案1-4制备。[0627][0628][0629]ILE,20Z,23Z-#，#-二甲基二十九碳-II，20，23-三烯-10-胺化合物44[0631]将乙酸叔丁酯加入冷却至-78°C的THF127mL中的LDA溶液95mmol，47.5mL2M溶液）。将反应搅拌15分钟，随后加入醛x。反应立即用氯化铵溶液淬灭，温热至环境温度并在水戊烷之间分配。有机相在硫酸钠上干燥，过滤并真空蒸发。LCMSM+H-tBu=325.4〇[0633]将轻基酮xi7g,18.4mmol溶解于二氯甲烧（150mL中，冷却至0°C，并用deoxofluor7.3g,33.Immol处理。将反应温热至环境温度，搅拌16小时，随后用碳酸氢钠溶液淬灭。分配反应物，有机相在硫酸钠上干燥，过滤并真空蒸发。快速柱层析法0-5%乙酸乙酯己烧产生-氟代酯。[0634]用氯化氢（157mmol，39.2mL二氧己环中的4M溶液处理二氯甲烷中的氟代酯中间体6g，15.6mmol，并在环境温度下搅拌反应16小时。将反应真空蒸发以产生所需β-氟代酸xiiICMSΜ+Η=327.3。[0636]将氟代羧酸xii5.1g，15.7mmol、EDC6.0g，31.4mmol、N，0-二甲基羟胺盐酸盐（3.1g，31.4mmol、三甲胺（4.0g,39.2mmol和HOAt4.3g,31.4mmol在DCM78mL中组合并在环境温度搅拌16小时。在水DCM之间分配反应物，有机相用水（3x和NaOH溶液（Ix洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并真空蒸发。通过反相制备性层析法纯化粗物质以产生所需Weinreb酰胺xiiiICMSM+H=370.4。[0638]在环境温度用壬基溴化镁（23.4mmol，23.4mLIM溶液）处理THF50mL中Weinreb酰胺xiii4.3g,11.7mmol的溶液。1小时后用氯化铵溶液淬灭反应，并在水戊烷之间分配。有机相在硫酸钠上干燥，过滤并真空蒸发。该物质进入下一步粗物质。[0639][0640]用二甲胺（29.3mmol，14.7mLTHF中的2M溶液）和异丙氧基钛（IV6.7g，23.5mmol处理酮xiv5.1g,11.7mmol，并在环境温度搅拌反应16小时。将乙醇50mL以及随后的硼氢化钠〇.67g，17.6mmol加入反应混合物。将反应物直接上样至硅胶柱上，并通过快速层析法0-15%MeOHDCM纯化。该物质需要第二次通过制备反相层析法纯化以产生（ILE，20Z，23Z-^jV-二甲基二十九碳-11，20，23-三烯-10-胺。HRMS计算值446·4720，实测值446·4724Η400MHz,CDCl3δ5.48m,1Η,5.37m,4Η,5.23m，1H,2.78t,2H,2.58m,1H,2.22s,6H,2.04m,6H,1.56m,1H,1.30m,31H,0.89m,6H。[0641]化合物45是如NatureSioieciMoiogy,2010,2S,172-176、W02010042877Al、W02010048536A2、W02010088537A2和WO2009127060Al中所述的DLinKC2DMA。[0643]化合物46是如WO2010054401和WO2010144740Al中所述的MC3。[0645]E.脂质纳米颗粒组合物[0646]本发明的下列脂质纳米颗粒组合物LNP可用于递送寡核苷酸，特别是本发明的siNA分子。[0647]阳离子脂质胆固醇PEG-DMG56.6385.4;[0648]阳离子脂质胆固醇PEG-DMG60382;[0649]阳离子脂质胆固醇PEG-DMG67.3293.7;[0650]阳离子脂质胆固醇PEG-DMG49.3473.7;[0651]阳离子脂质胆固醇PEG-DMG50.344.35.4;[0652]阳离子脂质胆固醇PEG-C-DMADSPC4048210;[0653]阳离子脂质胆固醇PEG-DMGDSPC4048210;和[0654]阳离子脂质胆固醇PEG-DMGDSPC5830210。[0655]本领域技术人员应当理解本发明非常适合于行使目标且获得提及的目的和优点，以及其中固有的那些。作为优选实施方案的目前代表的本文描述的方法和组合物是示例性的且不意在作为对本发明范围的限制。其中的改变和其他用途对于本领域技术人员将是显而易见的，其包含在本发明的精神内，且由权利要求的范围限定。[0656]表7:HBV登记号[0659]表8[0660]关于化学修饰的siNA构建体的稳定化学物chemistry的非限制性实例[0662][0663]CAP=任何末端帽，参见例如图6。[0664]所有Stab化学物可以互相组合用于本发明的双链体例如，作为有义和反义链的化学物的组合），或可替代地用于分离，例如，本发明的单链核酸分子。[0665]所有Stab化学物可以包含具有2’-0-烷基、2脱氧-2氟、2脱氧、LNA或其他修饰的核苷酸或非核苷酸的3’-突出端。[0666]所有Stab化学物一般包含约19-21个核苷酸，但可以如本文所述改变。[0667]所有Stab化学物还可以包括如从反义或引导链的5’-末端测定的，在双链核酸双链体的第11个碱基配对位置处在有义或过客链中的单一核糖核苷酸。[0668]所有Stab化学物还可以在从反义链的5’末端的14位处具有2脱氧-2氟修饰以代替上述Stab指定，无论它在该位置上是否是嘌呤或嘧啶。[0669]上述反义链的所有Stab化学物在从反义链的5’末端的1、2和或3位处可以具有胸苷以代替2’-脱氧尿苷。[0670]S=有义链。[0671]AS=反义链[0672]*Stab23具有与3’-帽邻近的单一核糖核苷酸。[0673]*Stab24和Stab28在5’-末端处具有单一核糖核苷酸。[0674]^Stab25、Stab26、Stab27、Stab35、Stab35G*、Stab35N*、Stab35rev*、Stab36、Stab50*、Stab53*、Stab53N*、和Stab54在5’-末端处具有3个核糖核苷酸。[0675]*Stab29、Stab30、Stab31、Stab33、和Stab34从5’-末端的前3个核苷酸位置处的任何嘌呤是核糖核苷酸。[0676]p=硫代磷酸酯键。[0677]TStab35具有在3’-突出端处的2’-0_甲基U和在5’-末端处的3个核糖核苷酸。[0678]fStab36具有与目标序列互补的2’-0_甲基突出端。（天然存在的突出端和在5’-末端处的3个核糖核苷酸。[0679]ί-Stab04H、Stab06C、Stabl07H、Stab07mU、Stab09H、Stabl6C、Stab16H、Stabl8C、Stab18H、Stab52H、Stab05C、Stab05N、Stabl0C、Stabl0N、Stab35G*、Stab35N*、Stab35N*、Stab35rev*、Stab50*、Stab53*、Stab53N*、Stab54具有两个2’-0-甲基U3’-关出端。[0680]Stab35G*、Stab35附、5七335代#、5七350*、5七353*、和5七353附不允许如从5末端确定的导向链的14位处的2’-0-甲基修饰。[0681]表9[0682]A.2.5μπιοί合成循环ABI394仪器[0683][0684]Β.0.2μπιοί合成循环ABI394仪器[0685][0686]C.0.2μπιοί合成循环96孔仪器[0687][0688]•等待时间不包括递送期间的接触时间[0689]•串联合成使用接头分子的双重偶联。[0690]表IQ:选择脂质纳米颗粒制剂的组成[0692][0693]NP比值=阳离子脂质和核酸之间的氮:磷比值。[0694]表IU表10的制剂中的脂质的化学结构[0695]

权利要求：1.抑制乙型肝炎病毒HBV表达的双链短干扰核酸（SiNA分子，其由有义链和反义链组成，所述有义链由核苷酸序列5’-ugAGaGaaGuCCAcCaCGAUsU-3’（SEQIDN0:410组成，所述反义链由核苷酸序列5’-BUCGUgguGGaCUUcUCiCaUsUB-3’（SEQIDN0:411组成，其中B是反向脱碱基部分;粗体核苷酸包含2’-O-甲基修饰，小写字母核苷酸包含2氟修饰，斜体核苷酸是脱氧核苷酸，并且s是硫代磷酸酯键。2.组合物，其包含权利要求1的双链短干扰核酸（SiNA和药学上可接受的载体或稀释剂。3.组合物，其包含：a权利要求1的双链短干扰核酸siNA;⑹阳离子脂质；c胆固醇；dDSPC;和ePEG-DMG04.组合物，其包含：a权利要求1的双链短干扰核酸siNA;⑹（132，162-?'1，1'1-二甲基-3-壬基二十二碳-13，16-二稀-1-胺；c胆固醇；dDSPC;和ePEG-DMG05.根据权利要求4所述的组合物，其中所述（132，1624”-二甲基-3-壬基二十二碳-13，16-二烯-1-胺、胆固醇、DSPC和PEG-DMG具有分别50:30:10:2的摩尔比。6.组合物，其包含权利要求5的组合物和药学上可接受的载体或稀释剂。7.权利要求1的双链短干扰核酸（siNA分子在制备药物中的用途，所述药物用于治疗患有状况的人受试者，所述状况通过乙型肝炎病毒HBV的作用介导。8.根据权利要求7所述的用途，其中所述状况是HBV感染。9.试剂盒，其包含权利要求1的双链短干扰核酸siNA。10.根据权利要求7所述的用途，其中所述状况是肝脏疾病。

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