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申请/专利权人：山东师范大学

摘要：本发明属于植物细胞工程领域，具体涉及一种以植物幼嫩完整叶为材料快速提取表皮细胞原生质体的方法。该方法通过以下步骤实现：将种子培养至第一片真叶3‑5mm长时，取出第一片真叶，使用玻璃针进行切割，将切割后的叶片进行酶解；酶解结束后，由水平方向向竖直方向甩；终止酶解反应，由水平方向向竖直方向甩，过滤后离心，将白色沉淀原生质体洗涤，离心；自然沉降后重悬即可。本发明首次利用完整叶片为材料提取原生质体，可以实现原生质体纯度大于95%，活率大于95%，用于研究表皮细胞分化具有重要意义，其次也可以用于亚细胞定位研究和原生质体转化等下游实验，如基因功能验证、亚细胞定位、细胞测序等。

主权项：1.一种以植物幼嫩完整叶为材料快速提取表皮细胞原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将消毒后的植物种子均匀的撒播在MS培养基上，让其生长在正常条件下，培养无菌苗；（2）播种后5-7天，待植物第一片真叶3-5mm长时，准备取材；（3）将植物放在解剖镜下用细头镊子取出第一片真叶，使用玻璃针对真叶进行切割，一片真叶切割2-3段，完全切割下来，每段1-2mm长，将切割后的叶片立即放入装有20ml的酶解液的离心管中，将酶解液避光；（4）富集200片叶片于酶解液中，放在70rpm摇床，28℃，避光，酶解4-5h；所述酶解液具体配方如下： ；（5）酶解结束后，由水平方向向竖直方向甩5-8下；（6）加入等量的washbuffer，终止酶解反应，由水平方向向竖直方向甩1-2下；（7）用40μm尼龙膜或滤网过滤，滤液放在50ml离心管中；所述尼龙膜或滤网提前放入4°C环境中，采用washbuffer提前润湿；所述washbuffer具体配方如下： （8）4°C，离心力200g，水平转子，离心5min；离心后，冰上小心吸出上清液，保留下部白色沉淀；（9）将白色沉淀原生质体用washbuffer洗涤，4°C，200g，水平转子，再次离心5min；（10）冰上，弃上清后，使原生质体在冰上自然沉降，吸走上清，保留原生质体，加重悬液1ml重悬，冰上，轻摇晃；（11）在显微镜下观察原生质体，其中红色或者无色的为表皮细胞，含有叶绿体的绿色细胞为叶肉细胞；所述植物为二色补血草。

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