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申请/专利权人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所;中蔬种业科技(北京)有限公司

摘要：本发明公开了基于KASP技术开发的用于检测菠菜RPF1基因型的引物及应用，所述引物的序列如SEQIDNO:1‑3所示。利用本发明提供的三条KASP引物进行菠菜RPF1基因型的检测，分析通量高，准确性高，适用于大量样本的检测。本发明提供的共显性分子标记应用于RPF1基因的转育，对于加快菠菜抗霜霉病品种的选育，提高育种效率具有重要实践意义。

主权项：1.基于KASP技术开发的用于检测菠菜RPF1基因型的引物，其特征在于，所述引物用于检测与菠菜抗霜霉病基因RPF1紧密连锁的SNP标记KM256436，该标记位于菠菜3号染色体上，物理位置697720bp，SNP位点处碱基为G或T，碱基为G的菠菜植株为霜霉病抗病型，碱基为T的菠菜植株为霜霉病感病型；所述引物为：正向引物F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCATTGACTGGATCAAAACTATTCACA-3’；正向引物F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATTGACTGGATCAAAACTATTCACC-3’；以及反向引物R：5’-GGTACTTTGTTTTTATAGATTTGTTTTTTCCTTTTA-3’。

全文数据：基于KASP技术开发的用于检测菠菜RPF1基因型的引物及应用技术领域[0001]本发明属于分子遗传育种技术领域，具体地说，涉及一种基于KASP技术开发的用于检测菠菜RPFl基因型的引物及应用。背景技术[0002]菠菜SpinaciaoleraceaL.，别名波斯草、赤根菜，系黎科菠菜属，一年生草本植物，二倍体2n=12，栽培历史悠久，起源中亚，大约在唐代之前或唐代初传入我国。菠菜抗寒性强，适应性广，生育期又短，易快种连收，产量高，供应期长，深受生产者和消费者欢迎。在我国南北各地普遍栽培，是秋、冬、春三季的主要绿叶蔬菜之一，也是我国主要出口蔬菜种类之一钱伟等，2014。[0003]霜霉病是菠菜生产过程中最主要的病害之一，近些年，霜霉病在我国山东、河南、河北、江苏、湖北等菠菜主产区大范围发生，不仅严重影响产量，而且在运输过程中叶片腐烂变质，严重影响菠菜品质，尤其是霜霉病的发生给种植者造成了重大的损失。菠菜霜霉病主要危害菠菜叶片，发病初期叶片产生深绿色小点，边缘不明显，而后形成褪绿色病斑，接着扩大成不规则淡黄色病斑，直径3-17_，后期湿度大时在叶背面形成灰紫色霉层，严重时霉层连成片。夜间有露水时易发病，病斑从植株下部向上不断延伸;低温高湿条件下发病最严重，干旱时叶片枯黄，湿度大时叶片腐烂，最终导致植株变黄枯死王慧君等，2014。[0004]迄今为止，共发现16个菠菜霜霉病生理小种。1824年Greville发现了第一个菠菜霜霉病生理小种Pfsl，经过100多年以后即1958年才发现了第二个菠菜霜霉病生理小种Pfs2，1977年发现了第3个生理小种Pfs3，1992年发现了第4个生理小种Pfs4，至此之后，随着菠菜育种不断发展，新的生理小种也在迅速增加，仅在过去的20年时间里就发现了12个霜霉病生理小种。目前，荷兰园艺检测总署、美国阿肯色大学及美国加利福尼亚大学共同合作对菠菜霜霉病进行鉴定研究，建立了一套菠菜霜霉病菌生理小种鉴别寄主。目前常用Viroflay、Resistoflay、Califlay、PoIka、CeIrmont、Campania、Dolphin、Lazio、Lion、Avenger、Piheon、Whale等12个菠菜品种对各生理小种进行致病性测验。CorrelI等2009研究表明，这套菠菜霜霉病菌生理小种鉴别寄主含有不同的抗性位点，采用人工温室接种鉴定的方法，可以对世界各地不同的菠菜霜霉病菌以及新的生理小种进行鉴定分析，对田间样品的混合生理小种也可鉴定分析。Yamauchi等2011从荷兰园艺检测总署引进该套鉴别寄主，利用人工温室接种鉴定方法对日本不同地区的4份霜霉病菌进行鉴定分析，结果表明一份病菌为Pfs6，三份病菌为Pfs8。美国阿肯色大学植物病理系利用该套鉴别寄主，对来自美国和欧洲的188多份菠菜霜霉病样品进行鉴定分析，发现这些病菌样品中大多数为单个生理小种，极少数样品为混合生理小种。钱伟2015等首次对我国菠菜霜霉病生理小种进行鉴定分析，北京地区主要为9号生理小种，山西地区主要为5号生理小种，山东地区主要为8号生理小种。[0005]尽管国外对菠菜生理小种研究取得很大进展，但是在菠菜对霜霉病抗性基因研究比较少。Correll等（2011认为在菠菜中可能存在6个抗霜霉病基因位点（ResistanceagainstPeronosporaFarinosa，RPF，即RPF1-RPF6,这些位点分别对不同的生理小种具有抗性。如，RPFl基因可以对Pfsl-7,9，11，13以及15具有抗性（Irishetal.2003;Irishetal.2008;Fengetal.2014CorrellJC?FengC?KudrnaDA?AmmirajuJ?ffingRA.2009.ConstructionofaspinachSpinacaeoleraceaBAClibrary.PlantandAnimalGenomesXVII，p.604.[0112]7、YamauchiN，HorinouchiH，SakaiK，YonemotoK，SatouM，ShirakawaT.2011.FirstreportofspinachdownymildewcausedbyracePfs:8ofPeronosporafarinosaf.sp.spinaciaeinJapan.JGenPlantPathol,77：260-262.[0113]8QianWjFengCDjZhangHL,etal.FirstReportofRaceDiversityoftheSpinachDownyMildewPathogen，Peronosporaeffusa,inChina[J].PlantDisease，2016.[0114]9、IrishBM，CorrellJC，FengC，etal.CharacterizationofaresistancelocusPfs-ItothespinachdownymildewpathogenPeronosporafarinosaf.sp.spinaciaeanddevelopmentofamolecularmarkerIinkedtoPfs-I[J].Phytopathology,2008,988:894-900.[0115]10、XuCjJiaoC，SunH，etal.Draftgenomeofspinachandtranscriptomediversityof120Spinaciaaccessions[J].Naturecommunications，2017,8:15275.[0116]IKSlusarenkoAJjSchlaichNL.DownymildewofArabidopsisthalianacausedbyHyaloperonosporaparasiticaformerlyPeronosporaparasitica[J]•MolecularPlantPathology，2003,43:159-170.[0117]12、NemriA,AtwelIS,TaroneAM，etal.Genome-widesurveyofArabidopsisnaturalvariationindownymildewresistanceusingcombinedassociationandlinkagemapping[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，2010,10722:10302-10307.[0118]13、WangShenyun,CaoJiashu.AdvancesinmolecularmechanismsoftheresistanceofArabidopsisthalianatodownymildewinChinses[J]·PlantProtection,2006,5:004.[0119]14、RadwanOjMouzeyarSjNicolasP，etal.InductionofasunflowerCC-NBS-LRRresistancegeneanalogueduringincompatibleinteractionwithPlasmoparahalstedii[J].Journalofexperimentalbotany,2005，56412:567-575·[0120]15、MeyersBC,ChinDB,ShenKA，etal.Themajorresistancegeneclusterinlettuceishighlyduplicatedandspansseveralmegabases[J].ThePlantCell，1998，10ll:1817-1832.[0121]16、FeechanAjAndersonC,TorregrosaL，etal.GeneticdissectionofaTIR-NB-LRRlocusfromthewildNorthAmericangrapevinespeciesMuscadiniarotundifoliaidentifiesparalogousgenesconferringresistancetomajorfungalandoomycetepathogensincultivatedgrapevine[J].ThePlantJournal,2013,76⑷：661-674.[0122]17、MeyersBlakeCjKaushikShail,NandetyRajaSekhar.Evolvingdiseaseresistancegenes.[J].CurrentOpinioninPlantBiology，2005,82〇

权利要求：1.基于KASP技术开发的用于检测菠菜RPFl基因型的引物，其特征在于，所述引物用于检测与菠菜抗霜霉病基因RPFl紧密连锁的SNP标记KM256436,该标记位于菠菜3号染色体上，物理位置697720bp，SNP位点处碱基为G或T，碱基为G的菠菜植株为霜霉病抗病型，碱基为T的菠菜植株为霜霉病感病型；所述引物包括：正向引物Fl:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCATTGACTGGATCAAAACTATTCACA-3’；正向引物F2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATTGACTGGATCAAAACTATTCACC-3’；反向引物R:5’-GGTACTTTGTTTTTATAGATTTGTTTTTTCCTTTTA-3’。2.含有权利要求1所述引物的用于鉴定菠菜RPFl基因型的检测试剂或试剂盒。3.权利要求1所述引物或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在菠菜RPFl基因分型中的应用。4.权利要求1所述引物或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在鉴定与菠菜抗霜霉病基因RPFl紧密连锁的SNP标记KM256436中的应用。5.权利要求1所述引物或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在鉴定或选育抗霜霉病菠菜品种中的应用。6.根据权利要求3-5任一项所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：⑴提取待测菠菜样品的DNA;⑵将步骤⑴中的DNA稀释到18-25ngAU，向其中加入特异的KASPPrimermix和通用的KASPMastermix，进行PCR扩增；其中，KASPPrimermix中正向引物Fl和F2的终浓度均为12μΜ，反向引物R的终浓度为30μΜ;通用的KASPMastermix包含如下组分：通用的TRETcassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaqDNA聚合酶，dNTP和MgCl2;3PCR产物荧光检测分析。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤⑵的PCR反应体系如下:_^8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤⑵中PCR反应条件如下:9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤3待荧光检测分型后，若分型结果不理想，再进行如下PCR反应：第二次PCR反应结束后，再次进行荧光检测分析。

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