买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：贵州大学

摘要：本发明公开了一种采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法。本发明具有操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强、有效解决了PCR污染、PCR热不稳定的问题、自动化程度高等特点，比采用其它方法适应性更强、效果更好。且本发明简单易懂，便于操作。

主权项：1.一种采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法，其特征在于：包括如下步骤：1提取屠宰后的发情期产单羔、产多羔的黔北麻羊母羊下丘脑、垂体、子宫、输卵管和卵巢10个性腺组织的总RNA；采用超微量分光光度计与1％琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA的特异性、完整性以及纯度；2对提取的符合要求的总RNA依据逆转录试剂盒合成cDNA第一链；并以逆转录后的cDNA第一链为模板，分别对目的基因CTSB和内参基因β-actin进行普通PCR扩增；3目的基因CTSB上游引物的序列为5'-TGACTCGCATGTAGGTTGC-3'、下游引物的序列为5'-TGGAGACGCTGTAGGAA-3'；内参基因β-actin上游引物的序列为5'-AGATGTGGATCAGCAAGCAG-3'、下游引物的序列为5'-CCAATCTCATCTCGTTTTCTG-3'；PCR扩增产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测。4将电泳检测出的目的条带切下，切胶回收产物与pMD19-T载体连接，再转化为大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，将鉴定为阳性的菌液进行测序，将测序正确的菌液进行扩繁与质粒提取工作，并将获得的重组质粒进行定量稀释，以稀释后的重组质粒作为模板，采用实时荧光定量PCR扩增目的基因CTSB与内参基因β-actin，获得标准曲线与熔解曲线；利用2-ΔΔCt相对定量法计算目的基因CTSB的相对表达量，并检测差异表达量。

全文数据：采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法技术领域本发明涉及生物科学技术领域，特别涉及到采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法。背景技术CTSBCathepsinB，组织蛋白酶B属于溶酶体半胱氨酸抑制剂蛋白酶家族成员，与不同的生化功能和病理障碍有着紧密联系。如在适宜pH贵州大学采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法4SIPOSequenceListing1.0119DNA山羊Nelumbonucifera1tgactcgcatgtaggttgc19217DNA山羊Nelumbonucifera2tggagacgctgtaggaa17320DNA山羊Nelumbonucifera3agatgtggatcagcaagcag20421DNA山羊Nelumbonucifera4ccaatctcatctcgttttctg21

权利要求：1.一种采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法，其特征在于：包括如下步骤：1提取屠宰后的发情期产单羔、产多羔的黔北麻羊母羊下丘脑、垂体、子宫、输卵管和卵巢10个性腺组织的总RNA；采用超微量分光光度计与1％琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA的特异性、完整性以及纯度；2对提取的符合要求的总RNA依据逆转录试剂盒合成cDNA第一链；并以逆转录后的cDNA第一链为模板，分别对目的基因CTSB和内参基因β-actin进行普通PCR扩增；3目的基因CTSB上游引物的序列为5'-TGACTCGCATGTAGGTTGC-3'、下游引物的序列为5'-TGGAGACGCTGTAGGAA-3'；内参基因β-actin上游引物的序列为5'-AGATGTGGATCAGCAAGCAG-3'、下游引物的序列为5'-CCAATCTCATCTCGTTTTCTG-3'；PCR扩增产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测。4将电泳检测出的目的条带切下，切胶回收产物与pMD19-T载体连接，再转化为大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，将鉴定为阳性的菌液进行测序，将测序正确的菌液进行扩繁与质粒提取工作，并将获得的重组质粒进行定量稀释，以稀释后的重组质粒作为模板，采用实时荧光定量PCR扩增目的基因CTSB与内参基因β-actin，获得标准曲线与熔解曲线；利用2-ΔΔCt相对定量法计算目的基因CTSB的相对表达量，并检测差异表达量。2.根据权利要求1所述的采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法，其特征在于：步骤2中对目的基因CTSB和内参基因β-actin进行扩增时，PCR程序为：预变性95℃5min，95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，72℃终延伸7min；反应体系为20μL，其中包括：2xTaqPCRMasterMix10μL，DNA模板2μL，上、下游引物各1μL，ddH2O6μL。3.根据权利要求1所述的采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法，其特征在于：步骤4中切胶回收产物与pMD-19T载体进行连接的体系为10μL，其中包括pMDTM19-TVector1μL，切胶回收产物4μL，SolutionI连接酶5μL，16℃金属浴连接12h。4.根据权利要求1所述的采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法，其特征在于：步骤4中转化为大肠杆菌感受态细胞的方法如下：1将大肠杆菌DH5α感受态细胞置于冰上解冻后轻轻摇晃将细胞悬浮；2将金属浴过夜连接的连接液加入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并用枪头轻轻将细胞与连接液混匀，放置冰上静置20min；3在将其放入42℃水浴锅内恒温加热90s，加热后放置冰上冷却10min；4向试管中加入普通液体培养基，放置摇箱内以37℃，200rpm振荡1h；5振荡后的体液放入冷冻离心机中5000rpm离心5min，离心管底部有细胞析出，用枪头吸掉上清液，用枪头来回吹打剩余的培养基将细胞与培养基混匀；6将细胞悬液均匀的涂在含有X-gal和IPTG的含AMP的固体培养基平板上；7将平板放置37℃恒温箱内1h，待平板表面液体干后倒置培养12-16h。

百度查询： 贵州大学 采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法