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申请/专利权人：牛津纳米孔技术公司

摘要：本发明涉及一种新的表征目标多核苷酸的方法。所述方法利用孔和XPD解旋酶。所述解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动。

主权项：一种表征目标多核苷酸的方法，包括：a使目标多核苷酸与跨膜孔及XPD解旋酶接触，使得目标多核苷酸移动穿过所述跨膜孔，并使XPD解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动；和b当所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔移动时，获取一个或多个电流测量值，其中所述电流测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。

全文数据：使用XPD解旋酶表征多核苷酸的方法技术领域[0001]本发明涉及一种新的表征目标多核苷酸的方法。该方法使用孔及xro解旋酶。解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动。背景技术[0002]当前需要一种适合于各种应用的快速且廉价的多核苷酸（例如DNA或RNA测序和鉴定的技术。现有技术很慢并且昂贵，这主要是因为它们依赖于扩增技术来产生大量的多核苷酸并需要大量专门的荧光化学物质来检测信号。[0003]当跨膜孔纳米孔具有极大的用作聚合物及多种小分子的直接的电生物传感器的潜力。特别是，最近关注的是将纳米孔作为潜在的DNA测序技术。[0004]当跨纳米孔施加电势时，当分析物，如核苷酸，在桶内短暂停留一定时间段后，电流会发生变化。纳米孔检测核苷酸得到已知标志（signature的电流变化和持续时间。在"链测序"（"StrandSequencing"）方法中，使单个多核苷酸链穿过孔，得到对该核苷酸的鉴定。链测序可包括，使用核苷酸调控蛋白来控制多核苷酸穿过孔的运动。发明内容[0005]本发明已经证明了XPD解旋酶可控制多核苷酸穿过孔的运动，尤其是当对所述孔施加电势，例如电压时。解旋酶能够以可控和逐步的方式逆着或顺着由施加电压得到的场移动目标多核苷酸。出人意料的是，解旋酶能够在高盐浓度下起作用，所述高盐浓度对表征多核苷酸有利，特别是对使用链测序确定其序列有利。这将在下面更详细地讨论。[0006]因此，本发明提供了一种表征目标多核苷酸的方法，包括：[0007]a使目标多核苷酸与跨膜孔及XPD解旋酶接触，使得目标多核苷酸移动穿过所述跨膜孔，并使xro解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动;和[0008]b当所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔移动时，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。[0009]本发明还提供了：[0010]-一种形成用于表征目标多核苷酸的传感器的方法，包括在孔和xro解旋酶之间形成复合体并从而形成用于表征目标多核苷酸的传感器；[0011]-xro解旋酶在控制目标多核苷酸穿过孔的运动中的应用；[0012]-一种表征目标多核苷酸的试剂盒，其包括a孔和bxro解旋酶;和[0013]-一种用于表征样本中目标多核苷酸的分析装置，包括多个孔和多个xro解旋酶；[0014]-一种表征目标多核苷酸的方法，包括：[0015]a使目标多核苷酸与xro解旋酶接触，使得XPD解旋酶控制所述目标多核苷酸的运动;和[0016]b当XPD解旋酶控制所述目标多核苷酸的运动时，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并从而表征所述目标多核苷酸；[0017]-xro解旋酶在表征目标多核苷酸过程中控制目标多核苷酸的运动中的应用；[0018]-xro解旋酶在对目标多核苷酸的一部分或全部进行测序的过程中，控制目标多核苷酸的运动中的应用；[0019]--种用于表征样本中目标多核苷酸的分析装置，其特征在于其包括xro解旋酶；和[0020]--种表征目标多核苷酸的试剂盒，包括a用于表征所述目标多核苷酸的分析装置和bxro解旋酶。附图说明[0021]图1A为使用解旋酶控制DNA移动穿过纳米孔的实施例的示意图。反侧的箭头显示了DNA的运动方向。顺侧的箭头显示了解旋酶相对于DNA的运动方向。从左到右，具有含胆固醇标签的退火引物的单链DNA底物（图1B被添加到双分子层的顺侧。胆固醇标签结合到双分子层，将所述底物富集在双分子层表面。添加到顺式隔室ciscompartment的解旋酶结合到DNA。在二价金属离子和NTP底物存在时，解旋酶沿着DNA移动。在施加的电压下，所述DNA底物经DNA上的前导区部分被纳米孔捕获。在施加的电势的力的作用下，所述DNA被牵拉穿过所述纳米孔直到结合到DNA上的解旋酶与所述孔的顶部接触，防止进一步的不受控的DNA移位。所述解旋酶沿着所述DNA以5'到3'的方向运动，便于使螺旋状threadedDNA顺着施加的电场受控移位而穿过所述纳米孔。所述解旋酶促使DNA移位穿过纳米孔，使其进入反式隔室。穿过纳米孔的DNA的最后部分为3'端。当解旋酶已促使DNA穿过纳米孔的移位完成时，该解旋酶从该链上解离。图1B为在本实施例中使用的DNA底物设计之一。[0022]图2显示了解旋酶能够以受控方式使DNA移动穿过纳米孔，随着DNA移动穿过纳米孔，电流发生逐步变化。示例解旋酶-DNA事件（140mV，400mMNaCl，HepespH8.0,0.6nM400merDNA,100nMXPDMbu,lmMDTT,lmMΑΤΡ,ΙιήΜMgCl2。上部）为，获得的XHMOOmerDNA事件穿过MspAB2纳米孔的电流对时间的分图。开孔电流为~95pA。在施加的电势（+140mV的力的情况下，DNA被纳米孔捕获。连接有酶的DNA得到长的模块block在该条件下，在~25pA，随着酶使DNA移动穿过所述纳米孔，该模块显示出逐步变化的电流。下部），该下分图显示了解旋酶控制DNA运动事件之一的放大图，示出了DNA-酶的捕获、当DNA被牵拉出所述纳米孔时电流的逐步变化。[0023]图3显示了解旋酶控制DNA运动事件的另一个例子。下部为，所述事件的一部分的放大图，示出了当DNA链不同部分移动穿过纳米孔时电流的逐步变化。[0024]图4显示了解旋酶至少以两种操作模式控制DNA的移动。解旋酶沿着DNA的5'到3'的方向运动，而DNA在纳米孔中的定向（取决于该DNA的哪一端被捕获是指，所述酶能用于将DNA逆着施加的电场移出所述纳米孔，或者将DNA顺着该施加的电场移入所述纳米孔。左图）为，当DNA的3'端被捕获时，解旋酶逆着电压所施加的电场的方向起作用，将螺旋状DNA牵拉出纳米孔，并进入顺式隔室中。右图）为，当DNA的5'端（5'-down向下被捕获到纳米孔中时，解旋酶沿着电场的方向将DNA移动到纳米孔中，并进入到双分子层的反侧。[0025]图5显示了测试酶活性的荧光试验。A使用常规的荧光底物来检测解旋酶用于置换displace杂交的双链DNA的能力。1荧光底物链50nM终浓度具有5'单链DNA悬突，以及杂交的双链DNA的40个碱基部分。主链上部majorupperstrand在3'末端具有羧基焚光素碱基，并且所述杂交的互补链在5'末端具有黑洞淬灭剂black-holequencherBHQ-1碱基。当杂交时，荧光素的荧光被局部的BHQ-1淬灭，并且底物基本上是无荧光的。该试验中包括与荧光底物的较短链互补的ΙμΜ捕获链。2在ATPlmM和MgCl210mM的存在下，添加到底物的解旋酶（150nM结合至荧光底物的5'尾部，沿着主链移动，并如所示置换互补链。3具有BHQ-1的互补链完全被置换，主链上荧光素发荧光。4过量的捕获链优选与互补链DNA退火以防止初始底物重新退火并防止丢失荧光。B显示了在含有100mM至2M的不同浓度的KC1的缓冲溶液（lOOmMHepespH8.0，lmMATP，10mMMgCl2,50nM荧光底物DNA，lyM捕获DNA中的MbuXro解旋酶活性的初始速率的图。[0026]图6为实施例1中所用的垫片spaceriSpl8的结构。[0027]序列表的说明[0028]SEQIDN0:1示出了密码子优化的、编码MS-B1突变MspA单体的多核苷酸序列。该突变缺少信号序列并包括下列突变:D90N，D91N，D93N，D118R，D134I^PE139K。[0029]SEQIDN0:2示出了MspA单体的MS-B1突变的成熟形式的氨基酸序列。该突变缺少信号序列并包括下列突变:D90N，D91N，D93N，D118R，D134I^PE139K。[0030]SEQIDN0:3示出了编码α-溶血素-ElllNK147Na-HL-NN;Stoddartetal.，PNAS，2009;10619:7702-7707的一个亚基的多核苷酸序列。[0031]SEQIDN0:4示出了α-HL-NN的一个亚基的氨基酸序列。[0032]SEQID从:5至7示出了]\^?8、：和0的氨基酸序列。[0033]SEQIDN0:8和9示出了XH模序motifV和VI的氨基酸序列。[0034]SEQIDN0:10至62示出了表5中XH解旋酶的氨基酸序列。[0035]SEQIDN0:63至68示出了各实施例中使用的序列。具体实施方案[0036]应理解的是，公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的具体需求进行调整。还应理解的是，本文中使用的术语仅仅是为了描述本发明的具体实施方案，不意欲进行限制。[0037]另外，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式的"一个"、"所述"包括复数指代物，除非文中另有明确说明。因此，例如，涉及"一个孔"时包括两个或多个这样的孔，涉及"一个解旋酶"时包括包括两个或多个这样的解旋酶，涉及"一个多核苷酸"时包括两个或多个多这样的多核苷酸，等。[0038]所有在本文中引用的出版物、专利和专利申请，无论前文或后文，均以全文参考的方式纳入本文中。[0039]本发明的方法[0040]本发明提供了一种表征目标多核苷酸的方法。所述方法包括使目标多核苷酸与跨膜孔和xro解旋酶接触，使得目标多核苷酸移动穿过孔，并使xpd解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动。然后当目标多核苷酸相对于孔移动时，使用本领域已知的标准方法测量该目标多核苷酸的一个或多个特征。所述目标多核苷酸的一个或多个特征优选在该多核苷酸移动穿过所述孔时进行测量。步骤a和b优选通过跨所述孔施加电势而实施。如下文更详细的论述，施加电势通常导致在所述孔和解旋酶之间形成复合体。所施加的电势可以是电压电势。替代地，所施加的电势可以是化学电势。其一个例子是在跨两性分子层中使用盐梯度。Holden等人，JAmChemSoc.2007Julll;12927:8650-5中公开了盐梯度。[0041]在一些情形中，当多核苷酸相对于所述孔而移动时，使用穿过所述孔的电流来确定目标多核苷酸的序列。这就是链测序。[0042]所述方法具有多个优势。首先，本发明人出乎意料地发现xro解旋酶具有出乎意料的高的盐耐受性，因此本发明方法可以在高的盐浓度下实施。在链测序中，电荷载体，诸如盐，是产生导电溶液必须的，所述导电溶液用于施加补偿电压以捕获和异位目标多核苷酸以及当目标多核苷酸相对于孔移动时测定产生的序列依赖性电流变化。由于测量信号依赖于盐浓度，因此有利的是使用高的盐浓度以提高获得信号的强度。高的盐浓度提供了高信噪比，并使得在正常电流波动的背景下，代表核苷酸存在的电流能被识别。对于链测序，超过100mM的盐浓度是理想的，例如超过400mM，600mM或800mM的盐浓度。本发明人出乎意料地发现xro解旋酶能在极高的盐浓度下有效发挥作用，例如1M的盐浓度下。本发明包括在超过1M的盐浓度下，例如2M盐浓度下有效发挥作用的解旋酶。[0043]第二，当施加电压时，XPD解旋酶能出乎意料地朝两个方向，即逆着或顺着由施加的电压产生的电场而移动目标多核苷酸。因此，本发明的方法可以一种或两种优选方式实施。根据目标多核苷酸相对所述孔移动的方向，即顺着或逆着电场的方向，获得不同的信号。下面将对这进行更详细地论述。[0044]第三，XPD解旋酶通常每次移动目标多核苷酸中的一个核苷酸穿过所述孔。XPD解旋酶由此能起到类似单碱基棘齿ratchet的作用。当然，这在测序目标多核苷酸时是有利的，因为使用所述孔可以鉴定目标多核苷酸中的基本全部的一一如果不是全部的话一一核苷酸。[0045]第四，xro解旋酶能够控制单链多核苷酸和双链多核苷酸的移动。这意味着根据本发明能够表征多种不同的目标多核苷酸。[0046]第五，xro解旋酶对施加的电压产生的电场表现出极大的耐受性。本发明人发现在"解链"（"unzipping"）状态下多核苷酸几乎不发生移动。解链状态通常是在缺乏核苷酸，例如缺乏ATP时候出现。当所述解旋酶在解链模式下操作时，其作用类似闸，防止目标序列在所施加电压的影响下太快地移动穿过所述孔。这是很重要的，因为这意味着，当逆着所施加电压产生的电场移动多核苷酸时，不会发生由不希望的"向后"移动而产生的问题。[0047]第六，XPD解旋酶容易制备和容易操控。因此它们适合用于直接且便宜的测序方法。[0048]本发明方法是用于表征目标多核苷酸。多核苷酸，例如核酸，是一种含有两个或多个核苷酸的大分子。所述多核苷酸或核酸可以包含任何核苷酸的任何组合。所述核苷酸可以是天然存在的或人工合成的。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被氧化或甲基化。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被破坏。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被修饰，例如使用标记或标签。所述目标核苷酸可以包括一个或多个间隔物。[0049]核苷酸通常含有核碱基、糖和至少一个磷酸基团。核苷碱基通常是杂环的。核碱基包括，但不限于，嘌呤和嘧啶，以及更具体地，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶。所述糖通常为戊糖。核苷酸糖包括，但不限于，核糖和脱氧核糖。所述核苷酸通常为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述核苷酸通常含有单磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸可以连接在核苷酸的5'或3'端。[0050]核苷酸包括，但不限于，腺苷单磷酸AMP、鸟苷单磷酸GMP、胸苷单磷酸TMP、尿苷单磷酸UMP、胞苷单磷酸CMP、环状腺苷单磷酸cAMP，环状鸟苷单磷酸cGMP、脱氧腺苷单磷酸（dAMP、脱氧鸟苷单磷酸（dGMP、脱氧胸苷单磷酸（dTMP、脱氧尿苷单磷酸dUMP和脱氧胞苷单磷酸dCMP。所述核苷酸优选选自AMP，TMP，GMP，CMP，UMP，dAMP，dTMP，dGMP或dCMP〇[0051]核苷酸可以是脱碱基的（即缺少核碱基）。[0052]所述多核苷酸可以是单链或双链的。至少多核苷酸的一部分优选是双链的。[0053]所述多核苷酸可以是核酸，诸如脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA。所述目标多核苷酸可包括与一条DNA链杂交的一条RNA链。所述多核苷酸可以是本领域已知的任何人造核酸，诸如肽核酸（PNA、甘油核酸（GNA、苏糖核酸（TNA、锁核酸（lockednucleicacid，LNA，或其他具有核苷酸侧链的合成聚合物。[0054]目标多核苷酸的整体或仅部分可以使用该方法表征。所述目标多核苷酸可具有任何长度。例如，所述目标多核苷酸可以具有至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少400或至少500个核苷酸对的长度。所述目标多核苷酸可以具有1000或更多核苷酸对、5000或更多核苷酸对的长度或100000或更多核苷酸对的长度。[0055]目标多核苷酸存在于任何合适的样本中。本发明通常针对已知含有或怀疑含有目标多核苷酸的样本而实施。替代地，对样本实施本发明可以是为了确认一个或多个目标多核苷酸的同一性，所述目标多核苷酸已知或预期存在于所述样本中。[0056]所述样本可以是生物样本。本发明可以针对由任何有机体或微生物体获得或提取的样本在体外实施。所述有机体或微生物体通常是古核的archaean、原核的或真核的，并通常属于以下五界之一:植物界、动物界、真菌界、无核原生物界和原生生物界。本发明可以针对由任何病毒获得或提取的样本在体外实施。所述样本优选为液体样本。所述样本通常包括患者的体液。所述样本可以是尿液、淋巴液、唾液、粘液或羊水，但优选为血液、血衆或血清。通常，所述样本来自人，但替代地，其可以是来自其他哺乳动物，例如来自商购的家畜，如马、牛、羊或猪，或可替代地，为宠物，如猫或狗。替代地，源自植物的样本通常获得自经济作物，例如谷类、豆类、水果或蔬菜，如小麦、大卖、燕麦、油菜、玉米、大豆、稻、香蕉、苹果、西红柿、马铃薯、葡萄、烟草、黄豆、扁豆、甘蔗、可可、棉花。[0057]所述样本可以是非生物样本。所述非生物样本优选为液体样本。所述非生物样本的实例包括外科手术液体、水，例如饮用水、海水或河水，以及用于实验室测试的试剂。[0058]通常在分析前对所述样本进行处理，例如，通过离心或通过膜过滤掉不需要的分子或细胞，诸如红血细胞。所述样本可以在获取后立即进行检测。所述样本通常也可以在分析前储存，优选在低于_70°C储存。[0059]跨膜孔是一种能在一定程度上跨膜的结构。其能使离子，例如水合离子，在被施加的电势驱动下而流经所述膜或在所述膜内中流动。跨膜孔通常跨整个膜，使得离子可以从膜的一侧流到膜的另一侧。但是，跨膜孔不一定必须跨所述膜。其可以是一端封闭的。例如，所述孔可以是可使离子流经或流入的膜中的一个孔。[0060]本发明可使用任何膜。合适的膜是本领域已知的。所述膜优选为两性分子层。两性分子层是一种由具有至少一个亲水性部分和至少一个亲脂性或疏水性部分的两性分子，例如磷脂，形成的层。所述两性分子层可以是单分子层或双分子层。两性分子层通常为平面脂质双分子层或支撑双分子层。[0061]所述两性分子层通常为脂质双分子层。脂质双分子层是细胞膜的模型并被用作多种实验研究的优良平台。例如，脂质双分子层能被用于通过单通道记录在体外研究膜蛋白。替代地，脂质双分子层可以用作生物传感器，以检测多种物质的存在。所述脂质双分子层可以是任何的脂质双分子层。合适的脂质双分子层包括但不限于，平面脂质双分子层、支撑双分子层或脂质体。所述脂质双分子层优选为平面脂质双分子层。合适的脂质双分子层在国际申请号PCTGB08000563公布号W02008102121、国际申请号PCTGB08004127公布号W02009077734和国际申请号PCTGB2006001057公布号W02006100484中有公开。[0062]形成脂质双分子层的方法是本领域已知的。合适的方法公开在实施例中。脂质双分子层通常通过Montal和MuellerProc·Natl.AcacLSci·USA·，1972;69:3561-3566的方法形成，其中脂质单分子层穿过孔的任一侧负载在水溶液空气界面上，所述孔垂直于所述界面。[0063]所述Montal&Mueller的方法被普遍应用，因为其成本经济并是一种相对直接的用于形成适合蛋白质孔嵌入proteinporeinsertion的质量良好的脂质双分子层的方法。其他常用的形成双分子层的方法包括脂质体双分子层的尖端浸渍tip-dipping、涂覆双分子层paintingbilayers和膜片钳patch-clamping方法。[0064]在一个优选实施方案中，所述脂质双分子层如国际申请号PCTGB08004127公布号W02009077734中所述而形成。[0065]在另一个优选实施方案中，所述膜为固态层。固态层不来源于生物体。换言之，固态层不是由生物环境获得或分离出的，所述生物环境诸如有机体或细胞，或是生物学可获得的结构的合成制备产物（syntheticallymanufacturedversion。固态层可以由有机和无机材料形成，所述有机和无机材料包括但不限于，微电子材料、绝缘材料，如Si3N4、A12〇3和SiO，有机和无机聚合物，如聚酰胺、塑料，如Teflon®或弹性体，如双组分加成固化硅橡胶，以及玻璃。所述固态层可以由单原子层形成，如石墨烯，或者只有几个原子厚的层形成。适合的石墨烯层在国际申请号PCTUS2008010637公布号W02009035647中有公开。[0066]所述方法通常使用以下物质而实施：（i含有孔的人工两性分子层，（ii分离出的天然存在的含有孔的脂质双分子层，或（iii含有孔嵌入其中的细胞。所述方法通常使用人工两性分子层，诸如人工脂质双分子层而实施。所述层除孔之外还可以含有其他跨膜和或膜内蛋白以及其他分子。适合的设备和条件如下所述。本发明的方法通常在体外实施。[0067]所述多核苷酸可以偶联到所述膜。这可使用任何已知方法完成。如果所述膜是两性分子层，如脂质双分子层如上文详细描述的），则所述多核苷酸优选通过存在于所述膜中的多肽或存在于所述膜中的疏水锚anchor偶联到所述膜。所述疏水锚优选为脂质、月旨肪酸、固醇、碳纳米管或氨基酸。[0068]所述多核苷酸可以直接偶联到所述膜。所述多核苷酸优选通过连接体1inker偶联到所述膜。优选的连接体包括但不限于，聚合物如多核苷酸，聚乙二醇PEG和多肽。如果多核苷酸直接偶联到所述膜，则由于所述膜与所述解旋酶之间的距离，表征不能持续进行到所述多核苷酸的末端，因此将丢失一些数据。如果使用连接体，则所述多核苷酸能够被表征完全。如果使用连接体，则连接体可以在任何位置连接到所述多核苷酸。所述连接体优选在尾部聚合物连接到所述多核苷酸。[0069]所述偶联可以是稳定的或暂时的。对于某些应用，暂时性的偶联是优选的。如果稳定偶联的分子直接连接到多核苷酸的5'或3'端，则由于所述双分子层与所述解旋酶的活性位点之间的距离，表征不能持续进行到所述多核苷酸的末端，因此将丢失一些数据。如果所述偶联是暂时性的，则当偶联的末端随机地变为双分子层的自由端时，所述多核苷酸能被表征完全。与膜形成稳定或暂时性的连接的化学基团在下面更详细的描述。所述多核苷酸可以使用胆固醇或脂肪酰链暂时性地偶联到两性分子层，例如脂质双分子层。可以使用具有6-30个碳原子长度的任何脂肪酰链，例如十六烷酸。[0070]在优选实施方案中，将多核苷酸偶联到两性分子层。多核苷酸与合成的脂质双分子层的偶联已预先用多种不同的栓系策略tetheringstrategies实施。这些策略概述于下表1中。[0071]表1[0074]多核苷酸可以在合成反应中使用经修饰的亚磷酰胺官能化，使其能容易的与反应基团的加成兼容，所述反应基团诸如硫醇、胆固醇、脂质和生物素基团。这些不同的连接化学成分为多核苷酸提供了一系列连接选择。每个不同的修饰基团以稍微不同的方式栓系所述多核苷酸并且所述偶联不总是永久性的，从而使得多核苷酸到所述双分子层有不同的停留时间。暂时性偶联的优点如上所述。[0075]多核苷酸的偶联还能通过很多其他手段实现，只要反应性基团能够被添加到所述多核苷酸。之前已经报道了，将反应性基团添加到DNA的任一端。可以使用多核苷酸激酶和ATPγS在单链DNA的5'端添加硫醇基团（Grant，G·P·和P·Z·Qin2007·〃Afacilemethodforattachingnitroxidespinlabelsatthe57terminusofnucleicacids.NucleicAcidsRes3510:e77。可以使用末端转移酶添加多种不同选择的化学基团，如生物素、硫醇和焚光团，以将经修饰的寡核苷酸添加到单链DNA的3'端Kumar，A.，P.Tchen，等人（1988·"Nonradioactivelabelingofsyntheticoligonucleotideprobeswithterminaldeoxynucleotidyltransferase·〃AnalBiocheml692:376-82〇[0076]替代地，反应性基团可以被认为是DNA短片段互补性添加到已经偶联至所述双分子层的DNA短片段，使得所述连接可以通过杂交实现。据报道，单链DNA的短片段的连接是使用T4RNA连接酶ITroutt，A.B.，M.G.McHeyzer-Williams,等人（1992.''Ligation-anchoredPCR:asimpleamplificationtechniquewithsingle-sidedspecificity,ProcNatlAcadSciUSA8920:9823-5。替代地，单链DNA或双链DNA可以连接到天然双链DNA，然后通过加热变性或化学变性分开这两条链。对于天然双链DNA，可以向该双链的一个或两个末端添加一段单链DNA或双链DNA。然后当双链被解链melted时，如果使用单链DNA进行连接，则每条单链将具有5'端或3'端修饰，或者，如果使用双链DNA进行连接，则每条单链将具有5'端修饰、3'端修饰、或这两端修饰。如果多核苷酸是合成链，所述偶联化学成分能在该多核苷酸的化学合成过程中引入。例如，所述多核苷酸能使用具有反应性基团连接其上的引物来合成。[0077]一种常规的用于扩增基因组DNA片段的技术是使用聚合酶链反应PCR。这里，使用两个合成的寡核苷酸引物，可生成相同DNA片段的大量拷贝，其中对于每个拷贝，双链的每条链的5'将是一个合成的多核苷酸。通过使用具有反应性基团例如胆固醇、硫醇、生物素或脂质的反义引物，扩增的目标DNA的每个拷贝将含有用于偶联的反应性基团。[0078]跨膜孔优选为跨膜蛋白孔。跨膜蛋白孔是在一定程度上跨膜的蛋白质结构。其允许在被施加的电势驱动下离子流经所述膜或在所述膜内流动。跨膜蛋白孔通常为多肽或多个多肽的组合，其允许离子，例如分析物，从膜的一侧流到膜的另一侧。但是，跨膜蛋白孔不一定必须跨所述膜。其可以是一端封闭的。例如，所述跨膜孔可以在膜中形成可使离子流经或流入的孔。所述跨膜蛋白孔优选允许分析物，例如核苷酸，流经膜或在膜内流动，所述膜例如脂质双分子层。所述跨膜蛋白孔能使多核苷酸，如DNA或RNA，移动穿过所述孔。[0079]所述跨膜蛋白孔可以是单体或寡聚物。所述孔优选由多个重复亚基，如6、7或8个亚基构成。所述孔优选为六聚体、七聚体、八聚体或九聚体的孔。[0080]所述跨膜蛋白孔通常含有可使离子流经的桶状结构或通道。所述孔的亚基通常围绕一中心轴并为跨膜β桶状结构或通道或跨膜α-螺旋束或通道贡献链。[0081]所述跨膜蛋白孔的桶状结构或通道通常含有能促进与分析物的相互作用的氨基酸，所述分析物例如核苷酸、多核苷酸或核酸。这些氨基酸优选位于所述桶状结构或通道的溢痕constriction附近。所述跨膜蛋白孔通常包含一个或多个带正电荷的氨基酸，如精氨酸、赖氨酸或组氨酸，或芳香族氨基酸，如酪氨酸或色氨酸。这些氨基酸通常促进所述孔与核苷酸、多核苷酸或核酸之间的相互作用。[0082]在本发明中使用的跨膜蛋白孔可源自β-桶状孔或α-螺旋束孔。β-桶状孔包括由β-链形成的桶状结构或通道。合适的桶状孔包括但不限于，毒素，如α_溶血素、炭疽毒素和杀白细胞素，以及细菌的外膜蛋白孔蛋白，所述细菌如耻垢分枝杆菌Mycobacteriumsmegmatis孔蛋白（Msp，例如MspA，外膜孔蛋白FOmpF、外膜孔蛋白GOmpG、外膜磷酯酶A和奈瑟氏菌Neisseria自转运脂蛋白（NalPha-螺旋束孔包括由α-螺旋形成的桶状结构或通道。合适的α-螺旋束孔包括但不限于，内膜蛋白和α外膜蛋白，如WZA和ClyA毒素。跨膜孔可以源自Msp或源自α-溶血素α-HL。[0083]所述跨膜蛋白孔优选源自Msp，优选源自MspA。这类孔将是寡聚物孔并通常包括7、8、9或10个源自Msp的单体。所述孔可以是源自含相同单体的Msp的同源寡聚物孔。替代地，所述孔可以是源自含有至少一个不同于其他的单体的Msp的异源寡聚物孔。优选所述孔源自MspA或其同源物或旁系同源物paralog。[0084]源自Msp的单体含有SEQIDN0:2中所示序列或其变体。SEQIDN0:2是MspA单体的MS-B18突变体。其包括以下突变：Ο90Ν、Ο91Ν、Ο93Ν、Ο118Κ、ϋ134Ι^ΡΕ139Κ100碰终浓度。[0213]由嵌入1，2-二植烷酰-甘油基-3-磷酸胆碱脂质Avanti极性脂质双分子层的单个MspA纳米孔获得电测量值。通过Montal-Mue11er技术，跨20μπι厚的PTFE膜中的~1ΟΟμπι直径的孔穴形成双分子层在传统的Delrin室中），隔开两个lmL的缓冲溶液。所有实验在所述缓冲溶液中进行。使用装配有1440A数字转换器的Ax〇patch200B放大器分子装置测定单通道电流。将AgAgCl电极连接到所述缓冲液中，使得顺式隔室纳米孔和酶DNA均被添加到其中）连接到Axopatchheadstage的接地端，并且反式隔室连接到所述headstage的活性电极。[0214]在所述双分子层中实现单孔之后，将DNA多核苷酸和解旋酶添加到100yL缓冲液中并预培育5分钟DNA=6nM，Enzyme=lyM。将该经预培育的混合物添加到电生理学室的顺式隔室中的900yL缓冲液中，以引发解旋酶-DNA复合体在所述MspA纳米孔中的捕获得到DNA=0.6nM，酶=0.ΙμΜ的终浓度）。根据需要通过向所述顺式隔室中添加二价金属ImMMgCl2和NTPImMΑΤΡ激活解旋酶ΑΤΡ酶的活性。在+140mV的恒定电势下进行实验。[0215]结果和论述[0216]如图1所示添加解旋酶-DNA底物到MspA纳米孔，产生了如图2和3所示的特征电流模块。没有与解旋酶复合的DNA短暂地与所述纳米孔相互作用，产生短期的电流模块〈〈1秒）。结合有解旋酶并且活动的（即在ATP酶作用下沿着DNA链移动）的DNA，产生如图2和3所示电流逐步变化的长特征模块水平。纳米孔中不同的DNA模序均得到唯一的电流模块水平。对于给定的底物，我们观察到反映DNA序列的电流转变的特征图案。[0217]在图1显示的实施例中，当DNA被解旋酶沿着该DNA链在随机位点捕获时，从随机的起始点对该DNA链进行测序。[0218]盐耐受性[0219]这种类型的纳米孔链测序实验一般需要离子盐。所述离子盐是产生导电溶液所必需的，所述导电溶液用于施加补偿电压以捕获和移位DNA，并且是测定DNA穿过所述纳米孔时产生的序列依赖性电流变化所必需的。由于测量信号依赖于离子的浓度，因此使用高浓度的离子盐以提高所获得的信号的强度是有利的。对于纳米孔测序，超过l〇〇mMKC1的盐浓度是理想的，，超过400mM的盐浓度是优选的。[0220]然而，很多酶包括一些解旋酶和DNA马达蛋白）不能耐受高的盐条件。在高的盐条件下，所述酶打开unfold或失去结构完整性，或不能正常工作。已知的和所研究的解旋酶的现有文献显示，几乎所有的解旋酶均不能在高于约l〇〇mMKClNaCl的盐浓度下工作，并且没有报道表明，解旋酶能在400mMKC1以上的条件下显示合适的活性。即使存在来自耐盐物种的相似酶的潜在耐盐变体，它们也极难在标准的表达系统（即大肠杆菌）中表达和纯化。[0221]出人意料地，我们发现，在实施例中，来自Mbu的xro显示出的对盐的耐受性达到极高的水平。我们发现，所述酶在400mMKC1到1MKC1的盐浓度下仍保持功能，无论是在荧光实验中，还是在纳米孔实验中。[0222]正向和反向操作模式[0223]大多数解旋酶以单向方式沿着单链多核苷酸底物移动，为每次NTP酶的转运和移动特定数目的碱基。虽然图1显示了使用这种移动将螺旋状DNA沿着所施加电势的同一方向，通过纳米孔输送到反室内，但是也可以其他方式来利用解旋酶的运动，从而以受控方式输送DNA穿过纳米孔。图4显示了"正向"和"反向"两种基本的操作模式。在正向模式中，以与在所施加电场的力的作用下DNA移动相同的方向，通过解旋酶向所述孔中输送DNA。DNA的移动方向由反向箭头表示。对于XPDMbu，其为5'-3'解旋酶，这需要将DNA的5'端捕获到纳米孔中，直到解旋酶与所述纳米孔的顶部接触，然后在施加的电势产生的电场下，在解旋酶控制下，向所述纳米孔中输送所述DNA，其从顺侧到反侧移动。反向模式需要捕获DNA的3'端，之后所述解旋酶逆着所施加电势产生的电场将螺旋状DNA从所述纳米孔牵拉出，所述DNA按箭头所指从顺侧到反侧移动。图4示出了使用XPDMbu而进行的两种操作模式。[0224]实施例2[0225]该实施例利用荧光试验检测酶活性来说明xro解旋酶xroMbu的盐耐受性。[0226]使用常规的荧光底物检测解旋酶置换杂交双链DNA的能力（图5A，如图5A中的1所示，荧光底物链终浓度50nM具有5'端单链DNA悬突，以及一40个碱基的杂交双链DNA部分。主链上部在3'端具有羧基荧光素碱基，并且杂交的互补链在5'端具有黑洞淬灭剂BHQ-1碱基。当杂交时，来自荧光素的荧光被局部的BHQ-1淬灭，并且所述底物基本无荧光。所述试验中还包括，与荧光底物的较短链互补的ΙμΜ的捕获链。如2所示，在ATPlmM和MgCl210mM存在下，添加到所述底物中的解旋酶150nM连接到所述荧光底物的5'尾部，沿着所述主链移动，并置换所述互补链，如所示的。如3所示，一旦具有BHQ-1的互补链完全被置换，主链上荧光素发荧光。如4所示，过量的捕获链优先与互补DNA退火以防止初始底物重新退火与丢失荧光。[0227]底物DNA:靠近3'端的具有羧基荧光素的SEQIDN0:66和5'端的具有黑洞淬灭剂-1的SEQIDN0:67。[0228]捕获DNA:靠近3'端的具有羧基荧光素的SEQIDN0:68。[0229]图5B的照片示出了含有100mM至1M的不同浓度的KC1的缓冲溶液中的初始活性速率（100mMHepespH8.0，lmMATP，10mMMgCl2,50nM荧光底物DNA，lyM捕获DNA。所述解旋酶在1Μ下工作。

权利要求：1.一种表征目标多核苷酸的方法，包括：a使目标多核苷酸与跨膜孔及xro解旋酶接触，使得目标多核苷酸移动穿过所述跨膜孔，并使xro解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动;和b当所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔移动时，获取一个或多个电流测量值，其中所述电流测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个特征选自（i目标多核苷酸的长度，（ii目标多核苷酸的同一性，（iii目标多核苷酸的序列，（iv目标多核苷酸的二级结构，和V目标多核苷酸是否被修饰。3.根据权利要求2所述的方法，其中对所述目标多核苷酸用一个或多个蛋白质或一个或多个标记物、标签或间隔物通过甲基化、氧化进行了修饰。4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b包括当所述目标多核苷酸移动穿过所述跨膜孔时获取一个或多个测量值。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括跨所述跨膜孔施加电压以在所述跨膜孔和所述解旋酶之间形成复合体的步骤。6.根据权利要求1所述的方法，其中至少所述目标多核苷酸的一部分是双链的。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述跨膜孔为跨膜蛋白孔或固态孔。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述跨膜蛋白孔选自溶血素、杀白细胞素、耻垢分枝杆菌膜孔蛋白AMspA、外膜蛋白FOmpF、外膜蛋白GOmpG、外膜磷脂酶A、奈瑟氏菌自转运脂蛋白（NalP和WZA。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述XPD解旋酶的氨基酸模序为：aYLWGTLSEGSEQID勵：11和或QAMGRVVRSPTDYGARILLDGRSEQIDNO:12；bSLWGTLAEGSEQID勵：14和或QAIGRVVRGPDDFGVRILADRRSEQIDNO:15；cYLWGTLSEGSEQID勵：11和或QAMGRVVRSPGDFGVRILLDARSEQIDNO:17；dYLWGTLSEGSEQID勵：11和或QAMGRVVRSPSDYGARILLDGRSEQIDNO:19；eSLWGTLAEGSEQID勵：14和或QALGRVVRSPTDFGVRVLVDERSEQIDNO:21；fVTGGVFAEGSEQIDN0:23和或QAAGRVLRTPEDRGVIALLGRRSEQIDN0:24；gLGTGAFWEGSEQID勵:26和或QGVGRLIRDERDRGVLILCDNRSEQIDNO:27；hYIWGTLSEGSEQIDN0:29和或QAMGRVVRSPTDYGARILIDGRSEQIDNO:30；iYLWGTLSEGSEQID勵：11和或QAMGRIVRSPDDYGVRILLDSRSEQIDNO:32；jSLWGTLAEGSEQID勵：14和或QALGRVIRAPDDFGVRVLADKRSEQIDN0:34；kVSGGRLSEGSEQIDN0:36和或QEIGRLIRSAEDTGACVILDKRSEQIDN0:37;lVMGGRNSEGSEQIDN0:39和或QAAGRVHRSEEEKGAVVVLDYRSEQIDNO:40；mVMGGRNSEGSEQIDN0:39和或QAAGRVHRSEEEKGSIVILDYRSEQIDNO:42；nSLWGTLAEGSEQID勵：14和或QAMGRVIRSPEDFGVRMLVDRRSEQIDNO:45；oLATGRFAEGSEQID勵:47和或QMIGRLIRTENDYGVVVIQDKRSEQIDN0:48；pIARGKLAEGSEQID勵：50和或QSIGRAIRGPTDNATIWLLDKRSEQIDNO:51；qVGKGKLAEGSEQIDNO:53和或QAIGRAIRDVNDKCNVWLLDKRSEQIDNO:54；rVMGGRNSEGSEQIDNO:39和或QAAGRVHRSAEEKGAIIILDYRSEQIDNO:56；sSLWGTLAEGSEQID勵：14和或QALGRVIRSPEDVGVRALLDRRSEQIDNO:58；tSLWGTLAEGSEQID勵：14和或QALGRVIRSPEDFGVRILLDKRSEQIDN0:60;SuYLWGTLSEGSEQID勵：11和或QAMGRVVRSPGDFGVRILLDARSEQIDNO:17。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述XPD解旋酶为表4或5中所示解旋酶之一。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述XPD解旋酶的氨基酸序列为aSEQIDNO:10,13,16,18,20,22,25,28,31,33,35,38,41,43,44,46,49,52,55,57,59,61和62中任一个所示的序列。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法使用至少0.3M的盐浓度实施。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述盐浓度至少为1.0M。14.根据权利要求12所述的方法，其中所述盐为KC1。15.-种形成表征目标多核苷酸用传感器的方法，包括在跨膜孔和xro解旋酶之间形成复合体并由此形成用于表征目标多核苷酸的传感器。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述复合体通过下述形成：（a在目标多核苷酸的存在下使所述跨膜孔和解旋酶接触，和b跨所述跨膜孔施加电势。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述电势为电压电势或化学电势。18.根据权利要求15所述的方法，其中所述复合体通过将所述跨膜孔共价连接到所述解旋酶而形成。19.XPD解旋酶在控制目标多核苷酸移动穿过跨膜孔中的应用。20.-种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，包括a跨膜孔和bXPD解旋酶。21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括含两性分子层的芯片。22.-种用于表征样本中目标多核苷酸的分析设备，包括多个跨膜孔和多个XPD解旋酶。23.根据权利要求22所述的分析设备，其中所述分析设备包括：传感器装置，能支撑所述多个跨膜孔，并可操作地使用所述跨膜孔和解旋酶来表征多核苷酸；至少一个存储器，容纳用于进行表征的材料；流体系统，配置成从至少一个存储器可控地向所述传感器装置供应材料；以及多个容器，用于接收各样本，所述流体系统被配置成，选择性地从所述容器向所述传感器装置供应样本。24.-种表征目标多核苷酸的方法，包括：a使目标多核苷酸与XPD解旋酶接触，使得所述XPD解旋酶控制所述目标多核苷酸的移动;和b当所述XPD解旋酶控制所述目标多核苷酸移动时，获取一个或多个电流测量值，其中所述电流测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。25.根据权利要求24所述的方法，其中：a所述一个或多个特征如权利要求2中所限定；b所述目标多核苷酸如权利要求3或6中所限定；c所述XPD如权利要求9至11中任一项所限定;或d所述方法按按权利要求12,13或14中限定的来实施。26.XPD解旋酶在表征目标多核苷酸过程中控制该目标多核苷酸的移动中的应用。27.XPD解旋酶在对目标多核苷酸进行部分或完整测序过程中控制该目标多核苷酸的移动中的应用。

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