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申请/专利权人：广州市丰华生物工程有限公司

摘要：本发明涉及一种液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒及其应用。本发明的试剂盒包括以下试剂：a校准品，所述校准品含有苯丙氨酸、17α‑羟孕酮和半乳糖标准品；b提取液，所述提取液为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈中的至少一种；和c流动相，所述流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A和流动相B由Ⅰ水、Ⅱ甲醇和Ⅲ甲酸或乙酸组成，或者，所述流动相A和流动相B由Ⅰ水、Ⅳ乙腈和Ⅲ甲酸或乙酸组成。采用本发明试剂盒检测PKU、CAH和GAL检验快速，检测结果准确且重复性高。

主权项：1.一种液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：a校准品，所述校准品含有苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖；b提取液，所述提取液为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈中的至少一种；和c流动相，所述流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A和流动相B由Ⅰ水、Ⅱ甲醇和Ⅲ甲酸或乙酸组成，所述流动相A中，甲酸或乙酸的体积百分比为0.01％-0.05％，水与甲醇的体积比为9：1～19：1；所述流动相B中，甲酸或乙酸的体积百分比为0.01％-0.05％，水与甲醇的体积比为0：100～1：99；或者，所述流动相A和流动相B由Ⅰ水、Ⅳ乙腈和Ⅲ甲酸或乙酸组成，所述流动相A中，甲酸或乙酸的体积百分比为0.01％-0.05％，水与乙腈的体积比为9：1～19：1；所述流动相B中，甲酸或乙酸的体积百分比为0.01％-0.05％，水与乙腈的体积比为0：100～1：99。

全文数据：液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒及其应用技术领域本发明涉及一种试剂盒及其应用，具体涉及一种液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒及其应用。背景技术对新生儿进行疾病筛查是近代预防医学领域的一项重要进展,是提高人口素质的重要措施。通过新生儿疾病筛查,可以在患儿未有临床疾病表现时就能做出早期诊断,进行早期治疗,以避免患儿重要器官出现不可逆的损害,保障儿童体格和智能的正常发育。苯丙酮尿症为常染色体隐性遗传病，病儿为苯丙氨酸羟化酶一种特殊肝酶的先天缺乏或活性降低，致苯丙氨酸不能正常羟化成酪氨酸，进入人体循环，因而血液和脑脊液中苯丙氨酸浓度也随之增加，并从尿中排出苯丙酮酸。酪氨酸酶也受到抑制，致酪氨酸代谢障碍，黑色素形成减少，因而肤色浅白，毛发淡黄，虹膜色淡。由于汗液和尿液排出苯乙酸，故小儿有特殊霉味或鼠味。由于苯丙氨酸、苯丙酮酸、苯乙酸的蓄积，使脑发育障碍，髓鞘形成受阻，灰、白质变性，致婴儿早期即发生智力低下。病儿苯丙氨酸增高后，5-羟色胺、γ氨基丁酸减少，致一岁前常发生癫痫发作，重者有类似婴儿痉挛症的临床表现和脑电图出现高峰失律。病儿还可有运动障碍，脑性瘫痪，多动，震颤以及呕吐、不安、湿疹等表现。如果早期予以低苯丙氨酸饮食治疗,使患儿血液中的苯丙氨酸维持在理想范围[60～120μmolL1～2mgdL,可防止智力严重障碍以及继发癫痫等疾病的发生。因此PKU的新生儿筛查是早期发现患儿并及时予以治疗的关键所在。苯丙酮尿症phenylketonuria，PKU是由于苯丙氨酸代谢途径中酶缺陷所致，因患儿尿液中排出大量苯丙酮酸等代谢产物而得名。PKU是氨基酸代谢障碍中较常见的一种，属常染色体隐性遗传。其发病率随种族而异，约为l6000～l25000，我国发病率约为116500，呈出明显南少北多的差异。近年发现，经过治疗，智力发育正常并同正常男性结婚的女性PKU病人，如果妊娠期间不合理地控制饮食、流产、死产、宫内发育不全等发生率很高，即使其婴儿不患PKU，也多有智力低下，头小畸形、先天性心脏病等合并症，这是因为母体高浓度的苯丙氨酸可通过胎盘使胎儿受到损害。这类婴儿被称为母性PKU患儿。为此，生育期内的PKU女性患者应有计划地控制饮食，最好在妊娠前半年开始直至分娩，让血苯丙氨酸浓度控制在2～6mgdL，使胎儿免受损伤。17α-羟孕酮由肾上腺皮质及性腺产生，其孕酮活性很低。17α-羟孕酮经21-羟化酶作用，生成皮质醇的前体化合物SCpS。21-羟化酶缺乏的遗传性肾上腺皮质增生患者血清中17α-羟孕酮浓度明显升高，11-羟化酶缺乏时17α-羟孕酮上升幅度较小。约6％的成年多毛女性有不同程度的21-羟化酶缺乏。17α-羟孕酮的测定也用于分析男性和女性的普通痤疮、男性秃顶及一些不明原因的不育症。遗传性肾上腺皮质增生症congenitaladrenalhyperplasia,CAH又称肾上腺生殖器综合征或肾上腺性变态征。主要由于肾上腺皮质激素生物合成过程中所必需的酶存在缺陷，致使皮质激素合成不正常。多数病例肾上腺分泌理糖激素、理盐激素不足而雄性激素过多，故临床上出现不同程度的肾上腺皮质功能减退，伴有女孩男性化，而男孩则表现性早熟，此外尚可有低血钠或高血压等多种症候群。遗传性肾上腺皮质增生症患者中，最为常见的是21-羟化酶缺失症约80％和11-羟化酶缺失症约15％，其他情况占5％。而21-羟化酶缺失和11-羟化酶缺失时，都会引起体内的17α-羟孕酮的浓度升高。其余遗传性肾上腺皮质增生症类型，如11β-羟化酶缺失型和17α-羟化酶缺失型都极为罕见。所以，检测17α-羟孕酮对于判断遗传性肾上腺皮质增生症有显著意义。半乳糖血症galactosemia,GAL是一种常染色体隐形遗传病，其发病率为150000，是半乳糖代谢中半乳糖激酶、半乳糖一1一磷酸尿苷酰转移酶和尿苷二磷酸.半乳糖一4一异构酶缺陷均可引起半乳糖血症。通常所说的经典半乳糖血症是半乳糖基转移酶缺乏引起的半乳糖血症，半乳糖血症对新生儿有巨大的危害，由于半乳糖代谢过程中某些酶缺乏而导致半乳糖利用障碍的常染色体隐性遗传疾病,对新生儿危害严重,如不能得到早期诊治将会导致智力低下,白内障,肝、肾损害等。20世纪60年代，新生儿半乳糖血症筛查逐渐进入人们视线并被列入新生儿筛查项目，这对于半乳糖血症的早发现、早治疗提供了帮助，降低了半乳糖血症引起的新生儿死亡率。目前,临床上所采用的苯丙酮尿症、采用荧光分析法，荧光分析法半衰期短，不可以重复检测，还容易受到溶液的极性、温度、顺磁性物质、溶液的PH值、荧光猝灭、散射光等因素的干扰，这样很容易造成检测假阳性结果，给临床医生和病人造成精神和经济负担；目前临床上还没有用于检测新生儿血斑中的半乳糖的试剂盒；17α-羟孕酮主要是采用时间分辨免疫荧光法的竞争法检测，竞争法存在特异性差，采用不同试剂盒检测时检测结果差异大，不便于实验室之间的互换，而且检测时间长，一般需要3-4小时才出结果，通量低，每次每一个血斑只能出一次结果，进样量大，每次进样需要100uL左右，同时也增加了患者的痛苦。发明内容本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒及其应用，采用该试剂盒检测PKU、CAH和GAL不仅检验快速，且检测结果准确、检测结果重复性高。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒，其包括以下试剂：a校准品，所述校准品含有苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖；b提取液，所述提取液为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈中的至少一种；和c流动相，所述流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A和流动相B由Ⅰ水、Ⅱ甲醇和Ⅲ甲酸或乙酸组成，所述流动相A中，甲酸或乙酸的体积百分比为0.01％-0.05％，水与甲醇的体积比为9：1～19：1；所述流动相B中，甲酸或乙酸的体积百分比为0.01％-0.05％，水与甲醇的体积比为0：100～1：99；或者，所述流动相A和流动相B由Ⅰ水、Ⅳ乙腈和Ⅲ甲酸或乙酸组成，所述流动相A中，甲酸或乙酸的体积百分比为0.01％-0.05％，水与乙腈的体积比为9：1～19：1；所述流动相B中，甲酸或乙酸的体积百分比为0.01％-0.05％，水与乙腈的体积比为0：100～1：99。上述PKU表示苯丙酮尿症，CAH表示遗传性肾上腺皮质增生症，GAL表示半乳糖血症。反映苯丙酮尿症PKU测试的物质是苯丙氨酸，反映遗传性肾上腺皮质增生症CAH测试的物质是17α-羟孕酮，反映半乳糖血症GAL测试的物质是半乳糖。通过本发明上述试剂盒，可采用液质联用同时检测PKU、CAH和GAL，且检测结果准确、操作简单、检验快速、检测通量高、检测结果重复性高、检测成本低，并能减轻病人痛苦。作为本发明所述液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒用于检测滤纸干血片中苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖。滤纸干血片可具有采样量少、减轻受试者痛苦、运输方便等诸多优点。本发明的试剂盒及其使用方法可产业化应用于临床新生儿滤纸干血片的筛查。作为本发明所述液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒的优选实施方式，所述校准品为含有苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖的人血红细胞。作为本发明所述液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒的优选实施方式，所述校准品为6套，分别为第1、第2、第3、第4、第5和第6套校准品；第1套校准品含有0.5mgdL苯丙氨酸且不含17α-羟孕酮和半乳糖，第2套校准品含有1.5mgdL苯丙氨酸、10nmolL17α-羟孕酮和3mgdL半乳糖，第3套校准品含有3mgdL苯丙氨酸、25nmolL17α-羟孕酮和8mgdL半乳糖，第4套校准品含有5mgdL苯丙氨酸、50nmolL17α-羟孕酮和15mgdL半乳糖，第5套校准品含有10mgdL苯丙氨酸、100nmolL17α-羟孕酮和25mgdL半乳糖，第6套校准品含有15mgdL苯丙氨酸、250nmolL17α-羟孕酮和50mgdL半乳糖。作为本发明所述液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒的优选实施方式，所述提取液为以下Ⅰ～Ⅳ中的任意一种：Ⅰ甲醇与乙腈的混合物；Ⅱ甲醇、丙酮和异丙醇的混合物；Ⅲ甲醇、乙腈、丙酮和异丙醇的混合物；Ⅳ甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和异丙醇的混合物。研究表明，上述提取液中，甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和异丙醇的混合物的提取效果最佳。作为本发明所述液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒的优选实施方式，所述提取液由等体积的甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和异丙醇组成。其中，所述等体积是指甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和异丙醇的体积均相同。作为本发明所述液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括质控品，所述质控品含有苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖。作为本发明所述液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒的更优选实施方式，所述质控品为含有苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖的人血红细胞；所述质控品为2套，分别为第1和第2套质控品，第1套质控品含有2.21mgdL苯丙氨酸、20nmolL17α-羟孕酮和4mgdL半乳糖，第2套质控品含有5.68mgdL苯丙氨酸、100nmolL17α-羟孕酮和20mgdL半乳糖。作为本发明所述液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括同位素内标品，所述同位素内标品含有同位素标记的苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖。更优选地，所述同位素内标品为含有同位素标记的苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖冻干粉。作为本发明所述液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括U型96孔微孔板、V型96孔微孔板、硅胶垫和试剂盒操作说明书。另外，本发明还提供了上述试剂盒在用于同时检测PKU、CAH和GAL中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果为：目前用于临床上新生儿筛查的苯丙氨酸测定试剂盒主要采用荧光法分析法，荧光分析法半衰期短，不可重复检测，极易受到溶液的极性、温度、顺磁性物质、溶液的PH值、荧光猝灭、散射光等因素的干扰，这样很容易造成检测结果假阳性，给临床医生和病人造成精神和经济负担；17α羟孕酮测定试剂盒主要采用时间分辨免疫荧光法的竞争法，由于竞争法存在特异性差，容易受到试剂盒本身方法学、操作者及环境因素的干扰，导致实验室之间的检测结果互换性较差，而且操作时间长，一般至少需要240分钟之后才能出检测结果，这样给检测者和被检测者都带来的诸多不便；新生儿半乳糖筛查试剂盒目前国家食品药品监督管理总局还没有批准上市试剂盒，本发明在国内率先采用液质联用开发出试剂盒，质谱法结合了色谱部分对物质的高分离能力和质谱部分对物质结构和质量分析的能力，具有高选择性、高特异性、高灵敏度的特点。质谱能够将苯丙氨酸、17α羟孕酮和半乳糖同时应用于新生儿疾病筛查，具体而言，相对现有免疫荧光法，采用本发明的试剂盒以串联质谱法检测PKU、CAH和GAL具有以下优点：1本发明试剂盒操作时间短：本发明试剂盒的操作时间为40min，免疫荧光法检测PKU的时间为120min，检测CAH的时间为190min，检测GAL的时间为95min；2本发明试剂盒操作方便简单：本发明试剂盒的使用流程为打孔→提取液→提取→转移→检测→结果；免疫荧光法检测PKU的流程为打孔→加试剂→提取→转移→孵育→加试剂→检测，免疫荧光法检测CAH的流程为加试剂→孵育→加试剂→加样→孵育→洗板→加试剂→检测，免疫荧光法检测GAL的流程为打孔→加试剂→烘干→配液加试剂→加试剂→孵育→加试剂→检测；3本发明检测通量高：本发明一次实验至少检测3种标志物，免疫荧光法每次检测只检测出单种标志物；4本发明检测结果重复性好：本发明检测的RSD≤10％，免疫荧光法检测的RSD≤15％；5本发明检测结果准确性好：本发明检测准确性高，以串联质谱法检测待测物质质荷比，免疫荧光法检测检测准确性一般，免疫荧光法受抗原抗体或荧光干扰因素较多；6本发明检测成本更低；7本发明检测取样量少：本发明取样量为50uL以下，免疫荧光法的取样量为50uL。综上，本发明不仅检测结果准确、操作方便、通量高，且每次只需采一滴血，不仅为操作者提供方便，而且给特殊的采血者减少痛苦，具有很好的应用前景。附图说明图1为本发明检测苯丙氨酸的校准品曲线图；图2为本发明检测17α-羟孕酮的校准品曲线图；图3为本发明检测半乳糖的校准品曲线图；图4为本发明检测苯丙氨酸、半乳糖和17α-羟孕酮目标物结果图。具体实施方式为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中，所采用的仪器以及试剂如下：1仪器：广州市丰华生物工程有限公司FH-6000MD三重四极杆质谱分析系统，色谱柱：PhenomenexKinere2.6umXB-C1850×4.6mm100A，广州市丰华生物工程有限公司FWZ-II恒温微量振荡器,3.2mm新生儿滤纸干血片打孔钳或打孔机，江苏盛蓝仪器制造有限公司KH-500DV型数控超声波清洗器；2试剂：甲醇HPLC,Fisher、乙醇HPLC,Fisher、乙腈HPLC,Fisher、丙酮HPLC,Fisher、异丙醇HPLC,Fisher、甲乙酸LC-MSMS,Fisher、标准品、同位素内标品美国剑桥同位素内标实验室；3耗材：96孔U型和V型板NUNC、去离子水制水机密理博、液质联用实验常规耗材。实施例1本发明液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒的一种实施例，本实施例的试剂盒包括以下试剂：a校准品，所述校准品为含有苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖标准品的人血红细胞；所述校准品为6套，分别为第1、第2、第3、第4、第5和第6套校准品；第1套校准品含有0.5mgdL苯丙氨酸、0nmolL17α-羟孕酮和0mgdL半乳糖，第2套校准品含有1.5mgdL苯丙氨酸、10nmolL17α-羟孕酮和3mgdL半乳糖，第3套校准品含有3mgdL苯丙氨酸、25nmolL17α-羟孕酮和8mgdL半乳糖，第4套校准品含有5mgdL苯丙氨酸、50nmolL17α-羟孕酮和15mgdL半乳糖，第5套校准品含有10mgdL苯丙氨酸、100nmolL17α-羟孕酮和25mgdL半乳糖，第6套校准品含有15mgdL苯丙氨酸、250nmolL17α-羟孕酮和50mgdL半乳糖；b提取液，所述提取液由等体积的甲醇与乙腈组成；c流动相，所述流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A和流动相B由Ⅰ水、Ⅱ甲醇和Ⅲ甲酸组成，所述流动相A中，甲酸的体积百分比为0.01％，水与甲醇的体积比为19：1；所述流动相B中，甲酸的体积百分比为0.01％，水与甲醇的体积比为1：99；d质控品，所述质控品为含有苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖的人血清红细胞；所述质控品为2套，分别为第1和第2套质控品，第1套质控品含有2.21mgdL苯丙氨酸、20nmolL17α-羟孕酮和4mgdL半乳糖，第2套质控品含有5.68mgdL苯丙氨酸、100nmolL17α-羟孕酮和20mgdL半乳糖；e同位素内标品，所述同位素内标品为含有同位素标记的苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖冻干粉；f10块U型96孔微孔板，所述U型96孔微孔板为空白版；g10块V型96孔微孔板，所述V型96孔微孔板为空白版；h硅胶垫；和i1份试剂盒操作说明书。本实施例的试剂盒的使用方法为采用串联质谱法：1苯丙氨酸、17α-羟孕酮、半乳糖同位素内标准品的溶解：向同位素内标品中加1.0mL提取液，摇匀静置约2小时；2提取工作液的配制：提取工作液是用提取液去稀释内标而得到，提取工作液的配制方法如表1所示；3校准品和质控品配制：收集乙型肝炎病毒HBsAg、抗-HCV、抗-TP、抗-HIV全阴的全血，经过离心处理分离得到上层血浆和下层血球，取下层血球备用，将血球用生理盐水与血球比例1:1混合洗涤3次，将苯丙氨酸、17α-羟孕酮、半乳糖校准品与处理后的人血红细胞混合配制成需要浓度，取50uL滴注于Whatma903号滤纸干血片上，让其自然扩散晾干，真空保存于密封薄膜袋中；质控品制备同理；4打孔：将校准品、质控品和待测样品打孔，加入洁净的U型96孔微孔板中，并在每孔中加入100μL提取工作液，使用硅胶垫覆盖U型96孔微孔板，将挥发量降低到最小；5振荡萃取：在温度为30℃±5℃，振频为750～900rpm的条件下振荡孵育30分钟，振荡完后，从U型96孔微孔板上揭去硅胶垫；6转移：每孔转移75μL萃取所得溶液至对应位置的V型96孔微孔板V型底耐热微孔板中，使用硅胶垫覆盖微孔板，将挥发量降低到最小；7进样并检测：将带有硅胶垫的V型96孔微孔板放入自动进样器中，启用应用软件，建立样品列表，选择正确的内标浓度文件和采集方法，在应用软件中开始检测；其中，检测的色谱条件如表2所示，梯度洗脱的条件如表3所示，检测的质谱条件如表4所示；8检测结果的计算：以6个校准品的标示浓度为横坐标X,以6个校准品的实际检测峰面积与各自的内标峰面积的比值为纵坐标Y,绘制标准曲线并计算曲线的回归方程，即可计算出滤纸干血片中苯丙氨酸、17α-羟孕酮、半乳糖的浓度值；其中，检测苯丙氨酸的校准品曲线如图1所示，检测17α-羟孕酮的校准品曲线如图2所示，检测半乳糖的校准品曲线如图3所示，检测苯丙氨酸、17α-羟孕酮、半乳糖目标物结果如图4所示。表1提取工作液的配制方法表2检测的色谱条件表3梯度洗脱的条件表4检测的质谱条件实施例2本发明液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒的一种实施例，本实施例的试剂盒与实施例1所述试剂盒仅提取液和流动相不同；本实施例中，提取液由等体积的甲醇、丙酮和异丙醇组成，流动相为由流动相A和流动相B组成，所述流动相A和流动相B由Ⅰ水、Ⅱ甲醇和Ⅲ乙酸组成，所述流动相A中，乙酸的体积百分比为0.05％，水与甲醇的体积比为9：1；所述流动相B中，乙酸的体积百分比为0.05％，水与甲醇的体积比为0：100。本实施例的试剂盒的使用方法同实施例1。实施例3本发明液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒的一种实施例，本实施例的试剂盒与实施例1所述试剂盒仅提取液和流动相不同；本实施例中，提取液由等体积的甲醇、乙腈、丙酮和异丙醇组成，流动相为由流动相A和流动相B组成，所述流动相A和流动相B由Ⅰ水、Ⅱ甲醇和Ⅲ甲酸组成，所述流动相A中，甲酸的体积百分比为0.03％，水与甲醇的体积比为14：1；所述流动相B中，甲酸的体积百分比为0.03％，水与甲醇的体积比为0.5：99.5。本实施例的试剂盒的使用方法同实施例1。实施例4本发明液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒的一种实施例，本实施例的试剂盒与实施例1所述试剂盒仅提取液和流动相不同；本实施例中，提取液由等体积的甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和异丙醇组成，流动相为由流动相A和流动相B组成，所述流动相A和流动相B由Ⅰ水、Ⅱ乙腈和Ⅲ甲酸组成，所述流动相A中，甲酸的体积百分比为0.01％，水与乙腈的体积比为19：1；所述流动相B中，甲酸的体积百分比为0.01％，水与乙腈的体积比为1：99。本实施例的试剂盒的使用方法同实施例1。实施例5本发明液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒的一种实施例，本实施例的试剂盒与实施例1所述试剂盒仅提取液和流动相不同；本实施例中，提取液由等体积的甲醇、丙酮和异丙醇组成，流动相为由流动相A和流动相B组成，所述流动相A和流动相B由Ⅰ水、Ⅱ乙腈和Ⅲ乙酸组成，所述流动相A中，乙酸的体积百分比为0.05％，水与乙腈的体积比为9：1；所述流动相B中，乙酸的体积百分比为0.05％，水与乙腈的体积比为0：100。本实施例的试剂盒的使用方法同实施例1。实施例6本发明液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒的一种实施例，本实施例的试剂盒与实施例1所述试剂盒仅提取液和流动相不同；本实施例中，提取液由等体积的甲醇、乙腈、丙酮和异丙醇组成，流动相为由流动相A和流动相B组成，所述流动相A和流动相B由Ⅰ水、Ⅱ乙腈和Ⅲ甲酸组成，所述流动相A中，甲酸的体积百分比为0.03％，水与乙腈的体积比为14：1；所述流动相B中，甲酸的体积百分比为0.03％，水与乙腈的体积比为0.5：99.5。本实施例的试剂盒的使用方法同实施例1。实施例2～6中，检测苯丙氨酸的校准品曲线如图1所示，检测17α-羟孕酮的校准品曲线如图2所示，检测半乳糖的校准品曲线如图3所示。效果例1本效果例考察了本发明的试剂盒中，提取液对检测结果的影响。本效果例采用不同的提取液试剂盒其他组分同实施例1，按照实施例1所述试剂盒的使用方法，对样品中的苯丙氨酸、17α-羟孕酮、半乳糖通过加入乙腈、丙酮、乙醇、异丙醇、甲醇、等体积甲醇和乙腈混合物、等体积甲醇、丙酮和异丙醇混合物、等体积甲醇、乙腈、丙酮和异丙醇混合物、等体积甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和异丙醇混合物不同的提取液进行了检测，检测结果如表5、6、7所示。表5：苯丙氨酸两种检测结果对比表6：17α-羟孕酮两种检测结果对比表7：半乳糖两种检测结果对比表5、6、7实验数据表明提取液成分以甲醇+乙醇+乙腈+丙酮+异丙醇混合提取效率较好。效果例2本效果例采用加标回收法比较了本发明方法与免疫荧光法检测PKU、CAH和GAL的准确性与重复性。其中，加标回收法的具体步骤如下：取待测样本，每份样本分成8份，2份用于PKU、CAH和GAL检测试剂盒本发明液相色谱-串联质谱法检测，其中一份不加标准品作为对照，另外一份加入已知浓度的标准品；另外6份分别苯丙氨酸测定试剂盒荧光分析法、新生儿17α-羟孕酮测定试剂盒时间分辨荧光免疫分析法、新生儿总半乳糖测定试剂盒荧光分析法检测，同样是其中一份不加标准品作为对照，另外一份加入已知浓度的标准品，比较加入标准品和不加标准品的检测结果，由于加入标准品的浓度是已知的，可以准确计算加标回收率。检测结果如表8所示。表8回收率两种结果对比由表8可见，采用本发明试剂盒，利用液质联用检测PKU、CAH和GAL相对免疫荧光法具有更高的准确性和更好的重复性。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

权利要求：1.一种液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：a校准品，所述校准品含有苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖；b提取液，所述提取液为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈中的至少一种；和c流动相，所述流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A和流动相B由Ⅰ水、Ⅱ甲醇和Ⅲ甲酸或乙酸组成，所述流动相A中，甲酸或乙酸的体积百分比为0.01％-0.05％，水与甲醇的体积比为9：1～19：1；所述流动相B中，甲酸或乙酸的体积百分比为0.01％-0.05％，水与甲醇的体积比为0：100～1：99；或者，所述流动相A和流动相B由Ⅰ水、Ⅳ乙腈和Ⅲ甲酸或乙酸组成，所述流动相A中，甲酸或乙酸的体积百分比为0.01％-0.05％，水与乙腈的体积比为9：1～19：1；所述流动相B中，甲酸或乙酸的体积百分比为0.01％-0.05％，水与乙腈的体积比为0：100～1：99。2.如权利要求1所述的液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测滤纸干血片中苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖。3.如权利要求1所述的液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒，其特征在于，所述校准品为含有苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖的人血红细胞。4.如权利要求1所述的液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒，其特征在于，所述校准品为6套，分别为第1、第2、第3、第4、第5和第6套校准品；第1套校准品含有0.5mgdL苯丙氨酸且不含17α-羟孕酮和半乳糖，第2套校准品含有1.5mgdL苯丙氨酸、10nmolL17α-羟孕酮和3mgdL半乳糖，第3套校准品含有3mgdL苯丙氨酸、25nmolL17α-羟孕酮和8mgdL半乳糖，第4套校准品含有5mgdL苯丙氨酸、50nmolL17α-羟孕酮和15mgdL半乳糖，第5套校准品含有10mgdL苯丙氨酸、100nmolL17α-羟孕酮和25mgdL半乳糖，第6套校准品含有15mgdL苯丙氨酸、250nmolL17α-羟孕酮和50mgdL半乳糖。5.如权利要求1所述的液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒，其特征在于，所述提取液为以下Ⅰ～Ⅳ中的任意一种：Ⅰ甲醇与乙腈的混合物；Ⅱ甲醇、丙酮和异丙醇的混合物；Ⅲ甲醇、乙腈、丙酮和异丙醇的混合物；Ⅳ甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和异丙醇的混合物。6.如权利要求5所述的液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒，其特征在于，所述提取液由等体积的甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和异丙醇组成。7.如权利要求1～6任一项所述的液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒，其特征在于，还包括质控品，所述质控品含有苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖；优选地，所述质控品为含有苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖的人血红细胞；所述质控品为2套，分别为第1和第2套质控品，第1套质控品含有2.21mgdL苯丙氨酸、20nmolL17α-羟孕酮和4mgdL半乳糖，第2套质控品含有5.68mgdL苯丙氨酸、100nmolL17α-羟孕酮和20mgdL半乳糖。8.如权利要求1～6任一项所述的液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒，其特征在于，还包括同位素内标品，所述同位素内标品含有同位素标记的苯丙氨酸、17α-羟孕酮和半乳糖。9.如权利要求1所述的液质联用同时检测PKU、CAH和GAL的试剂盒，其特征在于，还包括U型96孔微孔板、V型96孔微孔板、硅胶垫和试剂盒操作说明书。10.如权利要求1～9任一项所述试剂盒在用于同时检测PKU、CAH和GAL中的应用。

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