申请/专利权人：吉首大学

申请日：2019-01-25

公开（公告）日：2019-06-07

公开（公告）号：CN109852693A

主分类号：C12Q1/6886(2018.01)I

分类号：C12Q1/6886(2018.01)I;A61K31/7105(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2023.06.06#发明专利申请公布后的驳回;2019.07.02#实质审查的生效;2019.06.07#公开

摘要：本发明公开了ILP‑2作为药物靶点在乳腺癌药物中的应用及ILP‑2干扰片段。本发明明确了凋亡抑制蛋白ILP‑2与ECM1共同作用，通过ECM1‑mTOR通路影响乳腺癌细胞MCF‑7的生长和凋亡，在乳腺癌细胞MCF‑7的生长中起着积极的作用，为抑制肿瘤细胞生长提供了新的药物靶点并公开了一种具有良好干扰效果的ILP‑2干扰片段。

主权项：1.一种ILP‑2作为药物靶点在乳腺癌药物中的应用。

全文数据：ILP-2作为药物靶点在乳腺癌药物中的应用及ILP-2干扰片段技术领域本发明属于生物技术领域，尤其涉及ILP-2作为药物靶点在乳腺癌药物中的应用及一种能够敲低ILP-2表达的干扰片段siRNA-5。背景技术乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，发病率逐年增加。乳腺癌的发生、发展是多因素、多步骤的复杂过程。凋亡抑制蛋白Inhibitorsofapoptosisprotein，IAP过度表达会引起凋亡不足，使得细胞凋亡与增殖失衡，进而促进癌细胞生长。ILP-2是凋亡抑制蛋白IAP家族成员，在乳腺癌患者血清中高表达，可作为乳腺癌的血清标志物。细胞外基质Extracellularmatrixprotein，ECM是由细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要是一些多糖和蛋白或蛋白聚糖，这些分子构成复杂的网架结构，不仅是支撑组织、细胞生长的支架，还能诱导和调控细胞的黏附、生长、增殖和分化。细胞外基质蛋白1Extracellularmatrixprotein1,ECM1是从鼠成骨基质细胞系MN7中分离出来的一种分泌性糖蛋白，最初被命名为P85，后因该蛋白被发现存在于各种结缔组织蛋白中，与多种结缔组织蛋白关系密切，故被命名为ECM1。ECM1可通过整合素或其他细胞表面受体与细胞直接发生作用，激活黏着斑激酶Focaladhesionkinase,FAK磷脂酰肌醇3激酶Phosphatidylinositol3-kinase,PI3K蛋白激酶BProteinkinaseB，PKB，又称为Akt雷帕霉素靶蛋白Mammaliantargetofrapamycin，mTOR信号通路,进而引起肿瘤的发生。凋亡抑制蛋白ILP-2在疾病研究的报道中并不多见，其抑制肿瘤细胞凋亡促进其生长的分子机制尚不清楚，导致无法找到有效的药物抑制肿瘤细胞生长。发明内容为解决上述问题，本发明提供了ILP-2作为药物靶点在乳腺癌药物中的应用及一种敲低ILP-2表达的干扰片段siRNA-5。本发明明确了凋亡抑制蛋白ILP-2与ECM1共同作用，通过ECM1-mTOR通路影响乳腺癌细胞MCF-7的生长和凋亡，在乳腺癌细胞MCF-7的生长中起着积极的作用，为抑制肿瘤细胞生长提供了新的药物靶点并公开了一种具有良好干扰效果的ILP-2干扰片段。为达到上述技术效果，本发明的技术方案是：一种ILP-2作为药物靶点在乳腺癌药物中的应用。进一步的改进，所述ILP-2通过控制ECM1-mTOR通路控制乳腺癌细胞的生长和凋亡。进一步的改进，所述乳腺癌细胞为MCF-7。一种ILP-2干扰片段，所述干扰片段的正向序列为SEQNO1；反向序列为SEQNO2。进一步的改进，所述干扰片段通过干扰ILP-2的表达控制ECM1-mTOR通路控制乳腺癌细胞的生长和凋亡。附图说明：图1为ECM1免疫共沉淀ILP-2偶联蛋白印迹图；图2A为siRNA-5组干扰敲低ILP-2表达后用蛋白质免疫印迹法检测ECM1-mTOR通路相关蛋白结果图；图2B为ECM1组干扰敲低ILP-2表达后用蛋白质免疫印迹法检测ECM1-mTOR通路相关蛋白结果图；图2C为FAK组干扰敲低ILP-2表达后用蛋白质免疫印迹法检测ECM1-mTOR通路相关蛋白结果图；图2D为Akt组干扰敲低ILP-2表达后用蛋白质免疫印迹法检测ECM1-mTOR通路相关蛋白结果图；图3A为ILP-2表达被干扰敲低后TUNEL标记24h荧光检测分析结果；图3B为ILP-2表达被干扰敲低后TUNEL标记48h荧光检测分析结果；图3C为ILP-2表达被干扰敲低后TUNEL标记72h荧光检测分析结果；图4为干扰敲低ILP-2表达后用CCK-8法检测细胞增殖图。具体实施方式下面通过具体实施例及附图对本发明做进一步的详述。先结合具体实施例及附图，来进一步阐述本发明。实施例1：1材料与方法1.1实验材料人类乳腺癌MCF-7细胞购于苏州齐氏生物科技有限公司ATCC细胞库，RPMI1640培养液基购自美国Gibco公司；胎牛血清FBS购自浙江天杭生物科技有限公司；青-链霉素混合液、0.25％胰酶细胞消化液购自北京索莱宝生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、WesternBlot超敏发光液购自北京普利莱基因技术有限公司；ILP-2兔多克隆抗体购自美国Abcam公司；ECM1IP用兔多克隆抗体购自美国Santa公司，ECM1、FAK、Akt兔多克隆抗体购自美国AffinityBiosciences公司，Tubulin兔多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；辣根酶标记山羊抗兔IgGH+L购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Lipofectamin6000Reagent转染试剂购自上海碧云天生物技术公司；ILP-2干扰片段由广州锐博基因股份有限公司合成；CCK-8CellCountingKit-8法细胞增殖检测试剂盒、一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒购自南京凯基生物公司。主要实验仪器有:上海博迅医疗生物仪器股份有限公司SPX-250B-Z生化培养箱、湖南凯达科学仪器有限公司TD-5A台式低速离心机、日本OLYMPUS公司BX51倒置荧光显微镜、基因有限公司EL×800酶标仪、德国eppendorf公司Centrifuge5430R低温离心机、北京市六一生物科技有限公司DYY-11型电泳仪、北京赛智创业科技有限公司MiniChmi420化学发光成像仪。1.2细胞与细胞培养人乳腺癌细胞MCF-7细胞用含10％灭活小牛血清的PRMll640培养基培养于37℃、5％CO2、95％饱和湿度的培养箱内。后续实验均取对数生长期的细胞。1.3实验分组将六孔细胞培养板每孔加入1×105个MCF-7细胞悬液，用5％灭活小牛血清且不含双抗的PRMll640培养基处理12h。待细胞汇合度为40-50％时按照Lipofectamine6000说明书转染，siRNA终浓度为50nmolL。将转染混合物加入到如下分组的细胞中，在37℃5％CO2培养12h后换成10％完全培养基再培养24h。设置MCF-7组为空白对照组、NCNegativeControl,NC为阴性对照组、siRNA-3组和siRNA-5组四组。干扰片段序列见表1。表1干扰片段序列1.4免疫沉淀联合蛋白质印迹法用预冷的磷酸盐缓冲溶液Phosphatebufferedsolution，PBS洗MCF-7细胞2次，加300μLIP裂解液，收集细胞，冰浴30min后4℃14000rpm离心15min，取上清至新的EPEppendorf管，从中取50μL总蛋白作Input，-20℃保存；向剩余蛋白液中加入20μL洗涤后的磁珠，4℃孵育1h后4℃1000rpm离心3min，取上清转移至新EP管，4℃14000rpm离心3min，磁力板吸附磁珠于EP管底部，取上清蛋白液，均分为两组，分别加入IgG1：500和ILP-21：100抗体3ug，4℃孵育过夜。次日加入磁珠30μL管，4℃孵育6h后收集沉淀，用500μLPBST吐温-20含量占0.1％洗5min×4次后用40μL磷酸盐吐温缓冲液PhosphatebufferedsolutionwithTween-20,PBST重悬，补加5×蛋白上样缓冲液5×ProteinLoadingBufferPBST：buffer＝4：1，混合均匀后在100℃水浴10min，再4℃14000rpm离心5min，取蛋白上清液至新的EP管中，制备好的样品进行电泳分析。按试剂盒说明书配制10％的分离胶,5％的浓缩胶。制胶成功后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectropheresis，SDS-PAGE，先80V电泳30min后电压调至100V，继续电泳1h30min，用半干转转膜法将蛋白转移到0.22μm聚偏氟乙烯Polyvinylidenefluoride，PVDF膜后将膜置于含5％脱脂奶粉的三羟甲基氨基甲烷盐酸吐温缓冲液Tris-HClBufferedSalinewithTween-20，TBST中室温封闭2h。加一抗ILP-21：1000、ECM1IP用，1：10004℃冰箱孵育过夜。次日回收一抗加TBST洗膜5min×6次，加二抗1：5000室温孵育2h，TBST洗膜5min×5次。ECL发光液A液和B液按1：1混匀现配现用，将发光液均匀滴满整张膜条，利用化学放光成像系统检测。1.5蛋白质印迹法检测MCF-7细胞经干扰处理后收集各组细胞，用预冷的PBS洗2次，加入预冷的细胞裂解液含蛋白酶抑制剂，按照说明书提取细胞总蛋白，BCABicinchoninicacid法测定各组提取的总蛋白浓度，以最低浓度为标准，将各样品的浓度调为相同，蛋白溶液与5×蛋白上样缓冲液以4：1体积比混匀后100℃沸水煮10min使蛋白质充分变性。每孔分别取30μg总蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳，80V电泳30min后电压调至100V，继续电泳2h，用半干法转膜将蛋白转移到0.22μmPVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的TBST室温封闭1h，加一抗ILP-21∶1000、ECM11：500、FAK1：500、Akt抗体1：1000、Tubulin1：10004℃孵育过夜。次日用TBST漂洗5min×3次后于二抗1∶5000中室温孵育1h，TBST漂洗5min×3次后，用增强化学发光Enhancedchemoluminescence，ECL试剂显影，利用化学发光成像系统检测干扰效率及各组间ECM1、FAK、Akt的蛋白表达的差异，用ImageJ软件分析处理所得条带光密度值，以Tubulin作为对照，以目的蛋白光密度值内参蛋白光密度值来反映目的蛋白的相对表达量。1.6TUNEL细胞凋亡检测MCF-7细胞经干扰处理后分别于24、48和72h收集细胞，用4％多聚甲醛固定30min，TritonX-100冰上通透5min，TdT酶反应液37℃湿盒中避光处理样本60min，Streptavidin-Fluorescein标记液37℃湿盒中避光处理样本30min，4',6-二脒基-2-苯基吲哚4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI染色液复染后分别在激发波长490nm异硫氰酸荧光素,Fluoresceinisothiocyanate,FTIC和358nmDAPI的荧光显微镜下观察细胞凋亡情况并拍照保存。凋亡细胞的细胞核被标记,FITC染色为绿色荧光；所有细胞核被DAPI染色液标记为蓝色荧光。随机选取3个视野计数TUNEL阳性细胞数和细胞核数,取其平均值。细胞凋亡率＝TUNEL阳性细胞平均数DAPI平均数×100％1.7CCK-8细胞增殖活性检测96孔细胞培养板每孔加入5×104个MCF-7细胞，分组如上所示，每组设置6个复孔,在低浓度血清状态下培养24h，按照转染方法实验组每孔加入50nM待转染的siRNA,处理12h后更换完全培养基分别培养24、48、72h后，每孔加入CCK-8溶液10μL，37℃5％CO2避光孵育1h，用酶标仪在450nm波长处读取光密度Opticaldensity，OD值，其中用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。1.8统计学方法所有图表用GraphPadPrism5制作。实验数据均采用GraphPadPrism5软件进行分析，结果用均数±标准差x±s表示，组间的显著性检验采用单因素方差分析。每个实验独立重复3次,P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1ECM1与ILP-2存在相互作用ECM1免疫共沉淀ILP-2偶联蛋白印迹，结果如图1所示。可见，ILP-2仅能在ECM1免疫共沉淀复合物中检测到，而在对照组不能检测到，表明ECM1与ILP-2存在相互作用。具体如图1所示，图1中1泳道为Input，2泳道为IgG、3泳道为ECM1、4泳道为ECM1孵育后的上清液，5泳道为IgG抗体孵育后的上清液。2.2敲低ILP-2表达导致ECM1-mTOR通路相关蛋白下调干扰敲低ILP-2表达后用蛋白质免疫印迹法检测ECM1-mTOR通路相关蛋白，结果如图2A-图2D所示。可见，转染后ILP-2在乳腺癌MCF-7细胞中表达明显下调，siRNA-5组的ILP-20.32±0.09相对表达量显著低于空白对照组及NC组均P0.001图2A，ECM10.19±0.01、FAK0.64±0.07、Akt0.35±0.12相对表达量显著低于空白对照组P0.01，P0.001图2B，图2C，图2D，表明siRNA-5对ILP-2的干扰效率高，且下调ILP-2后ECM1、FAK、Akt蛋白的表达也会下降。2.3敲低ILP-2表达促进细胞凋亡ILP-2表达被干扰敲低后TUNEL标记荧光检测分析结果如图3A-3C所示。可见，MCF-7细胞株siRNA-5组24h0.57±0.099，48h0.59±0.026,72h0.52±0.063的凋亡率显著高于空白对照组均***P0.001，表明ILP-2表达能有效抑制细胞凋亡。2.4下调ILP-2表达抑制乳腺癌细胞增殖干扰敲低ILP-2表达后用CCK-8法检测细胞增殖，结果如图4所示。可见，MCF-7细胞株siRNA-5组24h0.54±0.09、48h0.64±0.10及72h0.53±0.18细胞的存活率显著低于空白对照组***P0.001，表明下调ILP-2表达使细胞活性下降，抑制了细胞增殖。3结论细胞凋亡是机体清除老化受损或突变的细胞，防止细胞过度增殖的正常生理过程，其异常改变将导致细胞过度增殖，与肿瘤的发生发展关系密切。多种因素会导致肿瘤患者的死亡，而癌症晚期多发转移致相关合并症及恶病质是癌症患者死亡的主要原因。凋亡抑制蛋白ILP-2在乳腺癌等多种肿瘤中高表达，对肿瘤细胞的增殖有着积极的作用。本研究用乳腺癌MCF-7细胞以ECM1特异性抗体进行免疫共沉淀实验，结果提示，ECM1与ILP-2存在相互作用。ECM1是构成细胞外微环境的主要成分。ECM1通过与细胞表面整合素受体结合后再与FAK的N端区结合,引起FAK活化，从而促进了肿瘤细胞表面黏附及增加了PI3K的活性，激活的PI3K将信号转递到细胞内，其产物与Akt结合从而激活Akt，活化的Akt有以下作用：①通过多种途径对下游靶蛋白进行磷酸化而发挥细胞抗凋亡作用；②能抑制蛋白水解酶Caspase-9的活性，阻止凋亡级联反应的激活；③通过磷酸化p53结合蛋白MDM2来调节p53的活性，促进p53蛋白的降解而影响细胞存活；④通过TSC12复合物进一步激活其下游分子mTOR,调节细胞的增殖、分化、迁移。我们的研究结果显示下调乳腺癌细胞MCF-7的ILP-2蛋白表达后，ECM1、FAK、Akt蛋白表达也下调，细胞生长和增殖能力下降，表明MCF-7细胞中ILP-2与ECM1、FAK、Akt蛋白表达成正相关，且ILP-2与ECM1、FAK、AKT对细胞的增殖起促进作用。有研究发现下调Akt1、PI3KP85亚基蛋白表达，P53表达上调，进而抑制MCF-7细胞的体外增殖，本发明结果吻合。FAK是胱天蛋白酶Caspase的底物之一，而Caspase是凋亡途径的起始者，FAK激活后可以通过介导Akt通路来抑制肿瘤细胞凋亡。结果显示下调ILP-2后，细胞凋亡率显著增加，故ILP-2通过与ECM1作用激活FAK-mTOR信号通路，调节MCF-7细胞的增殖和凋亡能力。凋亡抑制蛋白ILP-2对细胞所产生的抑制凋亡作用与ECM1-mTOR通路有着密切联系，呈正相关。ILP-2通过与ECM1共同作用促进乳腺癌MCF-7细胞生长，抑制其凋亡。本发明明确了ILP-2和ECM1促进乳腺癌细胞生长的分子机制，为确定ILP-2作为乳腺癌治疗的靶点提供了实验依据。上述仅为本发明的一个具体导向实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明的保护范围的行为。

权利要求：1.一种ILP-2作为药物靶点在乳腺癌药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ILP-2通过控制ECM1-mTOR通路控制乳腺癌细胞的生长和凋亡。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌细胞为MCF-7。4.一种ILP-2干扰片段，其特征在于，所述干扰片段的正向序列为SEQNO1；反向序列为SEQNO2。5.如权利要求4所述的ILP-2干扰片段，其特征在于，所述干扰片段通过干扰ILP-2的表达控制ECM1-mTOR通路控制乳腺癌细胞的生长和凋亡。

百度查询： 吉首大学 ILP-2作为药物靶点在乳腺癌药物中的应用及ILP-2干扰片段

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