申请/专利权人：潍坊科技学院

申请日：2016-09-13

公开（公告）日：2019-10-01

公开（公告）号：CN106146641B

主分类号：C07K14/46(20060101)

分类号：C07K14/46(20060101);C12N15/12(20060101);A61P31/04(20060101);A61P31/10(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2019.10.01#授权;2016.12.21#实质审查的生效;2016.11.23#公开

摘要：本发明属于生物医学技术领域，具体的说是一种泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM‑CATHs及其应用。泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM‑CATHs，FM‑CATH1和FM‑CATH2为直链多肽，分子量分别为3815.7Da和3773.6Da，等电点均为12.33。本发明克隆得到泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM‑CATH1和FM‑CATH2的编码基因，并利用化学合成的方法合成了FM‑CATH1和FM‑CATH2。该抗菌肽具有极强的抗菌活性，且细胞毒性和溶血活性低。

主权项：1.一种泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽，其特征在于：所述泽蛙cathelicidin家族抗菌肽为FM-CATH1，FM-CATH1氨基酸序列为：Arg1Thr2Arg3Arg4Ala5Ile6Lys7Lys8Leu9Lys10Thr11Lys12Val13Leu14Asn15Lys16Leu17Lys18Gln19Lys20Leu21Gln22Ala23Val24Gly25Asn26Leu27Ile28Gly29Ser30Val31Ile32Lys33Ala34。

全文数据：泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽及其应用技术领域本发明属于生物医学技术领域，具体的说是一种泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs及其应用。背景技术由于传统抗生素的大规模滥用导致病原微生物抗药性不断增强，严重影响了人类生活和健康。为应对抗药微生物，不断使用耐药微生物尚未使用过的新的或者替代性的抗生素是主要解决措施，因此这就需要持续开发新的抗微生物药物。抗菌肽，是生物机体在抵御病原微生物的防御反应中所产生的一类抗微生物与一些肿瘤细胞的小分子多肽。抗菌肽抗菌谱广，不仅对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有较强的杀灭作用，对某些真菌、原生动物，甚至对耐药性细菌也具有杀灭作用，因此极有可能成为一种高效、低毒且无残留危害的抗菌、抗病毒、抗癌新药。截至目前，已从不同生物体中发现超过1500多种不同的抗菌肽，而且其数目还在增加。发明内容本发明的目的在于提供一种泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs及其应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽，泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs，FM-CATH1和FM-CATH2为直链多肽，分子量分别为3815.7Da和3773.6Da，等电点均为12.33。所述泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATH1氨基酸序列为：Arg1Thr2Arg3Arg4Ala5Ile6Lys7Lys8Leu9Lys10Thr11Lys12Val13Leu14Asn15Lys16Leu17Lys18Gln19Lys20Leu21Gln22Ala23Val24Gly25Asn26Leu27Ile28Gly29Ser30Val31Ile32Lys33Ala34；泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATH2氨基酸序列为：Arg1Thr2Arg3Arg4Ala5Ile6Lys7Lys8Leu9Lys10Thr11Lys12Ala13Leu14Asn15Lys16Leu17Lys18Gln19Lys20Leu21Gln22Ala23Val24Gly25Asn26Leu27Ile28Gly29Ser30Val31Ile32Lys33Gly34。所述编码泽蛙cathelin家族抗菌肽FM-CATH1和FM-CATH2前体为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示碱基序列。一种泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs的应用，所述泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs在用于制备抗细菌药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体中的应用。本发明所具有的优点：本发明克隆得到泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs的编码基因，并利用化学合成的方法合成了FM-CATHs。该类抗菌肽具有极强的抗菌活性和较低的细胞毒性和溶血活性。具体实施方式下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。实施例1泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs编码基因的克隆：1泽蛙肺部总RNA提取：①取300mg泽蛙肺部组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入1m1总RNA提取缓冲液Trizol，美国Invitrogen公司产品，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75％VV乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为泽蛙肺部抗菌肽总RNA。2泽蛙肺部cDNA文库构建：采用CLONTECH公司In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit。1cDNA第一链合成mRNA反转录：①经DEPC处理DEPC处理是在含0.1％VVDEPC的水浸泡过夜，高压灭菌，烘干的离心管中加入1μl泽蛙肺部总RNA、1μl3’端一链合成引物3’In-FusionSMARTerCDSPrimer和2.5μl经DEPC处理DEPC处理是将含0.1％VVDEPC的水，放置过夜，高压灭菌的水使总体积达到4.5μl，混匀后短暂离心2000rpm，30s，离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。②在上述离心管中加入以下试剂均为CLONTECH公司In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit建库试剂盒中配备，2.0μl5×第一链缓冲液、0.25μl100mMDTT、1.0μl10mMdNTPMix、1.0μlSMARTerV寡核苷酸、0.25μl核糖核酸酶抑制剂和1.0μlSMARTScribe反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心2000rpm，30s，在42℃保温90min，然后68℃保温10min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。2采用长末端聚合酶链式反应LD-PCR方法扩增第二链所用试剂均为CLONTECH公司In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit建库试剂盒中配备①将2μlcDNA第一链mRNA反转录、80μl去离子水、10μl10×Advantage2PCR缓冲液、2μl50×dNTP混合物、2μl5’PCR引物5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAXX-XXX-3’、2μlCDSIII3’PCR引物5’-CGGGGTACGATGAGACACCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’,N＝A,C,G或T，V＝A,G或C以及2μl50×Advantage2PolymeraseMix在95℃预热的PCR管中进行混合。②在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，1min；18个循环：95℃，15sec，65℃，30sec，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链－80℃保存。3泽蛙cathelicidin家族抗菌肽基因克隆筛选：根据两栖类动物cathelicidin家族抗菌肽编码基因信号肽区保守序列设计正向引物进行PCR扩增，其序列为5’-GGATGAAGATCTGGCAGTGTGTG-3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit中的3’-PCR引物，其序列为5’-TACGCGACGCGATACGCGAAT-3’。PCR反应在如下条件下进行：94℃5min，94℃30sec，57℃30sec和72℃1min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒天根生物进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pMD19-T载体Takara,大连，转化进CaCl2-MgCl2法制备好的DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素和蓝白斑双重筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用AppliedBiosystemsDNAsequencer,modelABIPRISM377进行核苷酸测序。测定结果：编码泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATH1前体的基因自5’端至3’端序列SEQIDNo.1所示：atgaaggtctggcagtgtgtgctctggatctgcgcgatcacattgcactcagctcgctcgcagtcctcagatcaggacgggtggatcagagaggccttggatctctacaaccagaaggatgatggggagttctgctttaaattcctgtcggatctcccagatgcccttctggaggaggagggagactctcaatctatcggcttcctaataaaggagacggactgcctgaaatctgaaggccaagacttggagcaatgcgactacaaggaggacggggaggtgaaggcctgcgttctgagcgcagaagaggaggtgaagtgcgtcagcctgtctgagaagcgacgcacccggagagccatcaaaaaactgaaaaccaaagtcttaaacaaactgaagcaaaagctccaagctgtcggcaatctcatcgggagcgtgatcaaagcataaatgaacatccgctgcagaaaaaacgcttcaatccgatcatcgcaatcagttatatccagaggaaaggaaaccgcaatatacgtcccccgcacttcttattagcaaatattgtgtgtgcactgaatacacagatttatcaataaattcagtaccatttgctttaaaaaaaaaaaaaaaaaa序列特征：*长度：626碱基对有效长度为102碱基对，其中编码抗菌肽FM-CATH1为第343-444位核苷酸。*类型：核苷酸*链型：单链*拓扑结构：直链状b分子类型：cDNAc假设：否d反义：否e最初来源：泽蛙肺编码泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATH2前体的基因自5’端至3’端序列SEQIDNo.2所示：atgaaggtctggcagtgtgtgctctggatctgcgcgatcacattgcactcagctcgctcgcagtcctcagatcaggacgggtggatcagagaggccttggatctctacaaccagaaggatgatggggagttctgctttaaattcctgtcggatctcccagatgcccttctggaggaggagggagactctcaatctatcggcttcctaataaaggagacggactgcctgaaatctgaaggcCaagacttggagcaatgcgactacaaggaggacggggaggtgaaggcctgcgttctgagcgcagaagaggaggtgaagtgcgtcagcctgtctgagaagcgacgcacccggagagccatcaaaaaactgaaaaccaaagccttaaacaaactgaagcaaaagctccaagctgtcggcaatctcatcgggagcgtgatcaaaggataaatgaacatccgctgcagaaaaaacgcttcaatccgatcatcgcaatcagttatatccagaggaaaggaaaccgcaatatacgtcccccgcacttcttattagcaaatattgtgtgtgcactgaatacacagatttatcaataaattcagtaccatttgctttataaaaaaaaaaaaaaaaaaaa序列特征：*长度：630碱基对有效长度为102碱基对，其中编码抗菌肽FM-CATH2为第343-444位核苷酸。*类型：核苷酸*链型：单链*拓扑结构：直链状b分子类型：cDNAc假设：否d反义：否e最初来源：泽蛙肺实施例2泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs的化学合成：Ⅰ、泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs的化学合成方法：根据基因推导的成熟肽氨基酸序列，用自动多肽合成仪433A,AppliedBiosystems合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐。Ⅱ、纯化的泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱MALDI-TOF，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs是基因编码的一种直链多肽，包括FM-CATH1和FM-CATH2两种多肽，均含有三十四个氨基酸残基，分子量分别为3815.7Da和3773.6Da，等电点均为12.33。FM-CATH1全序列为：Arg1Thr2Arg3Arg4Ala5Ile6Lys7Lys8Leu9Lys10Thr11Lys12Val13Leu14Asn15Lys16Leu17Lys18Gln19Lys20Leu21Gln22Ala23Val24Gly25Asn26Leu27Ile28Gly29Ser30Val31Ile32Lys33Ala34FM-CATH2全序列为：Arg1Thr2Arg3Arg4Ala5Ile6Lys7Lys8Leu9Lys10Thr11Lys12Ala13Leu14Asn15Lys16Leu17Lys18Gln19Lys20Leu21Gln22Ala23Val24Gly25Asn26Leu27Ile28Gly29Ser30Val31Ile32Lys33Gly34实施例3泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs活性实验：1.泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs抑菌活性检测：1分别挑取保存于斜面上的试验菌株均匀涂布于MH固体培养基购自青岛海博生物技术有限公司平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mgml的抗菌多肽FM-CATHs样品溶液10μl，于37℃倒置培养18－20小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。2泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs最小抑菌浓度MinimumInhibitoryConcentration测定2倍稀释法：选择上步实验中具有抑菌圈的菌株进行MIC测定实验。试验菌株接种到MH液体培养基青岛海博生物技术有限公司中，37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的培养液稀释到2×105cfuml待用。在无菌96孔板各孔中预先加入100μlMH液体培养基，然后在第一孔中加入100μl用MH液体培养基稀释到一定浓度的经0.22μm孔滤膜过滤的泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs抑菌样品溶液，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释参见表1，自第9孔吸出100μl弃去，第10孔系对照管。表1稀释方法将上述各管混匀后放置37℃缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。由表2可见，泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均表现出很强的抗菌活性，且FM-CATH1和FM-CATH2抑菌活性类似，结果显示MIC值处于4.69-75μgml的范围。表2泽蛙来源cathelin家族抗菌肽FM-CATH1和FM-CATH2抑菌活性MIC：最小抑菌浓度，以上结果为三次独立重复实验平均值。2.泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs溶血活性测定：将新鲜人血与阿氏液葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.8g，柠檬酸0.055g，氯化钠0.42g，蒸馏水100ml，高压灭菌按体积比1:1混合抗凝得混合液，而后采用生理盐水洗涤2次，并用生理盐水重悬上述抗凝的混合液成107-108cellml的悬浮液。上述悬浮液红细胞悬液与溶解于生理盐水的泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs样品混合，使样品终浓度为200μgml，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用TritonX-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝A样品-A阴性对照A阳性对照×100％。结果表明样品浓度为200μgml时，FM-CATH1和FM-CATH2的溶血百分比分别为15.2％和16.8％，说明FM-CATH具有极低的溶血活性，基本不会引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害，因此十分利于其在医药领域进一步的开发应用。3.泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs细胞毒性检测：1将人肝癌细胞HepG2,人前列腺癌细胞PC3和老鼠纤维原细胞L929这三种实验用细胞经添加10％胎牛血清的细胞培养基DMEM,Gibco,USA培养，培养环境为含有5％CO2的细胞培养箱。将上述三种细胞用胰酶消化，接种96孔板中至每孔约2×104个细胞100μl，细胞培养箱37℃过夜培养，细胞贴壁生长。2将泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs样品用DMEM细胞培养基稀释至400μgml浓度，在96孔板中每孔各加入100μl，细胞培养箱37℃培养48h。空白对照使用DMEM细胞培养基，细胞死亡率百分比按以下公式计算：细胞死亡率％＝A空白对照-A样品A空白对照×100％。结果如表3所示。结果表明在浓度为200μgml时，泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATH1样品能分别导致HepG2,PC3和L929三种细胞14.5％,13.6％和21.3％的死亡率，FM-CATH2样品则分别导致HepG2,PC3和L929三种细胞16.5％,14.6％和18.9％的死亡率。表明FM-CATHs对细胞毒性低，有利于其在医药领域进一步的开发应用。。表3.泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs细胞毒性以上结果为三次独立重复实验平均值。最后需要说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

权利要求：1.一种泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽，其特征在于：所述泽蛙cathelicidin家族抗菌肽为FM-CATH1，FM-CATH1氨基酸序列为：Arg1Thr2Arg3Arg4Ala5Ile6Lys7Lys8Leu9Lys10Thr11Lys12Val13Leu14Asn15Lys16Leu17Lys18Gln19Lys20Leu21Gln22Ala23Val24Gly25Asn26Leu27Ile28Gly29Ser30Val31Ile32Lys33Ala34。2.一种泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽，其特征在于：所述泽蛙cathelicidin家族抗菌肽为FM-CATH2，FM-CATH2氨基酸序列为：Arg1Thr2Arg3Arg4Ala5Ile6Lys7Lys8Leu9Lys10Thr11Lys12Ala13Leu14Asn15Lys16Leu17Lys18Gln19Lys20Leu21Gln22Ala23Val24Gly25Asn26Leu27Ile28Gly29Ser30Val31Ile32Lys33Gly34。3.编码权利要求1所述泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽的核酸。4.编码权利要求2所述泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽的核酸。5.权利要求1或2所述的泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽的应用，其特征在于：所述泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATH1或FM-CATH2在用于制备抗细菌药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体中的应用。

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