申请/专利权人：安徽医科大学

申请日：2019-05-24

公开（公告）日：2019-10-01

公开（公告）号：CN110295121A

主分类号：C12N1/20(20060101)

分类号：C12N1/20(20060101);C12P17/16(20060101);C12R1/01(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2021.12.03#发明专利申请公布后的驳回;2019.11.01#实质审查的生效;2019.10.01#公开

摘要：本发明公开了一种海洋异壁放线菌及其在制备浅蓝霉素A中的应用。所述的海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021的保藏编号为：CCTCCNO:M2018157。本发明的海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021的发酵培养物能够制备如式I所示的浅蓝霉素A。本发明为浅蓝霉素A的生产提供了生物学制备方法，具有广阔的应用前景。

主权项：1.海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021，其保藏编号为：CCTCCNO:M2018157。

全文数据：一种海洋异壁放线菌及其在制备浅蓝霉素A中的应用技术领域本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021及其在制备浅蓝霉素AcerulomycinA中的应用。背景技术浅蓝霉素是一类来自于微生物的生物碱，结构中大多含有1个独特的二联吡啶环母核结构，到目前为止，人们从微生物的代谢产物中分离鉴定了至少49个浅蓝霉素类化合物，包括caerulomycinsA～P、caerulomycinR、4-O-methylcaerulomycinN、Z-caerulomycinA、cyanogrisidesA～H、collismycinsA～D、collismycinDA、collismycinDH、collismycinDN、collismycinDS、collismycinH、collismycinsSC和SN、collismycinM4和M6、SF2738D～F、coprismycinsA和B、pyrisulfoxinsA和B、以及caerulomycinamide和caerulomycinonitrile。浅蓝霉素AcerulomycinA是该家族首个被鉴定化合物，由Funk和Divekar于1959年分离自青蓝链霉菌StreptomycescaereleusPRL1687的次生代谢产物。浅蓝霉素类化合物的活性多样，包括抗菌、细胞毒、免疫调节、抗痢疾变形虫、神经保护、受体结合活性以及植物毒性作用等。其化学结构中共有的2,2’-联吡啶母核和醛肟基团在其活性方面发挥着重要作用。浅蓝霉素A的活性包括抗细菌、抗真菌、细胞毒和免疫抑制等方面。其中，针对其免疫调节活性方面的研究尤为重要，奠定了浅蓝霉素A被开发成为免疫抑制药物的基础。起初，Singla等研究发现浅蓝霉素A的作用靶点尤其针对于淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞以及IL4、IFNγ和抗体的产生；对应的机制是经由下调活化标记物CD28和上调免疫标记物CTLA-4的表达完成[SinglaAK,AgrewalaJN,VohraRM,etal.UseofbipyridinecompoundCaerulomycinA,andderivativesandanalogsthereof,asimmunosuppressiveagents[P].PCTInt.Appl,2007,WO2007031832A2[P].20070322]。随后发现，浅蓝霉素A可以通过抑制IFN-γ-STAT1信号通路、增强TGF-β-Smad3信号，继而强化信号转导抑制因子SOCS1的表达实现[GurramRK,KujurW,MauryaSK,etal.CaerulomycinAenhancestransforminggrowthfactor-βTGF-β-Smad3proteinsignalingbysuppressinginterferon-γIFN-γ-signaltransducerandactivatoroftanscription1STAT1proteinsignalingtoexpandregulatoryTCellsTregs[J].JBiolChem,2014,28925:17515-17528]。接着，该小组还发现，浅蓝霉素A可以通过将T细胞阻留在G1期，从而影响在移植排斥反应中起着重要作用的T细胞核B细胞的抗原反应[SinglaAK,GurramRK,ChauhanA,etal.CaerulomycinAsuppressesimmunitybyinhibitingTcellactivity[J].PLoSOne,2014,910:e107051.]。值得一提的是，浅蓝霉素A的免疫抑制活性10倍优于现有临床药物环孢菌素A；鉴于此，美国Nostrum制药公司正致力于将其开发成为新型免疫抑制剂药物。微生物体内浅蓝霉素家族化合物的产生通过聚酮非核糖体肽杂合途径合成，即在合成模块中既有PKS模块，又有NRPS模块。距今，国内外已有很多关于浅蓝霉素的生物合成相关研究的报道，包括浅蓝霉素生物合成途径推导、关键酶的功能及催化机制阐明等。微生物发酵获取浅蓝霉素A有效地避开了化学全合成收率低、环节不友好等问题。相应产生菌的获得可为后续基因工程菌株的构建奠定基础。发明内容本发明的目的之一是提供一种能够产生浅蓝霉素AcerulomycinA的海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021，该菌于2018年3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为：CCTCCNO:M2018157。本发明人所在研究团队在对海洋环境样品进行放线菌分离时得到了一株放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ02，后续经核糖体抗性诱变选育得到Actinoalloteichussp.AHMUCJ021菌株。对新菌株Actinoalloteichussp.AHMUCJ021进行发酵并运用活性追踪进行分离获得1个单体化合物。通过1H-NMR，13C-NMR、MS等波谱分析以及理化数据对照，将其结构鉴定为浅蓝霉素A，结构式见式I：选育得到的新菌株Actinoalloteichussp.AHMUCJ021与直接分离得到的Actinoalloteichussp.AHMUCJ02菌株在菌落形态上没有明显差别，但后者Actinoalloteichussp.AHMUCJ02不能产生浅蓝霉素A，具体如图2所示。本发明的目的之二是提供海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021在制备浅蓝霉素A中的应用。本发明的目的之三是提供浅蓝霉素A的制备方法，所述的浅蓝霉素A是从海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021的发酵培养物中分离制备得到的，具体包括以下步骤：a制备海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵上清液和菌丝体分开，发酵上清液用丁酮萃取，丁酮相经浓缩后得到浸膏A，菌丝体用丙酮浸泡萃取，丙酮浸提液经浓缩后得到浸膏B；b将浸膏A和浸膏B合并，采用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇作为洗脱剂，用体积比100:0，98:2，96:4，94:6，92:8，90:10，80:20，50:50进行梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为96:4，94:6洗脱的馏分Fr.3和Fr.4，经纯化获得浅蓝霉素A。所述的纯化是将Fr.3和Fr.4过中压反相柱层析，以流动相甲醇H2O0％～100％vv梯度洗脱60min，流速10mLmin，每馏分50mL，顺序得到12个馏分Fr.1～12，经HPLC追踪检测，对Fr.5-Fr.8进行常压正相柱层析，使用石油醚-乙酸乙酯按7:3，6:4，5:5，4:6，3:7体积比梯度洗脱，以HPLC追踪，将含有浅蓝霉素A的馏分用半制备高效液相色谱仪纯化获得浅蓝霉素A。所述的海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021的发酵培养物是通过以下方法制备：将海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021接入种子培养基中，发酵得种子培养液，将种子培养液接入到发酵培养基中，发酵得到发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方均为：麦芽提取粉10gL，酵母浸粉4gL，葡萄糖4gL，海盐30gL，余量为水，pH＝7.2～7.4。本发明的有益效果为：本发明提供了一种能够产生浅蓝霉素A的海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021，利用该菌可以制备浅蓝霉素A，从而为浅蓝霉素A的生产制备提供了生物制备方法，具有广阔的应用前景。本发明的海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021于2018年3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为：CCTCCNO:M2018157。附图说明图1是海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021的系统进化树。图2是不同菌株发酵提取物的HPLC图谱：其中i指海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021发酵生产浅蓝霉素AcerulomycinA；ii指菌株Actinoalloteichussp.AHMUCJ02在与海洋异壁放线菌AHMUCJ021相同的发酵条件下发酵不能生产浅蓝霉素AcerulomycinA。图3是化合物1浅蓝霉素A的高分辨质谱结果。HR-ESI-MS[M+H]+：230.0932；HR-ESI-MS[M+Na]+：252.0757，MF：C12H11N3O2。图4是化合物1浅蓝霉素A的核磁共振氢谱1H-NMR。图5是化合物1浅蓝霉素A的核磁共振碳谱13C-NMR。具体实施方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1：海洋异壁放线菌AHMUCJ021的分离与鉴定本发明的海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ02是从我国东海海域的沉积物样品中分离得到的。该菌株的分类学特征是：1、形态学特征：菌落干燥，单菌落一般呈圆形，较小，较紧密，易扩散，中间凸起，基内菌丝与气生菌丝易挑起，末期产孢子后，孢子易刮取。在ISP2培养基上形成灰色的气生菌丝和黑色的基质菌丝。2、分子生物学分离特征：提取上述Actinoalloteichussp.AHMUCJ02菌株的基因组DNA，通过常规方法PCR扩增其16SrDNA序列，并测序分析，其16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示，构建基于16SrDNA序列的系统进化树如图1所示，显示菌株AHMUCJ02与异壁放线菌属序列相似性度为99％，表明菌株AHMUCJ02为海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.，后菌株AHMUCJ02经核糖体抗性诱变选育得到菌株AHMUCJ021，菌株AHMUCJ021命名为海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021，该菌于2018年3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为：CCTCCNO:M2018157。实施例2：浅蓝霉素AcerulomycinA的分离鉴定1、制备海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021的发酵培养物：1种子培养基和发酵培养基的配制：a种子培养基的配制：每升种子培养基中含有麦芽提取粉10g，酵母浸粉4g，葡萄糖4g，海盐30g，余量为水，pH＝7.2～7.4，将各组分按其含量混合均匀，调pH值，配制1L种子培养基，然后平均分装于20个250mL锥形瓶中，每个装有50mL种子培养基，115℃灭菌30min，冷却后备用。b发酵培养基的配制：每升发酵培养基中含有麦芽提取粉10g，酵母浸粉4g，葡萄糖4g，海盐30g，余量为水，pH＝7.2～7.4，将各组分按其含量混合均匀，调pH值，配制4L发酵培养基，然后平均分装于20个1L锥形瓶中，每个装有200mL发酵培养基，115℃灭菌30min，冷却后备用。2种子的培养：将活化的海洋异壁放线菌AHMUCJ021接入到装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，于28℃、200rpm的振荡培养24～48h，得到种子培养液。3规模发酵培养：将上述锥形瓶中的50mL种子培养液转接到装有200mL发酵培养基的1L锥形瓶中，于28℃、200rpm的摇床上培养7-9天，获得海洋异壁放线菌AHMUCJ021的发酵培养物。2、海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021所产浅蓝霉素AcerulomycinA的分离1发酵培养物的萃取将海洋异壁放线菌AHMUCJ021的发酵培养物进行离心分离3800～4000rmin，10～15min使发酵上清液与菌丝体分开；发酵上清液使用等体积丁酮萃取3次，丁酮相经旋蒸冷凝浓缩之后得到浸膏A；菌丝体使用丙酮1.5L浸泡萃取，超声处理得到丙酮浸提液，丙酮浸提液经旋蒸冷凝浓缩后得到浸膏B。2浅蓝霉素AcerulomycinA的提取经HPLC分析，浸膏A和浸膏B的成分类似，将浸膏A和浸膏B合并，经正相硅胶柱层析，用氯仿-甲醇作为流动相，从体积比100:0，98:2，96:4，94:6，92:8，90:10，80:20，50:50进行梯度洗脱，100％氯仿梯度下洗脱下来的馏分记为Fr.1，氯仿-甲醇体积比为98:2梯度下洗脱下来的馏分记为Fr2，氯仿-甲醇体积比为96:4梯度下洗脱下来的馏分记为Fr3，氯仿-甲醇体积比为94:6梯度下洗脱下来的馏分记为Fr.4，氯仿-甲醇体积比为92:8梯度下洗脱下来的馏分记为Fr.5，氯仿-甲醇体积比为90:10梯度下洗脱下来的馏分记为Fr.6，氯仿-甲醇体积比为80:20梯度下洗脱下来的馏分记为Fr.7，氯仿-甲醇体积比为50:50梯度下洗脱下来的馏分记为Fr.8。对上述馏分Fr.1～8进行高效液相分析，发现Fr.3和Fr.4馏分中含有化合物cerulomycinA如图2中的i所示，Fr.3和Fr.4经中压反相柱层析流动相CH3CNH2O0％～100％vv梯度洗脱60min，流速10mLmin，每馏分50mL，顺序得到12个馏分Fr.1～12。经HPLC追踪检测，对馏分Fr.5～8进行常压正相柱层析，使用石油醚：乙酸乙酯按7:3，6:4，5:5，4:6，3:7体积比梯度洗脱，以HPLC追踪，将含有化合物cerulomycinA的馏分用半制备高效液相色谱仪YMC-PackODS-Acolumn进一步纯化：条件为流动相CH3CNH2O45％～90％vv梯度洗脱30min，流速2.5mLmin，得到化合物1化合物cerulomycinA，保留时间15.8min。3浅蓝霉素AcerulomycinA的鉴定通过结构分析，对本发明的从海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021的发酵培养物中制备的化合物的鉴定结果如下：化合物1，白色粉末，HR-ESI-MS+给出准分子离子峰mz230.0932[M+H]+，252.0757[M+Na]+，预测分子式为C12H11N3O2，不饱和度为9。1H-NMR高场区有一个甲氧基的质子信号，低场区有6个耦合的芳香氢信号，根据其耦合常数可分为两组：δH7.90d,J＝2.0Hz和7.32d,J＝2.0Hz；8.68d,J＝7.5Hz、8.38d,J＝7.0Hz、7.94dd,J＝7.5,7.0Hz及7.45dd,J＝7.5,7.5Hz，结合碳谱中的芳碳信号，以及分子中存在氮原子，提示分子中存在两个芳环体系，推测为吡啶环，占用10个芳碳；剩余的一个芳碳信号，结合1H-NMR在低场区存在一个单峰芳香质子信号δH8.15s，以及一个活泼质子信号δH11.731H，s，推断分子中存在醛肟的结构单元。化合物1的高分辨质谱见图3所示，核磁共振氢谱1H-NMR、核磁共振碳谱13C-NMR分别见图4、5所示。经与文献对比[McInnesA.,SmithD.,WrightJ.etal.CaerulomycinsBandC,new2,2'-dipyridylderivativesfromStreptomycescaeruleus[J].CanadianJournalofChemistry,1977,5524:4159-4165]，确定化合物1为浅蓝霉素AcerulomycinA，其结构如式I所示。化合物1的波谱数据如下表1：表1化合物1的NMR数据500125MHz,TMS为内标,ppm以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表安徽医科大学一种海洋异壁放线菌及其在制备浅蓝霉素A中的应用1SIPOSequenceListing1.011382DNA异壁放线菌AHMUCJ021Actinoalloteichussp.AHMUCJ0211catgcaagtcgagcggtaaggcccttcggggtacacgagcggcgaacgggtgagtaacac60gtgggcaacctgccctgcactctgggataacctcgggaaaccggggctaataccggatac120gaccttcccccgcatgggggtgggtggaaagttccggcggtgcaggatgggcccgcggcc180tatcagcttgttggtggggtaatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagag240ggcgaccggccacactgggactgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtggg300gaatattgcgcaatgggcgaaagcctgacgcagcgacgccgcgtgagggatgacggcctt360cgggttgtaaacctctttcagcgccgaagaagcgaaagtgacggtaggcgcagaagaagc420accggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttgtccggaat480tattgggcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtcgactgtgaaaacctacagctta540actgtgggcgtgcagtcgatacgggcagacttgagttcggtaggggagactggaattcct600ggtgtagcggtggaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctg660ggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggt720agtccacgccgtaaacggtgggcgctaggtgtgggggatttccacgtcctccgtgccgta780gctaacgcattaagcgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaat840tgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaacc900ttacctgggtttgacatgcactggatcgcctcagagatggggtttccgtaaggtcagtgt960gcaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaac1020gagcgcaacccttgttccatgttgccagcacgtaatggtggggactcatgggagactgcc1080ggggtcaactcggaggaaggtggggatgaggtcaagtcatcatgccccttatgtccaggg1140cttcacacatgctacaatggccggtacagagggctgcgaaatcgcaaggtggagcgaatc1200tcttaaagccggtctcagttcggatcggggtctgcaactcgaccccgtgaagtcggagtc1260gctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccg1320cccgtcacgtcatgaaagtcggtaacacccgaagcccgtggcccaacccttgtgggggga1380gc1382

权利要求：1.海洋异壁放线菌Actinoalloteichussp.AHMUCJ021，其保藏编号为：CCTCCNO:M2018157。2.权利要求1所述的海洋异壁放线菌AHMUCJ021在制备浅蓝霉素A中的应用。3.一种浅蓝霉素A的制备方法，其特征在于，所述的浅蓝霉素A是从权利要求1所述的海洋异壁放线菌AHMUCJ021的发酵培养物中制备得到的。4.根据权利要求3所述的浅蓝霉素A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a制备海洋异壁放线菌AHMUCJ021的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵上清液和菌丝体分开，发酵上清液用丁酮萃取，丁酮相经浓缩后得到浸膏A，菌丝体用丙酮浸泡萃取，丙酮浸提液经浓缩后得到浸膏B；b将浸膏A和浸膏B合并，采用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇作为洗脱剂，用体积比100:0，98:2，96:4，94:6，92:8，90:10，80:20，50:50进行梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为96:4，94:6洗脱的馏分Fr.3和Fr.4，经纯化获得浅蓝霉素A。5.根据权利要求4所述的浅蓝霉素A的制备方法，其特征在于，所述的纯化是将Fr.3和Fr.4过中压反相柱层析，以流动相甲醇H2O0％～100％vv梯度洗脱60min，流速10mLmin，每馏分50mL，顺序得到12个馏分Fr.1～12，经HPLC追踪检测，对Fr.5-Fr.8进行常压正相柱层析，使用石油醚：乙酸乙酯按7:3，6:4，5:5，4:6，3:7体积比梯度洗脱，以HPLC追踪，将含有浅蓝霉素A的馏分用半制备高效液相色谱仪纯化获得浅蓝霉素A。6.根据权利要求4所述的浅蓝霉素A的制备方法，其特征在于，所述的海洋异壁放线菌AHMUCJ021的发酵培养物是通过以下方法制备：将海洋异壁放线菌AHMUCJ021接入到种子培养基中，发酵得种子培养液，将种子培养液接入到发酵培养基中，发酵得到发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方均为：麦芽提取粉10gL，酵母浸粉4gL，葡萄糖4gL，海盐30gL，余量为水，pH＝7.2～7.4。

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