申请/专利权人：张灏

申请日：2017-02-17

公开（公告）日：2020-08-21

公开（公告）号：CN106929508B

主分类号：C12N15/113(20100101)

分类号：C12N15/113(20100101);A61K48/00(20060101);A61K31/713(20060101);A61K39/395(20060101);A61P35/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.08.21#授权;2017.08.01#实质审查的生效;2017.07.07#公开

摘要：本发明提供了一种激活PTPRO基因表达的saRNA，所述saRNA包括与PTPRO基因启动子区‑3000位点至‑200位点区域互补的序列。本发明所述saRNA能够激活PTPRO基因的表达，通过提高药物敏感基因PTPRO基因的表达或活性，进而提高药物敏感性，抑制肿瘤细胞生长，达到杀死肿瘤细胞的目的，从而治疗肿瘤；本发明还提供了一种装载该saRNA的转运载体，并运用修饰剂在该转运载体表面进行功能化修饰，构造能识别肿瘤细胞并具有良好生物相容性的转运载体，使saRNA安全、高效地穿过肿瘤细胞的细胞膜和细胞核。

主权项：1.一种激活PTPRO基因表达的saRNA，其特征在于，所述saRNA为与PTPRO基因启动子区-220位点至-238位点区域或者-658位点至-676位点区域互补的序列，所述saRNA由序列如SEQIDNO:2所示的正义链和序列如SEQIDNO:3所示的反义链组成，或者由序列如SEQIDNO:8所示的正义链和序列如SEQIDNO:9所示的反义链组成。

全文数据：一种激活PTPRO基因表达的saRNA及其转运载体技术领域[0001]本发明涉及一种saRNA，具体涉及一种激活PTPRO基因表达的saRNA。背景技术[0002]癌症是人类健康的主要杀手，化疗和靶向药物作为肿瘤治疗的重要手段，在临床上发挥着不可替代的作用。而化疗和靶向药物耐药现象的出现却使对肿瘤的治疗效果大打折扣，导致癌症复发、转移，是肿瘤致死的最主要原因。[0003]过去30年中肿瘤的基础研究取得了长足的进步，特别是从分子水平来认识恶性肿瘤的发生发展，为肿瘤的预防和治疗创造了条件。各种新的诊疗方法和药物层出不穷，但是恶性肿瘤的治疗效果并未取得同步提高。大多数恶性肿瘤，特别是进展期恶性肿瘤，其预后没有得到实质性改善。长期以来，组织病理学诊断是肿瘤诊断的“金标准”和临床治疗的基础，但组织学分类、TNM分期分期都相同的肿瘤如采取相同的治疗方案，患者对治疗的反应和预后并不一致。事实上肿瘤是一种分子水平上高度异质性的疾病，组织学形同的肿瘤，其分子遗传学改变不尽一致，从而导致肿瘤治疗反应和预后并不一致，从而导致肿瘤治疗反应和预后的差别。传统病理形态学诊断已经不适应现在肿瘤的治疗。近年来，人们迫切希望找到新的肿瘤分型方案，针对每种分子类型的肿瘤采用个体化治疗，提高治疗效果，治疗肿瘤。[0004]肿瘤分子分类molecularclassification这个名词最早出现于美国国立癌症研究所NCI，于1999年1月公布的一份研究项目建议书。通过综合的分子分析技术为肿瘤分类提供更多的信息，从而使肿瘤分类的基础从形态学转向以分子特征为基础的新的分型体系。此后基于表达差异的不同肿瘤分类研究所得到广泛开展。[0005]肿瘤分子分型的基础，目前可以在DNA、RNA和蛋白水平上进行肿瘤分子分型的研究。在DNA水平上，可以根据基因突变，基因组的细胞遗传学改变或甲基化差异进行分型。根据基因表达谱RNA水平）的差异实施分型。在蛋白质水平，可以根据蛋白质表达谱的差异，亚细胞结构蛋白组成的不同或蛋白质翻译后修饰的改变来进行分型。[0006]肿瘤分子分型的研究方法，主要有：（1基因表达谱芯片技术：它可以同时观察成千上万个基因在不同个体，不同组织，不同发育阶段的表达情况。（2比较基因组杂交CGH技术:是在染色体荧光原位杂交基础上发展起来的一种新的分子细胞遗传学研究技术3蛋白芯片技术:基因突变和基因表达差异不一定导致相应的蛋白表达，而且蛋白质还存在磷酸化，乙酰化等复杂的翻译后修饰过程，这些改变在转录水平是无法检测的。该技术为肿瘤分子分型以及治疗标志物的筛选带来巨大的便利与可能。[0007]肿瘤分子分型的临床应用，现阶段主要是先进行高通量筛选，鉴定出少数标记蛋白，然后应用于临床分型，目前应用于临床的分子分型标记物有ERBB2，EGFR，C-met等。以特异的分子靶标设计干预的药物，从而阻断相关信号通路达到治疗的目的。靶向药物大致有四大类：（1特异性抗体⑵小分子化合物⑶抗血管生成药物。靶向药物可以单独应用或与其他治疗方法联合应用。这些药物虽然对特定分子类型的肿瘤有良好的治疗效果，但总的有效率50%。其中一个非常重要的原因是针对某一个单一靶点往往不足以遏制肿瘤的进展，特别是对于复发、多药耐药的癌症患者，临床上只能采取联合不同作用途径和机制的药物多靶点阻断信号传导、抑制肿瘤生长，这无疑给病人带来极大的痛苦和沉重的经济负担。因此，人们又想到从相反的角度治疗耐药，通过特异性的靶向肿瘤细胞的药物敏感基因，提高药物敏感基因的表达，进而提高药物敏感性，逆转耐药，达到杀死肿瘤细胞的目的。这正是本专利的独特之处。我们通过saRNA技术提高药物敏感基因PTPRO的表达，克服耐药，达到治疗肿瘤的目的。目前，临床上这一技术还是空白，我们的技术正是弥补了这一空白。[0008]受体型蛋白酪氨酸磷酸酶0PTPRO是PTPs家族的成员之一，在一项筛选肾小球足细胞特异性蛋白的研究中首次被发现并克隆出来，因此也称作GLEPP1。PTPRO在人类、大鼠、小鼠等各物种间具有高度保守性。在人类基因组中，PTPRO基因位于染色体12p13.3-p13.2，包含6个已知的mRNA变构体，其中2个主要的表达产物分别由全长PTPROPTPRO-FLcDNA和截短型PTPROPTPROtcDNA编码。在肿瘤研究中，PTPRO基因的表达水平与肿瘤的发生发展密切相关，现已发现，PTPRO在多种癌中有重要的抑癌作用，如：乳腺癌，前列腺癌，食管癌，结肠癌，肝癌，肺癌等。该基因通过去磷酸化作用来调控促癌基因的活性，使这些促癌基因活性下调，从而影响其下游信号通路，对肿瘤的发生发展起到抑制作用。在体内如何安全高效激活该基因的表达对肿瘤的治疗具有重大意义。[0009]目前现有的研究较为广泛的RNA干扰技术SiRNA主要是通过体外化学合成RNA片段并引入细胞，而后结合相应的信使RNA序列，实现其干扰功能，并对肿瘤进行基因层面的干预。该技术存在易降解，不能稳定有效地将siRNA引入细胞的缺点。RNA干扰技术在应用方面存在最大的障碍就是其作用机制为转录后调控机制，作用时间不稳定。如何开发出作用稳定，安全高效的针对肿瘤细胞进行基因层面干预的方式成为肿瘤基因疗法的重大课题。[0010]近年的研究发现非编码RNAncRNA分子能在多个水平参与基因表达的调控机制，其中小分子双链RNAdsRNA对相关蛋白表达的特异性抑制作用已经进行了广泛而深入的研究。最新研究发现dsRNA能特异地将某些沉默或低表达的基因激活的现象，并称之为“RNA激活RNAactivation，RNAa”，将具有激活功能的小dsRNA称之为小激活RNAsaRNA。[0011]有别于传统的RNA调控方式，RNAa调控中既存在dsRNA与靶基因间的空间偶合作用，又具有RNA干扰RNAinterference，RNAi样的序列互补依赖性，在保持较高特异性的前提下，能够人为地选择多个靶位点实现目的基因激活。RNAa靶向于基因启动子的非CpG岛及Alu区，并受组蛋白H3的甲基化及乙酰化状态影响，和RNAi的沉默效果相比，RNAa的激活作用更为持久，与此同时操纵RNA而非DNA的另外一个优势在于细胞蓝图不会改变，因为操纵DNA时一旦使其细胞蓝图改变，就可能会对细胞产生不可预知的永久性变化。终上所述，RNAa的激活为肿瘤、代谢及遗传性疾病的治疗提供了一个新的方法，具有广阔的前景。[0012]现有技术：[0013]1、使用某一个单一靶点的抗体药物遏制肿瘤的进展。[0014]2、RNA干扰技术siRNA:主要是通过体外化学合成RNA片段并引入细胞，而后结合相应的信使RNA序列，实现其干扰功能，并对肿瘤进行基因层面的干预。[0015]现有技术的缺点：[0016]1、针对某一个单一靶点往往不足以遏制肿瘤的进展，特别是对于复发、多药耐药的癌症患者，临床上只能采取联合不同作用途径和机制的药物多靶点阻断信号传导、抑制肿瘤生长，这无疑给病人带来极大的痛苦和沉重的经济负担。[0017]2、SiPTPRO技术存在易降解，不能稳定有效地将SiRNA引入细胞的缺点。RNA干扰技术在应用方面存在最大的障碍就是其作用机制为转录后调控机制，作用时间不稳定。[0018]3、靶向药物容易产生脱靶，临床上产生严重的副作用。发明内容[0019]本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种saRNA，所述saRNA能够激活PTPRO基因的表达，通过提高药物敏感基因PTPRO基因的表达或活性，进而提高药物敏感性，抑制肿瘤细胞生长，达到杀死肿瘤细胞的目的，从而治疗肿瘤;本发明还提供了一种装载该saRNA的转运载体，并运用修饰剂在该转运载体表面进行功能化修饰，构造能识别肿瘤细胞并具有良好生物相容性的转运载体，使saRNA安全，高效地穿过肿瘤细胞的细胞膜和细胞核，该载体在体内提高saRNA的激活效果的同时，又可实现与其他药物的协同作用，从而产生更强的细胞毒性。运用saRNA作用于肿瘤区别于目前的SiRNA，特别是可以激活药物敏感基因，且本发明运用纳米颗粒作为转运载体获得的效果明显优于运用商业化脂质体作为转运载体。[0020]本发明提供了一种装载saRNA的纳米颗粒，可以特异性的识别肿瘤细胞，通过saRNA技术提到目的药物敏感基因的表达，具有高特异性，高效性，高稳定性等特点，并对正常细胞无毒副作用。目前国内外尚未有关saRNA结合纳米技术治疗肿瘤耐药的报道。因此，运用saRNA并结合纳米技术制备癌症基因治疗药物特别是RNA治疗药物）的应用具有非常广阔的市场前景。为肿瘤的基因治疗提供新方法和新的分子靶点。[0021]为实现上述目的，所采取的技术方案：一种激活PTPRO基因表达的saRNA，所述saRNA包括与PTPRO基因启动子区-3000位点至-200位点区域互补的序列。[0022]优选地，所述saRNA包括与PTPRO基因启动子区-1044位点至-220位点区域互补的序列。[0023]优选地，所述saRNA包括与PTPRO基因启动子区-220位点至-238位点区域或者-658位点至-676位点区域互补的序列。[0024]优选地，所述saRNA由序列如SEQIDN0:2所示的正义链和序列如SEQIDN0:3所示的反义链组成，或者由序列如SEQIDN0:8所示的正义链和序列如SEQIDN0:9所示的反义链组成。[0025]本发明提供了一种装载有上述所述的saRNA的转运载体。[0026]优选地，所述转运载体为纳米颗粒。更优选地，所述转运载体为介孔二氧化硅MSNs纳米颗粒。[0027]优选地，所述转运载体为具有识别肿瘤细胞功能的转运载体。[0028]本发明提供了一种激活PTPRO基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的saRNA或上述所述的转运载体。[0029]本发明提供了PTPRO在制备提高癌细胞对药物的敏感性、抑制癌细胞对药物产生耐药的药物中的用途。[0030]本发明提供了PTPRO在制备抑制癌细胞的克隆形成能力、增殖能力的药物中的用途。[0031]介孔二氧化硅MSNs纳米无机材料具有规整的孔道结构.较高的比表面积.易于表面功能化修饰和良好的生物相容性等一系列优点，作为化疗药物、基因药物、小分子荧光探针等的载体已被广泛应用。通过表面的功能化修饰从而实现客体分子的控制释放，比如对PH、酶、温度、光等肿瘤微环境敏感的控制释放。同时结合肿瘤细胞表面富含的受体、抗原等将相应的配体、抗体或特定的基因片段修饰，在介孔二氧化硅纳米粒的表面赋予介孔二氧化硅纳米载体靶向递送被动靶向和主动靶向）的特点。本发明运用聚乙酰亚胺PEI以及单抗曲妥珠单抗进行纳米颗粒表面的功能化修饰，其中，聚乙酰亚胺PEI是目前最高效的基因传递载体，携带高密度的正电荷，有较强的细胞黏附能力。进入细胞后的PEI能够通过质子海绵效应引发溶酶体破裂，释放药物。高分子量的PEI25kD转染效率高，但细胞毒性大。但与其它载体材料联用，可降低其细胞毒性。此外，PEI25kD，呈分枝状结构，分子内有大量高反应活性伯氨，可与富含羧基的靶向分子相偶联。赋予纳米粒靶向性。此外，曲妥珠单抗偶联在纳米粒表面后，纳米粒既可将药物带到HER2过表达的肿瘤细胞上，又可实现与其他药物的协同作用，从而产生更强的细胞毒性。曲妥珠单抗修饰的纳米粒对治疗HER2过表达的实体瘤具有潜在的应用价值。[0032]本发明针对目前治疗肿瘤的药物主要以促癌基因为靶点，治疗肿瘤，极易产生耐药。本发明靶向药物敏感基因PTPR0,通过saRNA分子，提高其表达，可抑制多种促癌基因ERBB2，ERBB3，EGFR，c-met，SRC等的活性，进而抑制其下游通路，达到抑制肿瘤生长，逆转耐药的目的。[0033]本发明针对目前靶向药物靶向性不强，容易产生副作用等临床问题，本发明提供了一种安全，高效，祀向性更强的纳米载体，MSN_saRNA_PEI_Herceptin介孔二氧化娃纳米颗粒，可明显抑制肿瘤细胞的生长，提高治疗效果。[0034]本发明的有益效果在于：[0035]1、本发明提供一种治疗肿瘤的药物靶点，通过激活PTPRO基因的表达治疗肿瘤。所述PTPRO基因在体内持续活化，可作用于c-MET、EGFR、HER2、HER3、SRC等癌基因，使其蛋白去磷酸化，失去活性，进而抑制其下游PI3KAKT及RasMAPK、S0X2等信号通路，抑制肿瘤生长，逆转耐药，达到治疗肿瘤的目的。[0036]2、本发明提供一种能高效激活PTPRO的saRNA序列，运用该序列在体内持续活化PTPRO基因。所述该saRNA序列，通过小RNA激活原理设计规则设计获得，并获得激活效果最佳的序列。其中本发明设计的具有明显激活PTPRO基因表达的saRNA来源于PTPRO基因启动子区-220位点至-238位点和-658位点至-676位点，经检测PTPRO基因启动子区-220位点至-238位点为最佳激活区域。[0037]3、本发明提供一种输送saRNA的转运载体，优选采用纳米颗粒作为转运载体，并运用赫赛汀单抗进行功能化修饰，构造能识别肿瘤细胞并具有良好生物相容性的纳米颗粒，在体内提高saRNA的激活效果，同时，又可实现与其他药物的协同作用，从而产生更强的细胞毒性，是一个安全、高效的saRNA输送载体。在体外细胞实验中，运用成功修饰转载saRNA的载体不仅提高生物相容性，即高浓度纳米颗粒下的细胞毒性很低;而且很大程度上提高了saRNA的激活效果，该方式激活效果明显强过商业化脂质体。进一步的体外实验证明，该纳米颗粒在生理环境下保持较好的单分散性，在体内进入肿瘤细胞中获得更高效的saRNA激活效果。附图说明[0038]图1为本发明实施例1中westernblot方法检测PTPRO基因在非耐药细胞株和耐药细胞株中的表达结果；[0039]图2为本发明实施例2中5对saRNA激活PTPRO基因表达的效果对比图；[0040]图3为本发明实施例2中MSN_saRNA_PEI_Herceptin介孔二氧化硅纳米颗粒的投射电镜扫描图；[0041]图4为本发明实施例2中有无修饰的情况下纳米颗粒的粒径分布图；[0042]图5为本发明实施例2中不同载体装载saRNA后激活效果的比较结果；[0043]图6为本发明实施例3中MTT实验结果；[0044]图7为本发明实施例4中克隆形成实验结果；[0045]图8为本发明实施例5中MTT实验结果；[0046]图9为本发明实施例6中平板克隆实验结果。具体实施方式[0047]为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。[0048]在本发明中，除特别定义外，浓度单位均为每升溶液的摩尔浓度。本领域技术人员进一步知悉，本发明下述实施例中的各个浓度，摩尔分数，质量分数均可以根据实际进行调整。本领域技术人员可以实现上述调整。在本发明中，所有试剂均可以从SIGM购得。[0049]实施例1:免疫印迹分析耐药株与亲本株中PTPRO基因蛋白的表达水平[0050]采用PBS缓冲液清洗细胞，RIPA蛋白裂解液冰上裂解数分钟后，12000rpmmin离心15min，收集上清，BCA法检测蛋白浓度。12.5%SDS-PAG凝胶电泳约2h后将蛋白转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭，加PTPRO单克隆抗体（1:500稀释Sigamg公司）4°C孵育过夜。荧光二抗1:2000稀释，常温下孵育2h。化学发光，显影，定影，得到目的蛋白条带结果，用流水冲洗晾干，扫描备用。结果如图1所示，PTPRO在耐药细株SKBR3-pool2、BT474-HR20中低表达，提示PTPRO表达水平与耐药相关。[0051]实施例2[0052]针对PTPRO基因的saRNA分子的设计以及激活效果的比较。[0053]一、saRNA的设计[0054]在网站NCBIhttp:www.ncbi.nlm.nih.gov获得PTPRO启动子区序列。[0055]根据按照RNAa序列的设计原则，设计获得PTPRO的5对双链小RNA激活序列以及该5对序列对应PTPRO启动区位点。PTPRO启动子区位点-3000位点至-1位点的序列（SEQIDNO:1如下所示：[0056]TGATTTGGAGTCTTGAAAATAGCATAATAAGATTTATCATACTTTGGAAGTATTGTATTGAAAAACCAGTCAATAGCTCAAAGAAACACAAAACATGCTCTATGAATTGAAAACCCCACACTGTGGATGACACAGCATTCACATTCTTTATGAGAATCTCTTCTAGGACACTGTTATGGTTTAAGTGCAATAAAAACAAATGAAAGTATTTTATCCAGCAATAGCAATGTAAAATACTTTTCTCTAGAGAGGAAATTTTCTGTGATTATAAAATAATACTTTCAGTCTTCAGCCCATCTAACCACAATGTTACTAATAAAATAACAACAATGCCAATTACTAATGCTTTACTACTTACTGTTTACTGTTATTGTTCCTCCAAAGTGGTCCACATAATATATATATATATATATATATATATACATATATATATATATGCACAAAGACAGAAAGAGCTGAACAAATTGTGATGTATGACTAAGAGAAAAACAGAAAGACGCAGCAGAATATGATTATTTAAAAGGGAGCCTCATTGTGAAAGTTCTTTTAGCATTTACAAGATTAATTTATGATCAGAACTGCTTTAAACGCCCTACGCACATCAGGCAAGGCTATATCCATGTATACACACAGACATATGCATACACACAAATGAATATCATCATACAGACCCATAATTCACAGACACATTTTAAAATTAAATGCTACTCCAAAGAGAAATTGTTGGCATCCTGTGAGTGTGATTGTTGCCCTTGGCCTATATATATCTTATGTTCTAGAGATTAGATCACTTTACAGCCACTTCTGAGGGCGAGTGGGAATAAAATGCTGCTTCAGGAGCGTCAAAATAAAAAGAAAACATATTAAACCAAAGTTCCTATAAGTGCAATCCCAAGGATTAAATGTTCAGATAGCCCGTAAGTCTAACCCAGAGGGAGGGAGGAGCAGTTAACATTTTCTCAAAAGAAAGAAAATGTCCAAACCAATGATGAGTGGACATGAGGGACCTGAAGAGAGCATGTGATGGGAATGTGAAAACAAAAGAAGCTTCTAAAAGAAGACACCAAGGATAATATTCTCACAAAAATTCAGACCATCATTCTATATTTTCATGCATATGAATTTTGGTACATATTTCATGCATATGAAATTTGGTACATATATACATATATGTACCATGCATATACATATGCGTACATATACATATACGTATGCATACACATATGTATCTATGTACACACATACACATATGTGTACACACATATGTACATGCACACACATATGTGTACACATATGTACATGCACACACATGTGTGTACACATATGTACATGTACACATATGTGTACATGTACACATGTGTATATATACATATTCACACTTATGTAAACATATTCAATCTAAAGCTTCCTTAAGACACATACAAACAACAACCAAATGATTAGTGTTTGGCCATTGCTCATGCAGCAAAAGCTGAGTAAACACAGCTCTGGATCCTTTTCTCAGGCCACCACTCCCTAGCTGTGTGACTGACAAAGTCTATGCCTGAACACCTACATTCATGACCAGGGTGGCCTTTCCTGTCTCCTGTTGCCCAAGCATGTCTCAGGTATAAATAAGTTCCAATACTGACAGGGCACAGCAAGGGTAATTTACATGACAATAAGAAATGATTTCTATCTGAACAGTGCATACCAGAGTTGATTTCGACAGACTTATCTTTAAAAAAATACACATAACAAAAAAGGAGACAAGTAGTAGATTGGGGACCCACAGCTTGAAAGTCGTTGCTTGTGATTCTAAAACATCCCAGTAAAATTATTCACAGATAATTGTTTAAAAATATAACTGTACATACCGTTGACACTTGGACAACACAGAGAATCACGTAGTTGAAAATCCACATATAACTTTGAACTCATCAAAACCTTAACTACTAATAGCCTACTCTTGACCGGAAACCTTACTGATAACATAATAAACAGTTGATTAACACACATTTTGTGTTGTATGTATTGTATACTGTATTCTTACAATAAAGTACGCTAGAGAACAGAAAATATTATTAAGAAAACCATAAAGAGGAGAAAATACATTTATATTCATTGAGTGGAAGTGAATTATCATAAAAGTCTTTAACGTCATCCTTTTCAGGCTGAGCAGGCAGAGGAGGAGGAAGAGGGTTTGGTCTTGCTGTCTCAAGGCTGGCAAAGGTGGAAGAAAATCTGCATATAACTGGACCCAACAGTTCAAACCCGTGTTGTTCAAGGGTCATACATGTAAAATACTGTGATTTTTCCCCCTTCTATATTCAGCTTCAGGTGACCCGACACACTTTGGTATCAAAAGAGAATCTGAAATGTACAAGAACTGCGGATTTCAAATGGAAAAGGTGCATAATTGTGCTATTTGTTCCTGGGTGAGTGTGGGACGGAGACGGTGAGAGTGTTGAAATGGGATGGAGATAATGGAAGCAGTGGGGAAGGAGAGAAAATACCCTTCCTATCACACACACTCACACACTCACACTACACACTATTTCTACAGTCACAACTACCCAACTGTTATTGATCCTTTATAACTGCAATTGAGTACAGATGTAGGAAGATTGAGAGGGAACTGGGATCTGGCGCCTGGATTGCTCAAGAGAGGTCAGGGAAACCCCTCAGAACTCCTGAGACCCAGAGATTGAGGGAGGGGTTGAGGCGGAGTCTGCAATGGGGGCTGTCCAGCAGTAGCAAGCAGCGGGCCGATCCTGGTGGAGGGTTGGGAGGCTGCTGTCATTTTATGGGTCGGCAGCCAGAGTGAGAGTGTCCCTGCTGCCAGAGGACTACGGCGGGCTGGGCGCGGGGTCCCCGCCTCTCGCTCACCACACAGACCCCGCGCCTCCTCTGGCAGCCGCGGTGGTGGCGGCGGCAGAGCCTCGCCCACTCCAATCCCCACCCTCTCCATCCTTAGTCATTAAAGAACAGCAGCGCCTGGCACGTTCTTGGAGGACCCCG。[0057]saPTPR0-220：[0058]正义链：5’-GGUUGGGAGGCUGCUGUCA[dT][dT]-3’（SEQIDNO:2[0059]反义链：5’-UGACAGCAGCCUCCCAACC[dT][dT]-3’（SEQIDNO:3[0060]PTPRO启动子区-220位点至-238位点）。[0061]saPTPRO-398：[0062]正义链：5’-AUUGAGUACAGAUGUAGGA[dT][dT]-3’（SEQIDNO:4[0063]反义链：5’-UCCUACAUCUCUACUCAAU[dT][dT]-3’（SEQIDNO:5[0064]PTPRO启动子区-398位点至-416位点）。[0065]saPTPR0-550：[0066]正义链：5’-AGACGGUGAGAGUGUUGAA[dT][dT]-3’（SEQIDNO:6[0067]反义链：5’-UUCAACACUCUCACCGUCU[dT][dT]-3’（SEQIDNO:7[0068]PTPRO启动子区-550位点至-568位点）。[0069]saPTPRO-658：[0070]正义链：5’-CCGACACACUUUGGUAUCA[dT][dT]-3’（SEQIDNO:8[0071]反义链：5’-UGAUACCAAAGUGUGUCGG[dT][dT]-3’（SEQIDNO:9[0072]PTPRO启动子区-658位点至-676位点）。[0073]saPTPRO-1026：[0074]正义链：5’-AAACCUUACUGAUAACAUA[dT][dT]-3’（SEQIDNO:10[0075]反义链：5’-UAUGUUAUCAGUAAGGUUU[dT][dT]-3’（SEQIDNO:11[0076]PTPRO启动子区-1026位点至-1044位点）。[0077]二，上述saRNA对PTPRO表达的影响[0078]乳腺癌细胞系SKBR3培养于含有10%胚牛血清的DMEMF12完全培养基中，置于37°C、5%⑶2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞按2XIO5个ml接种于6孔培养板培养过夜。次日以上saRNAs和dscontrol以50nM的终浓度，转染细胞，转染5天后收获细胞，TRIzo1试剂提取细胞总RNA，并反转录为cDNA荧光定量PCR法分析靶基因的PTPROmRNA的差异表达。荧光定量PCR所使用的引物见下表：[0079]表1荧光定量PCR所使用的引物[0080][0081][0082]结果如图2所示，saPTPR0-220，saPTPRO-658激活效果明显优于其他3对，且saPTPR0-220效果最优，其他三对saPTPRO-398，saPTPR0-550，saPTPRO-1026效果不明显。[0083]三、装载saRNA纳米颗粒的制备[0084]本发明选取了一种单分散介孔氧化娃纳米颗粒（mesoporoussilicananoparticles，MSNs进行saRNA的装载。选取的MSNs粒径为90纳米左右，介孔孔径为4纳米。[0085]MSN_saRNA_PEI的制备过程：[0086]1、先将3-8mgml的MSNs溶液溶剂为50%乙醇，以下步骤所用均为50%乙醇，且用DEPC水进行稀释配得）150-300μ1加入1.5ml离心管中，100-200w条件下超声振荡l-3min后使颗粒在溶液中均匀分散。[0087]2、向步骤⑴所得溶液中加入20-50μΜ的saRNADEPC水溶液15-30μ1，并混合均匀。将混合物室温静止l_3h。离心3-5min将吸附saRNA的MSNs从溶液中分离。[0088]3、将分离后得到的纳米颗粒用100_300μ1乙醇洗涤一次，再加入100-300μ1乙醇，100-200«超声振荡l-3min使纳米颗粒均匀分散。[0089]4、向其中加入浓度为4M的GHCL的乙醇溶液20-35μ1，室温条件下磁力搅拌器混合反应25-45min。[0090]5、向其中加入浓度为4-8mgml的PEI的DMSO溶液20-45μ1，室温条件下磁力搅拌器混合反应30-35min。[0091]6、离心将纳米颗粒分离，加入150-350ylDEPC水，100-300w超声振荡5-10min除去未与纳米集合的PEI，离心后加入ΙΟΟμΙ乙醇。[0092]7、向其中加入浓度为0.2mgmlDSP的乙醇溶液25-30μ1，重复4,5两个步骤。[0093]8、离心移除乙醇，加入DEPC水100-300yl，100w超声5-8min中获得均匀的MSN_saRNA_PEI介孔二氧化娃纳米颗粒。[0094]9、向上述纳米颗粒悬浮液中加入21mgml曲妥珠单抗10_25μ1，作为表面抗体修饰，识别Her2阳性乳腺癌细胞，反应2-4h后，离心除去上清乙醇，加入100-300ylDEPC水，获得浓度为3.5-6.5mgml的MSN_saRNA_PEI_Herceptin介孔二氧化娃纳米颗粒。[0095]10、将上述步骤⑶制得的MSN_saRNA_PEI_Herceptin介孔二氧化娃纳米颗粒的乙醇溶液，同时再加入〇.〇75mlTEOS，室温继续搅拌4小时。12000rmp下离心15-20min，用水和乙醇洗涤多次离心，再将其分散到乙醇的酸溶液中回流24小时以除去未反应的原料，再次离心，用水和乙醇洗涤，冷冻干燥得到MSN_saRNA_PEI_Herceptin介孔二氧化娃纳米颗粒，将样品进行投射电镜扫描，结果如图3所示，投射电镜图显示有无修饰的情况下纳米颗粒的形态对比，左图为没有修饰的情况，右图为有修饰情况下的纳米形态，可见两者形态差异明显。进行粒径测试，结果如图4所示，左图为没有修饰的情况，右图为有修饰情况下的纳米颗粒大小，对比可见表面修饰后，纳米颗粒的粒径变大，修饰后的平均粒径为150nm，明显大于未修饰的纳米颗粒粒径平均粒径为IOOnm。[0096]以上制备的MSN_saRNA_PEI_Herceptin介孔二氧化娃纳米颗粒，为安全，高效的saRNA转运载体。本领域的技术人员在本领域中可以得出结论，本发明的转运载体和方法可应用的已知的任何方法使saRNA穿过细胞膜和细胞核，将是有益于本发明。这些方法包括，但不限于，任何方式，如转染，例如，采用DEAE-葡萄糖，磷酸钙，阳离子脂质脂质体，胶束，操纵压力，显微注射，电穿孔，免疫穿孔，或使用载体，如外泌体、病毒、质粒，耦合特定共辄物或配体，如抗体、抗原、受体，被动引入saRNA，促进其吸收。[0097]本实验使用纳米载体偶联单抗药物赫赛汀，本领域的技术人员在本领域中可以得出结论，可以通过偶联其他抗体药物，革G向不同分子分型的肿瘤。如c-met、EGFR、ERBB3过表达的肿瘤，达到治疗不同分子分型的肿瘤的目的。[0098]四、不同载体装载saRNA分子，激活效果的比较[0099]如图5所示，1为对照组；2为本发明纳米颗粒包被saPTPR0-220组；3为脂质体3000包被saPTPR0-220组。本发明装载PTPROsaRNA的量为200nM，与载带等量PTPROsaRNA的商业脂质体LipofectamineTM3000相比，该纳米体系的PTPROsaRNA激活效果更好。[0100]实施例3:细胞实验验证PTPRO基因可提高药物敏感性。[0101]如图6所示，HER2阳性乳腺癌细胞株经曲妥珠单抗处理和对应的运用本发明来提高乳腺癌细胞的药物敏感性，检测处理后细胞的活性实验MTT实验），MTT实验证明PTPRO与赫赛汀药物敏感性有关，结果显示过表达PTPRO基因后，癌症细胞对药物敏感性增加，细胞增殖活力减弱。[0102]实施步骤:将乳腺癌细胞系SKBR3接种于6孔板，用lipotectamine3000为转染剂以saPTPR0-220终浓度为50nmo1L进行转染，进行过表达处理，对照组未处理。次日，实验组与对照组分别按3XIO4个ml接种于96孔培养板中，每孔200yL。加入不同浓度的曲妥珠单抗浓度梯度〇.〇3，1.0，1.5,2.0,2.5μΜ处理，37°C培养48h。加入5mgmL的MTT溶液20yL孔，继续培养4h后，加入150yLDMSO，微量振荡仪振荡IOmin，立即用酶标仪在490nm波长处测吸光度0D值）。根据吸光度计算细胞生长抑制率[细胞生长抑制率=对照组OD-实验组0D对照组ODX100%]，并用Logit法计算IC50值，该实验每天进行一次共需6天，且每次实验重复3次，取平均值。以曲妥珠单抗浓度为横轴，细胞存活率值为纵轴绘制细胞增殖抑制量效关系图。结果如图6所示，可见运用本发明处理过的乳腺癌细胞增殖被抑制，细胞活性不如对照组。结果具有明显统计学差异，（*P〈〇.05，#p〈0.01，*#p〈0.001，说明PTPRO基因对肿瘤细胞生长有良好的抑制效果，且能够提高肿瘤细胞的药物敏感性。[0103]实施例4[0104]如图7所示，曲妥珠单抗分别作用于实施例3中乳腺癌细胞系SKBR3的PTPRO过表达组与对照组，进行克隆形成能力的检测即克隆形成实验。克隆形成实验证明PTPRO与赫赛汀药物敏感性有关，结果显示过表达PTPRO基因后，癌症对药物敏感性增加，克隆形成能力降低。[0105]实施步骤：[0106]上述乳腺癌细胞系SKBR3的PTPRO过表达组与对照组，各组分别用ΙΟΟμΜ曲妥珠单抗和PBS处理，进行克隆形成能力的检测即克隆形成实验。取对数期生长的细胞每平板种500〜1000个细胞，培养2〜3周后，用结晶紫进行染色，计数并计算克隆形成率克隆形成率=克隆数接种数*100%，结果如图7所示。同样通过克隆形成能力来证明PTPRO可以抑制肿瘤细胞的克隆形成能力，且能够提高肿瘤细胞的药物敏感性。[0107]实施例5:细胞实验验证逆转耐药效果[0108]如图8所示，乳腺癌耐药细胞株经本发明处理后，检测处理后细胞的活性实验ΜΤΤ实验）JTT实验结果显示，通过SaRNA分子提高PTPRO基因的表达后，耐药细胞株（SKBR3-P00L2的增殖活力降低，说明PTPRO提高了药物敏感性，使耐药株细胞的存活减弱，治疗肿瘤耐药。[0109]实施步骤：[0110]乳腺癌耐药细胞株SKBR3-Pool2按不同处理分三组:①dscontrol处理②saPTPRO-220处理③saPTPR0-658处理，取对数生长期乳腺癌耐药细胞，按2XIO5个ml接种于96孔培养板中，每孔200yL。三个处理组分别加入浓度lOOygml曲妥珠单抗处理，另设背景对照，每组设5个平行孔，37°C培养48h。加入5mgmL的MTT溶液20yL孔，继续培养4h后，加入150yLDMSO，微量振荡仪振荡IOmin，立即用酶标仪在490nm波长处测吸光度0D值）。根据吸光度计算细胞生长抑制率[细胞生长抑制率=对照组OD-实验组OD对照组ODX100%]，并用Logit法计算IC50值，该实验每天进行一次共需6天，且每次实验重复3次，取平均值。可见运用本发明处理过的肿瘤细胞增殖被抑制，细胞活性不如对照组。且saPTPR0-220处理组细胞活性不如saPTPRO-658处理组。结果具有明显统计学差异，如附图8所示（*p〈0.05，**p〈0.01，***p〈0.001。说明本发明能够更好的抑制耐药细胞的生长，达到治疗肿瘤的目的。[0111]实施例6:验证saPTPR0-220加载体逆转耐药的效果。[0Ί12]如图9所不，平板克隆实验结果显不，通过saRNA分子提尚PTPRO基因的表达后，两株耐药细胞株BT474-HR20，SKBR3-P〇〇12的克隆形成能力降低，说明PTPRO提高了药物敏感性，使耐药株细胞的存活减弱，治疗肿瘤耐药。[0113]实施步骤:将两组HER2阳性乳腺癌耐药细胞株SKBR3-P〇〇12，BT474-HR20按不同处理分三组:①单独saPTPR0-220转染处理，②MSN_NC_PEI_Herceptin介孔二氧化硅纳米颗粒处理，③MSN_saRNA_PEI_Herceptin介孔二氧化硅纳米颗粒处理，随后检测不同组细胞的克隆形成能力。取对数期生长的细胞每平板种500〜1000个细胞，培养2〜3周后，用结晶紫进行染色，计数并计算克隆形成率（克隆形成率=克隆数接种数*100%。结果显示，MSN_saRNA_PEI_Herceptin介孔二氧化娃纳米颗粒处理组的细胞克隆形成能力明显低于其他两组。说明本发明可以有效的抑制肿瘤耐药细胞的生长，达到治疗肿瘤的目的。[0114]最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

权利要求：1.一种激活PTPRO基因表达的saRNA，其特征在于，所述saRNA包括与PTPRO基因启动子区-3000位点至-200位点区域互补的序列。2.根据权利要求1所述的saRNA，其特征在于，所述saRNA包括与PTPRO基因启动子区-1044位点至-220位点区域互补的序列。3.根据权利要求1所述的saRNA，其特征在于，所述saRNA包括与PTPRO基因启动子区-220位点至-238位点区域或者-658位点至-676位点区域互补的序列。4.根据权利要求1所述的saRNA，其特征在于，所述saRNA由序列如SEQIDNO:2所示的正义链和序列如SEQIDN0:3所示的反义链组成，或者由序列如SEQIDN0:8所示的正义链和序列如SEQIDNO:9所示的反义链组成。5.—种装载有如权利要求1-4任一所述的saRNA的转运载体。6.根据权利要求5所述的转运载体，其特征在于，所述转运载体为纳米颗粒。7.根据权利要求6所述的转运载体，其特征在于，所述转运载体为具有识别肿瘤细胞功能的转运载体。8.—种激活PTPRO基因表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-4任一所述的saRNA或如权利要去5-7任一所述的转运载体。9.PTPRO在制备提高癌细胞对药物的敏感性、抑制癌细胞对药物产生耐药的药物中的用途。10.PTPR0在制备抑制癌细胞的克隆形成能力、增殖能力的药物中的用途。

百度查询： 张灏 一种激活PTPRO基因表达的saRNA及其转运载体

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