申请/专利权人：免疫医疗公司

申请日：2016-04-14

公开（公告）日：2018-02-16

公开（公告）号：CN107708729A

主分类号：A61K39/08(2006.01)I

分类号：A61K39/08(2006.01)I;A61K39/395(2006.01)I;A61K39/40(2006.01)I

优先权：["2015.04.15 US 62/147908"]

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2021.04.27#发明专利申请公布后的视为撤回;2018.03.16#实质审查的生效;2018.02.16#公开

摘要：本发明的特征在于用于治疗艰难梭菌感染CDI、艰难梭菌相关疾病及其症状的方法，该方法的特征在于特异性结合艰难梭菌毒素A和或毒素B的具有增强的半衰期的抗体的用途。在一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病的方法，该方法涉及向该受试者给药抗艰难梭菌毒素A抗体和抗艰难梭菌毒素B抗体的组合，所述抗艰难梭菌毒素A抗体和抗艰难梭菌毒素B抗体具有改变，相对于缺少这一改变的抗艰难梭菌毒素A和B抗体，这一改变增加了这两种抗体中一种或全部两种的半衰期。在一方面，本发明的特征在于包含抗毒素A抗体和抗毒素B抗体的等摩尔混合物的组合物。本发明提供了用于治疗艰难梭菌感染或其症状的试剂盒。

主权项：一种在受试者中治疗艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病的方法，该方法包括向该受试者给药抗艰难梭菌毒素A抗体和抗艰难梭菌毒素B抗体的组合，所述抗艰难梭菌毒素A抗体和抗艰难梭菌毒素B抗体包含改变，相对于缺少这一改变的抗艰难梭菌毒素A和B抗体，这一改变增加了这两种抗体中一种或全部两种的半衰期。

全文数据：用于治疗艰难梭菌CLOSTRIDIUMDIFFICILE感染和相关疾病的方法背景技术[0001]被疾病控制中心分类为紧急的公共卫生威胁的艰难梭菌感染CDI是一种细菌毒素介导的疾病并且是医院获得性感染的主要原因。大多数CDI是肠道内微生物群系失调正常肠道菌群的破坏）引起的，是先前用广谱抗生素治疗的结果，因为广谱抗生素促进了艰难梭菌的繁殖。自相矛盾的是，用于治疗CDI的这些抗生素恰恰又延长了允许这种病原体引起疾病的失调，结果导致了更高比例的疾病复发。[0002]感染艰难梭菌这种革兰氏阳性产芽胞厌氧菌会导致范围从中度腹泻和假膜性结肠炎到中毒性巨结肠、败血症和死亡的症状。艰难梭菌的孢子对大部分消毒剂有抗性，而且有症状的患者和没有症状的携带者都会将这种孢子脱落在医院环境中。自2001年以来，CDI的年率翻了一番，同时出现了高毒力的菌株。美国每年发生超过50万例艰难梭菌感染的新病例，并且估计每年在欧洲发生超过40万例诊断的CDI事件。这提出了发病率、死亡率和医疗保健资源消耗的重大负担，因此需要更有效的治疗策略。[0003]CDI最常见于伴有合并症的老年患者-这一脆弱的人群-感染通常在用广谱抗生素治疗以后发生。抗生素介导的有益肠道微生物群落的破坏让艰难梭菌的定居和感染成为可能。通常用于治疗⑶I的抗生素（甲硝唑、万古霉素和非达霉素延长了肠道生态失调，并且导致停止抗生素治疗后感染复发率达到了13%-25%。持续治疗CDI需要抵抗感染复发的多种保护性肠道微生物群系的恢复。实际上，对艰难梭菌发病机制和抗性的理解已经取到了进展，这有助于阐明有益肠微生物群系在维持整体健康方面的重要作用。[0004]目前，艰难梭菌感染和疾病的有效治疗和预防措施是缺少的。急需新的治疗方法。发明内容[0005]如下所述，本发明总体上特征在于用于治疗艰难梭菌感染CDI、艰难梭菌相关疾病及其症状的方法，该方法的特征在于特异性结合艰难梭菌毒素A和或毒素B的具有增强的半衰期的抗体的用途。[0006]在一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病的方法，该方法涉及向受试者给药抗艰难梭菌毒素A抗体和抗艰难梭菌毒素B抗体的组合，这些抗体具有一个改变，相对于缺少这一改变的抗艰难梭菌毒素A和B抗体，这一改变增加了一个或两个抗体的半衰期。[0007]在另一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病的方法，该方法涉及向受试者给药抗艰难梭菌毒素A抗体和抗艰难梭菌毒素B抗体的组合以及万古霉素，从而相对于参考剂量或剂量频率，减少万古霉素的剂量或剂量频率。[0008]在本文描述的任何方面的不同实施例中，相对于缺少改变的抗艰难梭菌毒素A和B抗体，一个或两个抗体具有增加的半衰期。在某些实施例中，改变是252Y、254T或256E中的任何一个或多个例如，YTE修饰）。在一些实施例中，改变是与聚乙二醇PEG缀合或与白蛋白缀合的。[0009]在本文描述的任何方面的不同实施例中，抗毒素A抗体具有一个重链，该重链包含序列SEQIDNO:1:[0010]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdynmdwvrqapgqrIewmgdinpkydiighnpkfmgrvtitrdtsastaymelsslrsedtavyycarsdrgwyfdvwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstSggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeIlggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsItclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgko[0011]在本文描述的任何方面的不同实施例中，抗毒素A抗体具有一个轻链，该轻链包含序列SEQIDNO:2:[0012]eivltqspatlslspgeratlscrasssvnymnwyqqkpgqaprpIiyatsnlasgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqwssrtfgggtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasweIlnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstysIsstItlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec〇[0013]在本文描述的任何方面的不同实施例中，抗毒素B抗体具有一个重链，该重链包含序列SEQIDNO:3:[0014]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgypftnyfmhwvrqapgqrlewigrinpyngatsyslnfrdkatitIdksastaymelsslrsedtavyycarstitsplldfwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeIlggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsItclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgko[0015]在本文描述的任何方面的不同实施例中，抗毒素B抗体具有一个轻链，该轻链包含序列SEQIDNO:4:[0016]eivltqspatlslspgeratlscrasqsvgtsihwyqqkpgqaprlIikfasesisgiparfsgsgsgtdftltissIepedfavyycqqsnkwpftfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstysIsstItIskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec〇[0017]在不同实施例中，抗毒素A抗体是PA50-YTE。在不同实施例中，抗毒素B抗体是PA41-YTE。在具体实施例中，抗体的组合是PA50YTEPA41YTE组合。在某些实施例中，PA50YTEPA41YTE组合以单一剂量给药。[0018]在本文所描述的任何方面的另外的实施例中，治疗的方法还进一步涉及给药抗生素，例如万古霉素、非达霉素和甲硝唑。在不同实施例中，口服给药或静脉内给药该抗生素。[0019]在本文描述的任何方面的不同实施例中，治疗的方法进一步涉及给药万古霉素。在不同实施例中，口服或静脉内给药该万古霉素。在某些实施例中，参考剂量和剂量频率是以15-20mgkg静脉内给药万古霉素，每天2-3次。在一些实施例中，参考剂量和剂量频率是以125mg口服给药，每天3-4次。[0020]在本文描述的任何方面的不同实施例中，艰难梭菌毒素A和或毒素B被中和。在本文描述的任何方面的不同实施例中，治疗的方法减少了对艰难梭菌再感染的时间。在本文所描述的任何方面的不同实施例中，治疗的方法增强了微生物群系恢复，减少微生物群系失调，和或减少受试者的肠损伤，包括例如相对于抗生素治疗。[0021]本发明的其他特征和优点将根据详细说明以及根据权利要求书变得明显。[0022]定义[0023]除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为本领域技术人员提供本发明中所使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology[微生物学和分子生物学词典]第2版，1994;TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnology[剑桥科技词典]Walker编著，1988;TheGlossaryofGenetics[遗传学词汇]，第5版，R.Rieger等人（编著），SpringerVerlag1991;以及HaIe和Marham，TheHarperCollinsDictionaryofBiologyl^g®科林斯生物学词典]1991。除非另外指明，否则如在此所使用的以下术语具有以下赋予它们的含意。[0024]“艰难梭菌毒素△1'〇^”意指与1^1登录号¥?_001087137提供的并具有1'〇^生物活性的氨基酸序列具有至少约85%或更高氨基酸一致性的多肽或其片段。TcdA生物活性包括葡糖基化活性，例如GTP酶例如Rho、Rac和Cdc42的葡糖基化。以下提供了示例性艰难梭菌毒素A序列（SEQIDN0:5:[0025][0026][0027]“艰难梭菌毒素8〇^^”意指与1^1登录号¥?_001087135提供的具有1^^生物活性的氨基酸序列具有至少约85%或更高氨基酸一致性的多肽或其片段。TcdB生物活性包括葡糖基化活性，例如GTP酶例如Rho、Rac和Cdc42的葡糖基化。以下提供了示例性艰难梭菌毒素B序列（SEQIDN0:6:[0028][0029][0030]本文所用的术语“半衰期”或“体内半衰期”是指包含FcRn结合位点的抗体例如，IgG或其片段在给定动物的循环中的生物半衰期，并且表示为动物中的给药量的一半从循环和或动物中的其他组织中清除所需要的时间。当给定的IgG的清除曲线被构建为时间的函数时，该曲线通常为双相的，该双相具有快速的α-相和较长的β相，该α-相表示血管内空间与血管外空间之间的注射的IgG分子的平衡并且部分地由分子的大小决定，该较长的β相表示血管内空间中的IgG分子的分解代谢。术语“体内半衰期”实际上对应于β-相中的IgG分子的半衰期。[0031]“具有增加的半衰期的抗体”意指与参考抗体相比时具有增加的生物半衰期的抗体。在具体实施例中，参考抗体是缺少改变或修饰的抗体例如，未修饰的亲本抗体或前体抗体）。[0032]“抗tcdA抗体”意指特异性结合艰难梭菌毒素A的抗体。抗tcdA抗体包括对艰难梭菌毒素A具有特异性的单克隆抗体和多克隆抗体及其抗原结合片段。在某些方面中，如在此所述的抗tcdA抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段），例如鼠类的、人源化的或完全的人的单克隆抗体，包括其修饰的衍生物。US20130202618US8986697中描述了示例性抗tcdA抗体例如PA-50、PA-39和PA-38，将这些文件通过引用以其全部内容结合在此。在一个具体实施例中，抗tcdA抗体是PA50-YTE，其具有以下重链和轻链序列：[0033]PA50-YTE轻链（SEQIDN0:2[0034][0035]PA50-YTE重链（SEQIDN0:1:[0036]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdynmdwvrqapgqrlewmgdinpkydiighnpkfmgrvtitrdtsastaymelsslrsedtavyycarsdrgwyfdvwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeIlggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsItclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk[0037]“抗tcdB抗体”意指特异性结合艰难梭菌毒素B的抗体。抗tcdB抗体包括对艰难梭菌毒素B特异性的单克隆抗体和多克隆抗体及其抗原结合片段。在某些方面中，如在此所述的抗tcdB抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段），例如鼠类的、人源化的或完全的人的单克隆抗体，包括其修饰的衍生物。US20130202618US8986697中描述了示例性抗tcdB抗体例如PA-41，将这些文件通过引用以其全部内容结合在此。在一个具体实施例中，抗tcdB抗体是PA41-YTE，其具有以下重链和轻链序列：[0038]PA41-YTE轻链（SEQIDN0:4[0039]eivltqspatlslspgeratlscrasqsvgtsihwyqqkpgqaprllikfasesisgiparfsgsgsgtdftitisslepedfavyycqqsnkwpftfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstysIsstItlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec[0040]PA41-YTE重链（SEQIDN0:3[0041]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgypftnyfmhwvrqapgqrlewigrinpyngatsyslnfrdkatitldksastaymelsslrsedtavyycarstitsplldfwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeIlggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsItclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk[0042]“改善”意指减少、阻遏、减弱、减轻、阻止或稳定疾病的发展或进展。[0043]如在本披露中使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并且涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论它是在体外或在体内生产的。术语包括但不限于：多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、以及接合抗体。除非用术语“完整”另行改进，如在“完整抗体”中，出于本披露的目的，术语“抗体”还包括抗体片段例如Fab、Fab’）2、Fv、scFv、Fd、dAb，和其他保留抗原结合功能（即特异性结合艰难梭菌毒素A或毒素B多肽的能力）的抗体片段。典型地，这类片段将包括抗原结合结构域。[0044]术语“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”和“结合片段”是指包括负责抗体和抗原之间特异性结合的氨基酸的抗体分子的一部分。例如，在抗原很大的情况下，抗原结合结构域可只结合抗原的一部分。负责与抗原结合结构域特异性相互作用的抗原分子的一部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。在特定的实施例中，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区I和抗体重链可变区Vh，然而，它不一定必须包括两者。例如，所谓的Fd抗体片段仅由Vh结构域组成，但仍保留了完整抗体的一些抗原结合功能。[0045]抗体的结合片段可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解来产生。结合片段包括Fab、Fab’、Fab’）2、Fv以及单链抗体。除了“双特异性”或“双功能”抗体以夕卜，抗体应理解为其每个结合位点是相同的。使用酶木瓜蛋白酶来消化抗体的结果是两个相同的抗原结合片段，又称为“Fab”片段和“Fc”片段，它们不具有抗原结合活性，但具有结晶的能力。用酶（胃蛋白酶来消化抗体的结果是Fab’）2片段，其中该抗体分子的两个臂保持链接并且包括两个抗原结合位点。Fab’）2片段具有交联抗原的能力。当在此使用时，“Fv”是指保留了抗原识别和抗原结合位点的抗体的最小片段。当在此使用时，“Fab”是指包括轻链的恒定结构域和重链的CHI结构域的抗体的片段。[0046]术语“mAb”是指单克隆抗体。本发明的抗体包括但不限于全天然抗体、双特异性抗体;嵌合抗体;Fab、Fab’、单链V区片段scFv、融合多肽以及非常规抗体。[0047]在本披露中，“包括（comprises、comprising”、“包含（containing”和“具有having”等可以具有美国专利法赋予它们的意义并且可以意味着“包括（includes、incIuding”等；“基本上由…组成（consistingessentiallyof或consistsessentially”同样具有美国专利法赋予的意义并且该术语是开放性的，允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新特征不被超过叙述的存在改变，但是排除现有技术实施例。[0048]“艰难梭菌相关疾病”意指与艰难梭菌感染相关的任何疾病或其症状。艰难梭菌相关疾病的特征在于以下症状中的一个或多个:腹泻、假膜性结肠炎、中毒性巨结肠、结肠的穿孔、以及在一些情况下的败血症。[0049]术语“有效量”是指足以降低或稳定受试者中艰难梭菌感染的，或减轻和或改善与患者中的艰难梭菌感染相关的症状或另外地达到预期的生物学结果的药剂的剂量或量。[0050]如在此使用，“中和”是指一个或多个抗体特异性结合的毒素的不利影响的减少、抑制、阻断、改善、或消除。一种或多种毒素的一种或多种不利影响的中和包括1延迟、减少、抑制或防止艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性腹泻或疾病的发病或进展;2与没有用一种或多种抗体治疗并具有艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病的受试者的中位生存期相比，增加受试者的存活率;3消除一种或多种症状或不良反应或降低与艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性腹泻或疾病相关的一种或多种症状或不良反应的严重程度;4允许正或已感染艰难梭菌的受试者的胃肠道的正常微生物群落的种群恢复;5防止在已经患有艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病的受试者中，艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病的复发;6在患有艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病的受试者中产生至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的治愈率;和或7防止由于CDAD或与艰难梭菌感染相关的其他不良事件引起的死亡。[0051]术语“分离的”是指基本上不含存在于其天然环境中的其他元素的分子。例如，分离的蛋白质基本上不含来自于细胞或其来源的组织源的细胞材料或其他蛋白质。术语“分离的”也指制剂，其中分离的蛋白质是足够纯的而作为药物组合物给药，或是至少70%-80%ww纯的，更优选地是至少80%-90%ww纯的，甚至更优选地是90%-95%纯的；并且最优选地是至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%ww纯的。[0052]“片段”意指多肽或核酸分子的一部分。此部分优选包含参考核酸分子或多肽的全长的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在一个特定的实施例中，多肽的片段可以包含5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200或300个氨基酸。[0053]“参考”意指用于比较的标准。[0054]“参考序列”是一个被用作序列比较的基础的、定义的序列。参考序列可以是一个具体的序列的子集或全部；例如，全长cDNA或基因序列的区段，或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度一般将是至少约16个氨基酸，优选地至少约20个氨基酸，更优选地至少约25个氨基酸，并且甚至更优选地约35个氨基酸，约50个氨基酸，或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度一般将是至少约50个核苷酸，优选地至少约60个核苷酸，更优选地至少约75个核苷酸，并且甚至更优选地约100核苷酸或约300个核苷酸或在那附近或其间的任何整数。[0055]“特异性结合”意指一种药剂例如，抗体识别并结合一种分子例如，多肽），但是其基本上不识别并结合样品（如生物样品）中的其他分子。例如，特异性结合的两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特征在于高亲和力和区别于非特异性结合的低等至中等容量，非特异性结合通常具有中等至高等容量的低亲和力。典型地，当亲和常数Ka高于IO7IT1，或更优选地高于IO8IT1时，结合被认为是特异的。[0056]“受试者”意指哺乳动物，但不限于人或非人类哺乳动物，例如牛、马、犬、羊、猫、或£3邱U[0057]除非明确规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的，术语“约about”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。大约可以被理解为在声明值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、或0.01%之内。除非从上下文显而易见，在此提供的所有数值被该术语大约修饰。[0058]在变量的任何定义中对化学基团清单的引用在本文中包括将所述变量定义为任何单个基团或所列基团的组合。对一个变量或方面的实施例的详述在本文中包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分结合的实施例。[0059]本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的一个或多个任何其他组合物和方法进行组合。附图说明[0060]图1示出了PA50YTEPA41YTE组合具有增强的半衰期的抗毒素A和抗毒素B单克隆抗体的组合），相对于艰难梭菌仓鼠感染模型的抗生素治疗，提供了优异的感染后保护益处。图描绘了研究组动物的组的生存结果。如示意图所描绘，在研究的第〇天给药动物口服艰难梭菌孢子进行激发，并且在第1天用克林霉素（l〇mgkg进行治疗。研究组包括不接受治疗的感染对照动物、用万古霉素治疗的动物、以及用具有增强的半衰期的鼠抗毒素A和抗毒素B单克隆抗体组合治疗的动物。用抗毒素A和抗毒素B单克隆抗体组合治疗的动物在研究期间存活并被保护对抗艰难梭菌毒性。[0061]发明详细描述[0062]本发明的特征在于用于治疗艰难梭菌感染CDI、艰难梭菌相关疾病、及其症状的方法，该方法的特征在于特异性结合艰难梭菌毒素A和或毒素B的具有增强的半衰期的抗体。[0063]本发明至少部分地基于以下发现:具有增加的半衰期的两种单克隆抗体mAb的混合物中和艰难梭菌毒素A和B，而艰难梭菌毒素A和B是该病原体的关键毒力因子。这种组合物代表替代抗生素治疗的以病原体为中心的精准医疗。在临床前生存模型中，通过这样一个组合的毒素中和，至少与治疗CDI中的抗生素一样有效如果不是更有效的话）。通过直接攻击这些毒力因子，这种治疗有可能更快速地解决症状，同时允许患者比目前的护理抗生素治疗标准将可能达到的结果更早地恢复其⑶I抗性微生物群系。此类的组合物具有提供毒素A和B的长期中和的附加益处，从而进一步降低复发的可能性。用此类组合治疗艰难梭菌感染支持了以下目标:推进抗生素管理和加速从抗生素介导的微生物群系失调CDI潜在的风险因素）中的恢复。正在进行和提出的临床前研究旨在证明此类组合对微生物群系恢复和肠损伤的程度的影响，为其相对于目前的抗生素治疗的额外益处提供了证据。[0064]艰难梭菌感染CDI和艰难梭菌相关疾病CDAD[0065]艰难梭菌相关疾病CDAD通常是由使用抗生素（如克林霉素、头孢菌素和氟喹诺酮类药物破坏结肠菌群引起的。结肠微环境中的这种扰动，以及暴露于艰难梭菌孢子，导致了在受影响个体中的定植。大约三分之一的所有被定植的患者发展了CDAD，这可能导致严重的腹泻、结肠的穿孔、结肠切除和死亡。因此，提供了该些方法，凭此受试者被给药本发明的一种或多种抗体以治疗艰难梭菌感染或CDAD。[0066]如在此使用，“治疗”是指通过给药本文提供的抗体和疗法，赋予具有艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病的受试者的任何益处。例如并且非限制性地，这样的一个益处可以是一种或多种症状或不良反应的消除，或由感染或疾病引起的一种或多种症状或不良反应的严重性的减小或改善;感染或疾病的进展的延迟、停止或逆转；胃肠道、结肠、肠等的正常和天然微生物群落的重新定殖、复苏或种群恢复;或感染或疾病的治愈（即，临床医师将评估受试者并确定受试者不再具有感染或疾病）。与艰难梭菌感染相关的症状或不良反应包括脱水、腹泻、绞痛、肾衰竭、肠穿孔、中毒性巨结肠，其可导致结肠的破裂和死亡。所提供的治疗方法可以用于减少、减轻、改善或消除本文提供的任何或全部症状或不良反应。[0067]如在此使用，“艰难梭菌感染”是指在从前不存在艰难梭菌的肠道菌群中的艰难梭菌的存在或艰难梭菌在肠道菌群中的存在的改变例如，相对于一种或多种其他的细菌，艰难梭菌的总量的增加等）引起的感染，其引起或可能引起一种或多种不良反应和或毒素A和或B的水平在肠道或包括胃肠道的其他器官和组织中的增加。通常，CDAD是肠道中艰难梭菌的获得和增殖引起的。在体内，毒素A和B表现出不同的病理特征，在引起疾病方面具有潜在的协同作用。例如，在兔子和小鼠中，毒素A是诱导腹泻的肠毒素，而毒素B在该物种中不引起流体反应。然而，毒素B在体外是更有力的细胞毒素。艰难梭菌的毒素A阴性、毒素B阳性A-B+菌株已经受到了越来越多的报道。由于tcdA基因的重复域的缺失，A-B+菌株不能产生毒素A，但仍能够引起临床疾病。相比之下，迄今为止还没有人类中毒素A阳性，毒素B阴性A+B-菌株的报道。[0068]艰难梭菌感染通常表现为轻度至中度腹泻，偶尔有腹部绞痛。偶尔会观察到假膜，其是肠粘膜上附着的黄白斑。在极少数情况下，具有艰难梭菌感染的患者可能会出现急性腹部的和暴发性的危及生命的结肠炎，这是由于结肠正常细菌菌群的破坏、艰难梭菌的定殖和引起粘膜炎症和损坏的毒素的释放引起的。抗生素治疗是改变结肠菌群的关键因素。虽然正常的肠道菌群抵抗艰难梭菌的定殖和过度生长，但是抑制正常菌群的抗生素使用允许了艰难梭菌细菌的增殖。艰难梭菌存在于2%-3%的健康成年人和多达70%的健康婴儿中。在其中的一个方面，本发明的mAb用于治疗无症状但易于或有风险获得艰难梭菌感染并且患上其相关疾病的受试者。这些受试者可能在住院或可能在医院环境以外。[0069]艰难梭菌相关疾病的主要风险因素是先前暴露于抗生素。涉及艰难梭菌性结肠炎的最常见的抗生素包括头孢菌素尤其是第二代和第三代）、氨苄青霉素阿莫西林和克林霉素。不那么常见的相关抗生素是大环内酯类（即红霉素、克拉霉素、阿奇霉素和其他青霉素。偶尔报道引起疾病的化合物或其他药剂包括氨基糖苷类、氟喹诺酮类、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲恶唑、甲硝唑、氯霉素、四环素、亚胺培南、和美罗培南。即使是短暂暴露于任何单一抗生素也会引起艰难梭菌性结肠炎，特别是如果正常的肠道菌群受到不利影响或被杀死时。长期的抗生素疗程或使用两种或更多种抗生素会增加疾病的风险。传统上用于治疗艰难梭菌性结肠炎的抗生素已示出会引起疾病。与艰难梭菌感染相关的其他风险因素包括高龄65岁）；减弱的免疫系统;最近住院特别是与感染患者共享病房、重症监护病房停留和长期住院）；住在疗养院、收容所或其他长期护理机构;腹部手术;慢性结肠疾病例如炎性肠病（IBD或结肠直肠癌）；服用可以减少胃酸，并使艰难梭菌更容易地进入肠道的处方药或非处方药抑酸剂;和以前的艰难梭菌感染。与艰难梭菌病相关的更多因素包括抗肿瘤药剂，主要是甲氨蝶呤、溶血性尿毒症综合征、恶性肿瘤、肠缺血、肾衰竭、坏死性小肠结肠炎、希尔施普龙病、IBD和非手术胃肠处理，包括鼻胃管。可以给药本文提供的治疗的受试者包括具有艰难梭菌感染风险的被描述的任何受试者。[0070]虽然大多数艰难梭菌性结肠炎患者在没有特异性治疗的情况下恢复，但症状可能会延长和使人虚弱。艰难梭菌相关性腹泻会是严重的病症，身体虚弱的老年患者中因此的死亡率高达25%。聚焦于更严重的病患者的报告表明死亡率为10%_30%。艰难梭菌感染在老年人中更常见，年纪大可能会促进对定殖和疾病的易感性。虽然婴儿和幼儿经常携带艰难梭菌及其毒素，但临床感染并不常见。艰难梭菌的交叉感染在新生儿护理病房中很常见，但是新生儿似乎并没有发展艰难梭菌相关性腹泻。[0071]治疗方法[0072]本披露提供了治疗艰难梭菌感染、艰难梭菌相关疾病及其症状的方法，该方法包括使用一种或多种具有增强的半衰期的分离的抗体或其抗原结合片段，它们抑制、阻断或防止艰难梭菌毒素A和或毒素B的毒性或活性。艰难梭菌的病理学是由两种分泌的毒素A和B驱动的，它们介导这一疾病的特征性的结肠炎、腹泻和大量炎性反应。毒素A和B是艰难梭菌的主要毒力决定因素，毒素阴性菌株是非致病性的。毒素A和B从包括毒素基因tcdA毒素A和tcdB毒素B，以及三个调节基因（其中一个（tcdC编码毒素转录的推定的阴性调节子的致病性基因座转录。TcdC蛋白似乎在细菌生命周期的早期指数生长阶段抑制毒素转录。对于毒素B，已经描述了亮氨酸543和甘氨酸544之间的自催化切割位点。裂解由宿主细胞溶质磷酸肌醇激活天冬氨酰蛋白酶结构域而引起，并且释放活性葡糖基转移酶结构域。[0073]毒素中和抗体先前已经在减少⑶I复发方面表现出临床益处。PA50YTEPA41YTE组合是具有增强的半衰期的两种完全的人单克隆抗体的等摩尔混合物，这两种抗体结合并且中和毒素A和B的细胞毒性。在仓鼠感染模型中，PA50YTEPA41YTE组合在治疗致死性艰难梭菌感染中比万古霉素更有效。与目前临床试验中的抗毒素抗体相比，PA50YTEPA41YTE组合在体外表现出更大的毒素中和效力，并且中和了来自更广泛的临床隔离种群中的毒素。重要的是，在仓鼠感染模型中，与现有的抗毒素单克隆抗体相比时，PA50YTEPA41YTE组合提供了优异的保护。此外，包含PA50YTEPA41YTE组合的单克隆抗体用延长的半衰期技术进行了改造，与标准IgG相比，提供了3倍扩张的毒素中和的窗口，提供了数月的针对感染复发的预防。[0074]用PA50YTEPA41YTE组合作为单一疗法或与短期抗生素联合治疗艰难梭菌感染应能提供临床病症和症状的快速减轻。通过PA50YTEPA41YTE组合治疗使可能实现的抗生素暴露的消除或最小化应允许患者比通过全程的标准抗生素治疗将可能实现的结果更快地重建其保护性微生物群系。用具有增强的半衰期的抗毒素A和抗毒素B抗体的治疗可以允许在感染艰难梭菌的受试者中恢复正常的肠道菌群。此类的抗体可以解决正在接受治疗的患者的疾病。具有增强的半衰期的抗毒素A和抗毒素B抗体的治疗也可以表现出有益的体内药代动力学。具有增强的半衰期的抗毒素A和抗毒素B抗体的治疗也可以为已经感染艰难梭菌的受试者提供延长的或长期的治疗。如在此使用，“长期的”是指在停止治疗后一个月或更长时间，导致艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病的不存在的治疗。优选地，该治疗导致艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病在两个或更多个月中不存在。在一些实施例中，本发明的mAb的治疗导致治疗或抑制活性的艰难梭菌感染以及减少或减轻感染的稳健性。在其他实施例中，本发明提供的治疗导致在受试者中艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病不存在持续1、2、3、4、5或6个月。在其他实施例中，本发明提供的治疗导致在受试者中艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病不存在超过6个月。具有增强的半衰期的抗毒素A和抗毒素B抗体的治疗可以防止艰难梭菌感染和或艰难梭菌相关疾病的复发。[0075]作为另一个实例，具有增强的半衰期的抗毒素A和抗毒素B抗体的治疗可以产生至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或甚至100%的治愈率或存活率。作为另一个实例，抗体可以产生100%的治愈率或存活率。在一个实施例中，当向受试者给药一种或多种抗毒素A抗体和一种或多种抗毒素B抗体时，产生50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100的治愈率或存活率。如在此使用，“治愈率”是指临床医生将确定给药了本发明的一种或多种抗体或其一种或多种治疗方法的具有该感染或疾病的受试者的群体中不再具有该感染或疾病的受试者的百分比。本文所用的“存活率”是指给药本发明的一种或多种抗体或其一种或多种治疗方法的受试者的群体中存活了一个希望的时段的受试者的百分比。[0076]PA50YTEPA41YTE组合的长血清半衰期还提供连续的毒素中和的窗口，进一步最小化了⑶I的复发。总而言之，PA50YTEPA41YTE组合是精准医疗的一个实例，该精准医疗有效治疗困难的细菌感染，而不会产生与传统抗生素治疗相关的对有益微生物群系的附带损伤。[0077]PA50YTEPA41YTE组合和万古霉素治疗方案[0078]如以下详细报告的那样，PA50YTEPA41YTE组合在治疗艰难梭菌感染方面至少与万古霉素一样有效。PA50YTEPA41YTE组合通过竞争性地抑制与肠壁结合的毒素而起作用，从而使得肠壁不那么容易受到艰难梭菌感染。相比之下，万古霉素是一种杀细菌剂。在具体实施例中，万古霉素和PA50YTEPA41YTE组合可以同时给药。这种联合治疗策略将可能需要比常规万古霉素治疗更低剂量或减少的万古霉素的给药的频率，从而减少不利的副作用，增强微生物群系的恢复，减少微生物群系失调和或降低再感染的风险。[0079]描述了常规的万古霉素的剂量和给药，并且它们在本领域中是已知的（参见例如，Rybak等人，AmJHealthSystPharm[美国保健系统药物杂志]·2009;66I:82-98;AmericanSocietyofHealth-SystemPharmacists[美国卫生系统药师协会]，theInfectiousDiseasesSocietyofAmerica[美国传染病学会]、以及theSocietyoflnfectiousDiseasesPharmacists[传染性疾病药师协会]。万古霉素剂量按实际体重ABW计算。然而，对于肥胖患者，初始给药基于ABW，并且然后基于血清万古霉素浓度进行调整以达到治疗水平。每8-12小时给予15-20毫克千克基于ABW的万古霉素剂量在大多数肾功能正常的患者中实现目标血清浓度MIC〈lmgL例如，每12小时1克）。在一个实施例中，以针对患者肌酐清除水平CrCL推荐的给药间隔给药维持剂量约15-20mgkg的实际体重，四舍五入至最接近的250mg参见表2。最大初始剂量约为每12小时约1750毫克，直到血清浓度监测表明需要更高剂量。示例性的万古霉素维持剂量和输注速率在表1中提供。[0080]表1.万古霉素维持剂量和输注速率[0081][0082]为了实现严重疾病患者的这一目标浓度的快速达标，可以使用25-30mgkg基于ABW的负荷剂量。在一个实施例中，以约500mg小时（但不超过约Ig小时）的速率进行约25-30mgkg的实际体重（四舍五入至最接近的250mg的一次性负荷剂量可以考虑用CrCL30mLmin的严重疾病患者例如败血症、发烧和嗜中性白血球减少症、怀疑证实的MRSA菌血症），以迅速达到治疗浓度。示例性的万古霉素负荷剂量和输注速率在表2中提供。[0083]表2.万古霉素负荷剂量和输注速率[0084][0085]推荐血清指标成果的个体药代动力学调整和验证。[0086]应在至少1小时的输注时间段里静脉内给药万古霉素以最小化输注相关的不良反应。万古霉素可以通过间歇给药或连续输注来给药。当个体剂量超过Ig即1.5和2g时，输注时间段应延长至1.5-2小时。万古霉素给药间隔部分地基于患者的肌酐清除水平CrCL。例如，在表3中提供了基于估计的CrCL的万古霉素给药间隔。[0087]表3.基于估计的肌酐清除水平CrCL的万古霉素给药间隔。[0088][0089]为了治疗假膜性结肠炎，可以口服给药万古霉素以达到结肠中感染的部位。为了治疗成年人的艰难梭菌感染，常规方案是口服给药约125mg万古霉素，约每6小时给药一次，持续10天。在儿童中，常规方案是口服给药万古霉素，约40mgkg天，每6-8小时给药一次，持续7-10天；不超过2克天。与艰难梭菌的敏感菌株的MIC彡2ygml相比（Pelaez等人，AntimicrobAgentsChemother[抗微生物剂化疗]，2002;466:1647-1650，在口服给药后，万古霉素的奠便浓度可以为约500ygmlEdlund等人，ClinicalInfectiousDiseases[临床感染性疾病]，1997;253:729-32。[0090]谷血清万古霉素浓度是用于监测万古霉素有效性的最准确和实用的方法。在稳态条件下，应正好在下次剂量之前获得谷浓度。稳态成就是可变的，并且取决于多个因素。正好在正常肾功能患者的第四剂量之前应该获谷样品，以确保达到目标浓度。基于改善渗透、提高最佳目标血清万古霉素浓度的可能性、并且改善感染的临床疗效的潜力，推荐总谷血清万古霉素浓度为15_20mgL。如果MIC彡lmgL，大多数患者在该范围内的谷血清万古霉素浓度应达到AUC浓度对比时间曲线下的面积MIC最小抑制浓度）多400。为了快速实现严重疾病患者的目标浓度，可以考虑25-30mgkg基于ABW的负荷剂量。[0091]已经提倡彡400的AUCMIC比作为万古霉素达到临床有效性的目标。动物研究和有限的人类数据似乎表明万古霉素不是浓度依赖性的，并且AUCMIC是万古霉素的预测药代动力学参数。基于提示暴露于〈l〇mgL的谷血清万古霉素浓度可以产生抗药性菌株的证据，建议将谷血清万古霉素浓度始终维持在l〇mgL以上，以避免抗性的发展。如果在正常肾功能患者中万古霉素MIC彡2mgL即70-100mLmin的CrCL，常规给药方法不能实现彡400的目标AUCMIC。因此，应考虑替代疗法。[0092]万古霉素早已被认为是肾毒性和耳毒性药剂。在若干天的万古霉素治疗之后，如果证实了多次至少两个或三个连续的）高血清肌酸酐浓度从基线增加〇.5mgdL或多50%增加，择其高者），在没有替代性的解释的情况下，患者应该被鉴定为经受了万古霉素诱导的肾毒性。[0093]监测谷血清万古霉素浓度以减少肾毒性最适合于接受以产生持续的15-20mgL谷药物浓度为目标的进攻性给药的或面临高毒性风险的患者，例如正在接受并发的肾毒素的患者。当需要该目标范围时，推荐在血液动力学稳定的患者中获得每周一次的谷浓度。接受万古霉素长期疗程的患者应具有至少一种获得的稳态谷浓度正好在第四剂量之前）。还建议对肾功能不稳定（恶化抑或显着改善）的患者和接受长期疗程治疗超过三至五天）的患者进行监测。频繁在一些情况下，每天谷浓度监测是可取的，用来防止血液动力学不稳定患者体内的毒性。监测的确切频率通常是临床判断的问题。[0094]抗艰难梭菌毒素A和毒素B抗体[0095]本文描述的治疗方法包括一种或多种具有增强的半衰期的分离的抗体，包括抗原结合片段及其修饰的衍生物的用途，它们抑制、阻断或防止艰难梭菌毒素A和或毒素B的毒性或活性。US20130202618US8986697中描述了示例性的抗tcdA例如，PA-50、PA-39和PA-38和抗tcdB抗体例如PA-41，将这些文件中的每一个通过引用以其全部内容结合在此。示例性抗体还可以包含按SEQIDN0:7-22的VH、VL、重链和轻链序列中的一个或多个。[0096]在一方面，本发明提供治疗的方法，该方法包括使用分离的抗体或其抗原结合片段，它们抑制、阻断或防止毒素A内化和细胞毒性。在某些实施例中，该抗体是单克隆抗体。在具体实施例中，该抗体是人源化的或嵌合的抗体。在特定实施例中，该抗体是PA-50ATCC登录号PTA-964或人源化PA-50。在其他实施例中，该抗体是PA-39ATCC登录号PTA-9692或人源化PA-39。在不同实施例中，该抗体的在艰难梭菌的毒素A的受体结合结构域之外结合毒素A。[0097]在另一方面，这些方法包括使用分离的抗体或其抗原结合片段，它们通过结合毒素B的N-末端酶促区域中的表位部位来抑制、阻断或防止艰难梭菌毒素B的毒性。在某些实施例中，该抗体是单克隆抗体。在具体实施例中，该抗体是人源化的或嵌合的抗体。在特定实施例中，该抗体是PA-41ATCC登录号PTA-9693或人源化形式的PA-41。在不同实施例中，该抗体结合艰难梭菌的毒素B的N-末端酶促区域。[0098]本发明的抗体表现出许多有益的特征。例如，抗毒素A抗体在体外和体内都中和或抑制毒素A的毒性。在体外中和研究中，与已经报道的其他人抗毒素A和抗毒素B单克隆抗体TO2006121422;US20050287150;Babcock等人，Infect.Immun.[感染与免疫]，2006的中和值相比，人源化PA-39和人源化PA-41表现出比那些更高的中和效力（S卩EC5q值；US20130202618US8986697〇[0099]在不同实施例中，本发明提供了具有增强的半衰期的抗体的治疗。抗艰难梭菌毒素抗体（例如，PA-39、PA-41、PA-50可以连接到另一个功能分子，例如另一种肽或蛋白质例如白蛋白）上。例如，这些抗体可以通过化学交联或通过重组方法连接。这些抗体还可以按以下专利中所列出的方式连接至多种非蛋白质聚合物例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯中的一种：美国专利号4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192;或4，179,337。这些抗体可以通过共价缀合至一种聚合物而被化学地修饰，例如来增加它们的循环半衰期。附接这些抗体的示例性聚合物和方法还在美国专利号4，766，106;4，179，337;4，495,285以及4,609,546中示出。[0100]在某些实施例中，抗体的Fc区在选自252、254和256的一个或多个位置处包含至少一个非天然存在的氨基酸。在不同实施例中，非天然存在的氨基酸选自下组，该组选自252Y、254T和256E称为“YTE修饰”），如在DalTAcqua等人，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，281,23514-235242006，和US7083784US20030190311中描述，将这些文件中的每一个通过引用以其全部内容结合在此。与未修饰抗体例如亲本抗体相比，具有YTE修饰的抗体具有增强的半衰期。在一个实施例中，ΡΑ-50-ΥΤΕ是具有增强的半衰期的完全的人单克隆抗体，其结合并且中和毒素A的细胞毒性。在一个实施例中，ΡΑ-41-ΥΤΕ是具有增强的半衰期的完全的人单克隆抗体，其结合并且中和毒素B的细胞毒性。在一方面，本发明的特征在于包含称为ΡΑ50ΥΤΕΡΑ41ΥΤΕ组合在于2015年4月15日提交的优先权申请US62147,908中也称为ΡΑ50ΥΤΕΡΑ40ΥΤΕ组合的抗毒素A抗体ΡΑ-50-ΥΤΕ和抗毒素財允体ΡΑ-41-ΥΤΕ的等摩尔混合物的组合物。[0101]在一个实施例中，抗毒素A抗体以有效剂量中和或抑制艰难梭菌毒素A的体内毒性。在另一个实施例中，抗毒素B抗体中和或抑制毒素B的体内毒性。在一个实施例中，向艰难梭菌感染的受试者提供有效剂量的一种或多种抗毒素A抗体。在一个实施例中，将有效剂量的本发明的一种或多种抗毒素A抗体与有效剂量的本发明的一种或多种抗毒素B抗体结合，提供给艰难梭菌感染的受试者。在一个实施例中，本发明的抗毒素A抗体与本发明的抗毒素B抗体以1:1的组合作为有效剂量提供给艰难梭菌感染的受试者。在一个实施例中，有效剂量的本发明的抗毒素A抗体和抗毒素B抗体可以按例如12:1、1:1、2:1、3:1、4:1等的抗体的组合，提供给艰难梭菌感染的受试者。在一个实施例中，该抗体是人源化的。在一个实施例中，该抗体被包括在一种组合物中。[0102]说明性地，抗毒素A和或抗毒素B抗体的有效剂量可以范围是从0.Iyg至1000毫克mg。抗毒素A抗体和抗毒素B抗体或其抗原结合片段可以按以下的量给药受试者，例如0·lmgkg_150mgkg的量、0·5mgkg_75mgkg的量、lmgkg-100mgkg的量、lmgkg_50mgkg的量、2mgkg-40mgkg的量、2mgkg-50mgkg的量、5mgkg-50mgkg的量、5mgkg-25mgkg的量、10mgkg-40mgkg的量、10mgkg-50mgkg的量、10mgkg-25mgkg的量、或15mgkg-50mgkg的量。在一个实施例中，上述量可以包括组合物中提供的抗毒素A抗体和抗毒素B抗体的变化比率。[0103]在一些实施例中，一种或多种抗毒素A或抗毒素B抗体的剂量或量可以范围是例如从0.2yg-250yg，或从2yg-50yg，或从5yg-50yg，例如，基于体内小鼠研究。在一些实施例中，一种或多种抗毒素A或抗毒素B抗体，并且特别是抗毒素A抗体和抗毒素B抗体的组合的剂量或量可以范围是例如从2mgkg-40mgkg、2mgkg-50mgkg、5mgkg-40mgkg、5mgkg-50mgkg、10mgkg-40mgkg、或10mgkg-50mgkg，例如，基于体内仓鼠研究。[0104]本文提供的抗体包括由杂交瘤产生的单克隆抗体，这些杂交瘤被保藏，并且给予了以下专利保藏命名号：PTA-9692PA-39、PTA-9693PA-41、PTA-9694PA-50JPPTA-9888PA-38。于2009年I月6日（保藏了PTA-9692、PTA-9693、PTA-9694和2009年3月24日保藏了PTA-9888按照和满足了用于专利程序的目的的国际承认的微生物保藏的布达佩斯条约的规定，在作为一家国际保藏单位的美国典型培养物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection保藏了这些杂交瘤，邮政信箱1549,马纳萨斯Manassa，弗吉尼亚州，20108美国），并且它们给给予了上述专利保藏命名号。如在此使用，这些保藏的杂交瘤和由这些杂交瘤所产生的单克隆抗体可以用相同的ATCC保藏命名号或ATCC保藏命名号内发现的数字来指代。例如，PTA-9888或9888可以用于指保藏的杂交瘤或由该杂交瘤产生的单克隆抗体。因此，本文所述的单克隆抗体的名称可以与产生它们的杂交瘤的名称可互换地使用。本领域技术人员将清楚何时名称旨在指抗体，或指产生抗体的杂交瘤时。本文提供的抗原结合片段包括上述保藏的抗体的抗原结合片段。[0105]抗体生产的方法[0106]抗体的制备可以例如使用传统的杂交瘤技术Kohler和MiIstein1975Nature[自然]，256:495-499、重组DNA方法（美国专利号4，816，567、或用抗体、文库进行的噬菌体展不（Clackson等人（1991Nature[自然]，352:624-628;Marks等人（1991，J.Mol.Biol·[分子生物学杂志]，222:581-597。对于其他抗体生产技术，还参见Antibodies=ALaboratoryManual[抗体:实验室手册]，哈Harlow等人编著，冷泉港实验室ColdSpringHarborLaboratory，1988。本发明不限于任何特定的来源、起源物种、或生产方法。[0107]完整抗体，也被称为免疫球蛋白，典型地是四聚体糖基化蛋白质，该四聚体糖基化蛋白质由每个大约25kDa的两条轻L链和每个大约50kDa的两条重链H构成。被指定为λ链和κ链的两种类型的轻链被发现于抗体中。根据重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分为五个大类:A、D、E、G、和Μ，并且有些可进一步分为亚类（同种型），例如IgG^IgG2、IgG3、IgG4、IgAi、和IgA2。[0108]不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型在本领域中是公知的。对于抗体结构的综述，参见Harlow等人，见上文。简单地说，每个轻链由一个N-末端可变结构域Vl和一个恒定结构域Cl构成。每个重链由一个N-末端可变结构域Vh，三个或四个恒定结构域Ch和铰链区构成。最邻近Vh的Ch结构域被指定为ChIJh和Vl结构域由称为框架区（FR1、FR2、FR3、和FR4的相对保守序列的四个区域组成，该框架区为称为互补性决定区（CDR的高变序列的三个区域形成一个支架。CDR包含大多数负责与抗原特异性相互作用的残基。三个⑶R被称为⑶Rl、CDR2和⑶R3。重链上的⑶R组分被称为Hl、H2和H3，而轻链上的⑶R组分相应地被称为L1、L2、和L3XDR3和特别是H3,是抗原结合结构域中分子多样性的最大来源。例如，H3可以是短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸残基。在特定的实施例中，一个重链CDR3H3包含约4个氨基酸渗见例如抗体第2号至22个氨基酸渗见例如抗体第20和34号）。[0109]Fab片段抗原结合片段）由通过恒定区之间的二硫键共价连接的Vh-ChI和Ι-α结构域组成。为了克服Fv中非共价连接的Vh和Vl结构域在宿主细胞中共表达时离解的倾向，可构建一个所谓的单链scFv片段scFv。在scFv中，柔性和足够长的多肽将Vh的C末端链接至Vl的N-末端或将Vl的C末端链接至Vh的N-末端。最通常地，一个15残基的OUy4Ser3多肽可用作接头，但是其他接头在本领域中也是已知的。[0110]抗体多样性是编码可变区和各种体细胞事件的多个种系基因的组合装配的结果。体细胞事件包括具有多样性D的可变基因区段和连接J基因区段的重组来构成一个完整的Vh区以及可变基因区段和连接基因区段的重组来构成一个完整的Vl区。重组过程本身是不精确的，导致在V⑶J交叉点的氨基酸的缺失或增加。多样性的这些机制发生在抗原暴露之前的发育的B细胞中。抗原刺激后，B细胞中表达的抗体基因经历体细胞突变。[0111]基于种系基因区段的估计的数目、这些区段的随机重组和随机Vh-Vl配对，可产生多达1.6XIO7个不同的抗体FundamentalImmunology[基础免疫学]，第3版，Paul编著，雷文出版社RavenPress，纽约州纽约市，1993。当将促进抗体多样性例如体细胞突变）的其他方法考虑在内时，据认为可以潜在地产生多于IX1〇1个不同的抗体ImmunoglobulinGenes[免疫球蛋白基因]，第2版，Jonio等人编著，学术出版社AcademicPress，加利福尼亚州圣地亚哥，1995年）。因为许多方法涉及抗体多样性，独立地产生的抗体在多个⑶R中将具有相同或甚至基本上相似的氨基酸序列是极不可能的。[0112]用于携带CDR的结构将大体上是一个抗体重链或轻链或其一部分，其中该CDR位于对应于天然存在的Vh和Vl的CDR的位置。可以确定免疫球蛋白可变结构域的结构和位置，例如，如描述于卡巴特（Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest[免疫学目的的蛋白质序列]，第91-3242号，NationalInstitutesofHealthPubIications[国立卫生研究院出版物]，马里兰州贝塞斯达，1991年。[0113]抗艰难梭菌毒素A和毒素B抗体可以任选地包含抗体恒定区或其各部分。例如，I结构域可在其C-末端附接抗体轻链恒定结构域，包括人Ck或α链。类似地，基于Vh结构域的特定的抗原结合结构域可能附接一个免疫球蛋白重链的全部或一部分，该免疫球蛋白重链起源于任何抗体同位素，如IgG、IgA、IgE和IgM，和任何该同位素子类，其包括但不限于IgGi和IgG4。用于C-末端片段的DNA和氨基酸序列在本领域中是众所周知的（参见（例如Kabat等人，SequencesofProteinsoflmmunologicalInterest[免疫学目的的蛋白质序列]，第91-3242号，NationalInstitutesofHealthPublications[国立卫生研究院出版物]，马里兰州贝塞斯达，1991年）。[0114]某些实施例包括来自艰难梭菌毒素A或毒素B抗体的Fv片段的Vh和或Vl结构域。进一步的实施例包括任何这些Vh和Vl结构域的至少一个⑶R。在某些实施例中，Vh和或Vl结构域可以被种系化，即使用常规分子生物学技术使这些结构域的框架区FR突变以匹配由种系细胞所产生的那些。在其他实施例中，构架序列保持与共有种系序列不同。[0115]本领域普通技术人员将认识到，本发明的抗体可用于抑制与毒素A或毒素B有些不同的蛋白质。这些抗体预计有望保持结合的特异性，只要靶蛋白质包括与毒素A或毒素B的至少100、80、60、40、或20个连续氨基酸的任何序列具有至少约60%、70%、80%、90%、95%、或更高一致性的序列。百分比一致性是通过标准比对算法来确定，这些标准比对算法例如是Altshul等人描述的基本局部比对工具BLAST1990,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，215:403-410,Needleman等人的算法（1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，48:444-453，或Meyers等人的算法（1988，Comput.Appl.Biosci·[计算机应用生物科学]，4:11-17。[0116]除了序列同源性分析，可以进行表位作图（参见，例如，EpitopeMappingProtocols[表位作图实验方案]，Morris编著，胡玛纳出版社HumanaPress，1996年和二级和三级结构分析，以鉴定由所披露的抗体假定的具体3D结构和它们与抗原的复合物。这样的方法包括但不限于X射线晶体学Bngstom1974Biochem.Exp.Biol.[生物化学实验生物学]，11:7-13和本披露的抗体的虚拟表现形式的计算机建模Fletterick等人1986ComputerGraphicsandMolecularModeling[计算机图形学和分子建模]，在CurrentCommunicationsinMolecularBiology[分子生物学现代通讯]中，冷泉港实验室，纽约州冷泉港。[0117]试剂盒[0118]本发明提供了用于治疗艰难梭菌感染或其症状的试剂盒。在一个实施例中，该试剂盒包括包含处于单位剂型的、有效量的具有增强的半衰期的抗毒素A抗体和或抗毒素B抗体中的一种或多种的治疗组合物。[0119]在一些实施例中，该试剂盒包括包含治疗或预防生物组合物的无菌容器;这些容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其他适合的容器形式。这些容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箱、或适于容纳药物的其他材料制成。[0120]如果需要的话，将本发明的抗体与用于向受试者给药抗体或药剂的说明书一起提供，该受试者患有或具有发展艰难梭菌感染、艰难梭菌相关疾病或其症状的风险。说明书将一般包括关于使用抗体用于治疗或预防这样的适应症的信息。在其他实施例中，这些说明书包括以下各项中的至少一个:对治疗剂的描述；用于治疗或预防艰难梭菌感染或其症状的剂量时间表和给药;预防措施;警告;适应症;反向适应症;超剂量信息不良反应;动物药理学;临床研究;和或参考文献。这些说明书可以直接打印在容器（当存在时上，或作为标记应用于容器，或作为单独的页、小册子、卡片、或在容器中或一起提供的文件夹。[0121]除非另外指明，本发明的实施采用很好地处在熟练的技术人员的见识范围之内的分子生物学包括重组技术）、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这样的技术在文献中被充分阐明，诸如，“MolecularCloning:ALaboratoryManual[分子克隆：实验室手册]”，第二版（Sambrook,1989;“OligonucleotideSynthesis[寡核苷酸合成]”（Gait,1984;“AnimalCellCulture[动物细胞培养]”（Freshney,1987;“MethodsinEnzymology[酶学方法]”“HandbookofExperimentalImmunology[实验免疫学手册]”Weir,1996；uGeneTransferVectorsforMammalianCells[用于哺乳动物细胞的基因转移载体]”（Miller和Calos,1987;“CurrentProtocolsinMolecularBiology[当代分子生物学实验技术]”（Ausubel,1987;“ThePolymeraseChainReaction[PCR:聚合酶链式反应]”（Mullis,1994;“CurrentProtocolsinImmunology[当代免疫学实验技术]”Coligan，1991。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的生产，并且按照这样，可以被考虑用于制备和实施本发明。对具体实施例特别有用的技术将在下面的部分进行讨论。给出以下的实例是为了给本领域普通技术人员提供如何在本发明的试验、筛选和治疗方法中制备和使用抗-P2X4抗体的完整的披露和说明，而不是旨在限定诸位发明人认为是自己的发明的范围。[0122]给出以下的实例是为了给本领域普通技术人员提供如何准备和使用测试、筛选和本发明的治疗方法的一个完整的公开和说明，而不是旨在限定诸位发明人认为是自己的发明的范围。[0123]查·[0124]实施例1:抗毒素A和抗毒素B单克隆抗体的组合的治疗增加了艰难梭菌感染的模型中的存活并且针对毒性进行了保护。[0125]艰难梭菌感染的仓鼠模型复制了人类中艰难梭菌相关性腹泻CDAD疾病的关键方面。用抗生素治疗时，正常的结肠菌群被根除，并且仓鼠变得容易受到艰难梭菌的感染。感染导致严重腹泻、假膜性结肠炎和死亡。仓鼠CDAD模型用于评估单克隆抗毒素A和抗毒素B抗体在预防与艰难梭菌活菌激发动物相关的疾病和死亡方面的潜在疗效。[0126]在第0天通过口服给药用艰难梭菌孢子激发仓鼠，并在第1天用单次剂量的克林霉素（l〇mgkg预处理仓鼠以破坏正常的结肠菌群。在第二天，将动物置于不接受治疗的对照组和接受万古霉素在第2、3、4、5和6天抑或毒素A和毒素B抗体PA-50-YTE40mgkg和PA-41-YTE40mgkg的组合也称为MEDI095的组中。每天监测动物的健康状况和生存情况。[0127]没有接受治疗的感染对照组中的所有仓鼠在研究的第3天前都死亡。在万古霉素治疗组中，治疗在大多数动物中延长了3天以上的存活。然而，在停止治疗后，大多数动物约80%在研究结束时，第21天前死亡。相比之下，接受抗体PA-50-YTE和PA-41-YTE的组合即MEDI095的所有动物在激发后长达21天中示出了100%的存活率。因此，PA50YTEPA41YTE组合的治疗相对于抗生素治疗提供了优异且并且持续的感染后保护益处。[0128]其他实施例[0129]从前述说明中，将显而易见的是，可以对本文所述的发明作出变更和修改以使其适应于各种用途和状况。这样的实施例也在下述权利要求的范围内。[0130]在变量的任何定义中对要素清单的叙述在本文中包括将该变量定义为任何单个要素或所列要素的组合或次组合）。在此的实施例的叙述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分结合的实施例。[0131]本说明书中提及的全部专利和出版物通过引用方式以相同的程度结合在此，如同每份单独的专利和出版物具体地且个别地指出通过引用的方式结合。[0132]序列表[0133]SEQIDN0:1PA50-YTE重链[0134]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdynmdwvrqapgqrIewmgdinpkydiighnpkfmgrvtitrdtsastaymelsslrsedtavyycarsdrgwyfdvwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstSggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeIlggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsItclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk[0135]SEQIDN0:2PA50-YTE轻链[0136]eivltqspatlslspgeratlscrasssvnymnwyqqkpgqaprpliyatsnlasgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqwssrtfgggtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcIlnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec[0137]SEQIDN0:3PA41-YTE重链[0138]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgypftnyfmhwvrqapgqrlewigrinpyngatsyslnfrdkatitldksastaymelsslrsedtavyycarstitsplldfwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeIlggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsItclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk[0139]SEQIDN0:4PA41-YTE轻链[0140]eivltqspatlslspgeratlscrasqsvgtsihwyqqkpgqaprllikfasesisgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqsnkwpftfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec[0141]SEQIDNO:5艰难梭菌毒素ATcdA[0142][0143][0144]SEQIDNO:6艰难梭菌毒素BTcdB[0145][0146][0147]SEQIDNO:7抗毒素A抗体、人源化PA-39hPA-39的VH区[0148][0149][0150]SEQIDNO:8抗毒素A抗体、人源化PA-39hPA-39的VH区[0151][0152]SEQIDNO:9抗毒素A抗体，人源化PA-39hPA-39的VL区[0153][0154][0155]SEQIDNO:10抗毒素A抗体，人源化PA-39hPA-39的VL区[0156][0157]SEQIDNO:11抗毒素A抗体、人源化PA-50hPA-50的VH区[0158][0159]SEQIDNO:12抗毒素A抗体、人源化PA-50hPA-50的VH区[0160][0161][0162]SEQIDNO:13抗毒素A抗体，人源化PA-50hPA-50的VL区[0163][0164]SEQID从：14抗毒素8抗体、人源化?六-41〇^-41的¥!1区[0165][0166]SEQIDN0:15抗毒素B抗体、人源化PA-41hPA-41的VH区[0167][0168][0169]SEQID从：16抗毒素8抗体、人源化?4-41砂4-41的¥1^区[0170][0171]SEQIDNO:17抗毒素A抗体、重链[0178]SEQIDNO:19抗毒素A抗体、重链[0182]SEQIDNO:20抗毒素A抗体、轻链[0185]SEQIDNO:21抗毒素財允体、重链[0190]SEQIDNO:22抗毒素財允体、轻链

权利要求：1.一种在受试者中治疗艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病的方法，该方法包括向该受试者给药抗艰难梭菌毒素A抗体和抗艰难梭菌毒素B抗体的组合，所述抗艰难梭菌毒素A抗体和抗艰难梭菌毒素B抗体包含改变，相对于缺少这一改变的抗艰难梭菌毒素A和B抗体，这一改变增加了这两种抗体中一种或全部两种的半衰期。2.—种在受试者中治疗艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病的方法，该方法包括向该受试者给药抗艰难梭菌毒素A抗体和抗艰难梭菌毒素B抗体的组合以及万古霉素，从而相对于参考剂量或剂量频率，减少万古霉素的剂量或剂量频率。3.如权利要求2所述的方法，其中相对于缺少这一改变的抗艰难梭菌毒素A和B抗体，所述两种抗体中一种或全部两种具有增加的半衰期。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中这一改变是252Y、254T、或256E中的任意一种或多种。5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中这一改变与聚乙二醇PEG缀合或与白蛋白缀合。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该抗毒素A抗体具有包含序列SEQIDNO:1的重链：qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdynmdwvrqapgqrIewmgdinpkydiighnpkfmgrvtitrdtsastaymeIsslrsedtavyycarsdrgwyfdvwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgcIvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpsssIgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeIlggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsItclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgko7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该抗毒素A抗体具有包含序列SEQIDNO:2的轻链：eivltqspatlslspgeratlscrasssvnymnwyqqkpgqaprpliyatsnlasgiparfSgsgsgtdftltisslepedfavyycqqwssrtfgggtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcIlnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec〇8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该抗毒素A抗体是PA50-YTE。9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该抗毒素B抗体具有包含序列SEQIDNO:3的重链：qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgypftnyfmhwvrqapgqrlewigrinpyngatsysInfrdkatitldksastaymeIsslrsedtavyycarstitspIldfwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgcIvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpsssIgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeIlggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsItclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgko10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该抗毒素B抗体具有包含序列SEQIDN0:4的轻链：eivltqspatlslspgeratlscrasqsvgtsihwyqqkpgqaprIlikfasesisgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqsnkwpftfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcIlnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstysIsstItIskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecο11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中该抗毒素B抗体是PA41-YTE。12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该抗体的组合是PA50YTEPA41YTE组合。13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中PA50YTEPA41YTE组合以单一剂量给药。14.如权利要求2-13中任一项所述的方法，该方法进一步包括给药抗生素，例如万古霉素。15.如权利要求2-14中任一项所述的方法，其中该万古霉素经口或静脉内给药。16.如权利要求2-15中任一项的方法，其中该参考剂量和剂量频率是以15-20mgkg静脉内给药万古霉素，每天2-3次。17.如权利要求2-15中任一项所述的方法，其中该参考剂量和剂量频率是以125mg口服给药，每天3-4次。18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中该方法缩短了艰难梭菌再感染的时间。19.如权利要求1-18中任一项的方法，其中艰难梭菌毒素A和或毒素B被中和。20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中该方法在该受试者中增强了微生物群系的恢复，减少了微生物群系失调，和或减少了肠损伤。21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中相对于抗生素治疗，该方法增强了微生物群系的恢复和或减少了微生物群系失调。

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