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申请/专利权人：西北农林科技大学;西宁市畜牧兽医站

摘要：本发明公开了一种提高牛体细胞克隆效率的方法，通过诱导表达zfp57基因使牛克隆胚胎发育过程中的印迹基因甲基化恢复正常水平，从而提高牛体细胞克隆效率。本发明提供的一种提高牛体细胞克隆效率的方法，利用zfp57纠正牛克隆胚胎上异常的印迹基因低甲基化，使其甲基化水平到达和体外受精胚胎接近的水平，从而提高牛克隆胚胎的胚胎质量，促进牛克隆胚胎的发育；为阐明体细胞克隆胚胎重编程过程中甲基化印迹异常的机理以及体细胞克隆效率低下的原因提供理论依据。

主权项：1.一种提高牛体细胞克隆效率的方法，用于非治疗目的，其特征在于，所述方法通过诱导表达zfp57基因使牛克隆胚胎发育过程中的印迹基因甲基化恢复正常水平，从而提高牛体细胞克隆效率；具体步骤如下：1构建zfp57表达载体①zfp57基因克隆：根据zfp57基因的CDS序列设计扩增引物Zfp57-KZ；以胎牛成纤维细胞cDNA为模板，Zfp57-KZ为引物，PCR扩增获得zfp57基因；所述扩增引物Zfp57-KZ的引物序列如下：Zfp57-KZ-F：GCCACCATGGAGCCTAGTCACCCTTGGTGGC；SEQIDNO.2；Zfp57-KZ-R：TCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTTTCCCTTCTAAGACCTTCATTGCC；SEQIDNO.3；其中，上游引物加入Kozak序列，下游引物加入Flag序列；②构建zfp57表达载体：zfp57基因连接pMD-18T载体，获得质粒pMD-18T-zfp57；将质粒pMD-18T-zfp57和pTRE3G-BI分别进行双酶切，连接，转化，获得表达载体pTRE3G-BI-zfp57；2建立转基因细胞株①将表达载体pTRE3G-BI-zfp57和辅助载体共转染胎牛成纤维细胞，筛选单克隆细胞；所述辅助载体为pEF1α-Tet3G；②对获得的单克隆细胞进行PCR、实时荧光定量PCR和免疫印迹检测；3检测表达zfp57基因对牛胚胎发育的影响；4检测表达zfp57基因对牛胚胎囊胚质量的影响；5检测表达zfp57基因对牛早期胚胎印迹基因甲基化水平的影响。

全文数据：一种通过诱导表达zfp57提高牛体细胞克隆效率的方法技术领域本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种通过诱导表达zfp57提高牛体细胞克隆效率的方法。背景技术哺乳动物的基因都有来自父母的两个拷贝，一般情况下，两个拷贝均被表达。但基因组有一些基因是单等位基因表达monoallelicexpression的，根据亲源性这些基因仅表达来自亲本一方的等位基因，而来自另一方的等位基因不表达。这类基因称为印迹基因，这种非孟德尔遗传现象称为基因组印迹。体细胞重编程的方法主要有三种：核移植、多能因子诱导以及细胞融合，但是目前最成熟的对体细胞重编程效率最高的方法是核移植。体细胞核移植具有重要的理论研究价值和生产实践价值，可应用于治疗性克隆、抗病转基因家畜的生产、高价值药用蛋白的生产、人类器官移植和疾病模型的构建等研究。但至今体细胞克隆的效率仍然不高，大量体细胞克隆胎儿在附植期或围产期死亡，出生存活的克隆动物也表现各种发育异常，例如巨胎症等。体细胞克隆胚胎重编程过程中普遍存在的印迹基因异常去甲基化是引起克隆动物发育异常和体细胞克隆效率低下的重要原因。因此，如何保护牛克隆胚胎发育过程中的印迹基因甲基化，从而提高牛体细胞克隆效率是本领域技术人员亟需解决的问题。发明内容有鉴于此，本发明提供了一种通过诱导表达zfp57提高牛体细胞克隆效率的方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种提高牛体细胞克隆效率的方法，所述方法通过诱导表达zfp57基因使牛克隆胚胎发育过程中的印迹基因甲基化恢复正常水平，从而提高牛体细胞克隆效率。进一步，一种提高牛体细胞克隆效率的方法，通过以下步骤实现：1构建zfp57表达载体①zfp57基因克隆：根据zfp57基因的CDS序列设计扩增引物Zfp57-KZ；以胎牛成纤维细胞cDNA为模板，Zfp57-KZ为引物，PCR扩增获得zfp57基因；②构建zfp57表达载体：zfp57基因连接pMD-18T载体，获得质粒pMD-18T-zfp57；将质粒pMD-18T-zfp57和pTRE3G-BI分别进行双酶切，连接，转化，获得表达载体pTRE3G-BI-zfp57；2建立转基因细胞株①将表达载体pTRE3G-BI-zfp57和辅助载体共转染胎牛成纤维细胞，筛选单克隆细胞；②对获得的单克隆细胞进行PCR、实时荧光定量PCR和免疫印迹检测；3检测表达zfp57基因对牛胚胎发育的影响；4检测表达zfp57基因对牛胚胎囊胚质量的影响5检测表达zfp57基因对牛早期胚胎印迹基因甲基化水平的影响。进一步，所述扩增引物Zfp57-KZ的引物序列如下：Zfp57-KZ-F：GCCACCATGGAGCCTAGTCACCCTTGGTGGC；SEQIDNO.2；Zfp57-KZ-R：TCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTTTCCCTTCTAAGACCTTCATTGCC；SEQIDNO.3；其中，上游引物加入Kozak序列GCCACC，下游引物加入Flag序列CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC。进一步，所述辅助载体为pEF1α-Tet3G。进一步，zfp57基因在提高牛体细胞克隆效率中的应用。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种提高牛体细胞克隆效率的方法，牛体细胞克隆胚胎上存在严重的印迹甲基化的丢失，zfp57可纠正牛克隆胚胎上异常的印迹基因低甲基化，使其甲基化水平到达和体外受精胚胎接近的水平，从而提高牛克隆胚胎的胚胎质量，促进牛克隆胚胎的发育；为阐明体细胞克隆胚胎重编程过程中甲基化印迹异常的机理以及体细胞克隆效率低下的原因提供理论依据。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本发明zfp57基因PCR扩增条带；图2附图为本发明表达载体pTRE3G-BI-zfp57鉴定结果；其中，M，5000bpmarker；1，空载体pTRE3G-BI；2，质粒pTRE3G-BI-zfp57；图3附图为本发明表达载体pTRE3G-BI-zfp57转染293T细胞后的转基因细胞；图4附图为本发明表达载体pTRE3G-BI-zfp57转染胎牛成纤维细胞后的转基因细胞；图5附图为本发明过表达细胞株表达效率检测；其中，KB，不转染质粒的空白对照；NC，转染不含目的基因的空载体；O1-O6，部分过表达细胞株过表达效率检测O:Overexpression；图6附图为本发明qPCR鉴定zfp57的表达水平；图7附图为本发明单克隆细胞的免疫印迹检测；其中，A，Flag；B，内参β-Actin；1，转染目的基因的过表达载体；2，转染空载的过表达载体；图8附图为本发明牛克隆胚胎；其中，A，对照IVF组；B，干扰ZFP57-IVF组；C，对照克隆组；D，ZFP57克隆组；图9附图为本发明囊胚凋亡率；其中，囊胚细胞凋亡染色TUNEL，绿色和细胞核DNADAPI共染；放大倍数为40；A，对照IVF组；B，干扰ZFP57-IVF组；C，对照克隆组；D，ZFP57克隆组；图10附图为本发明牛H19IGF2ICR的CpG岛预测；图11附图为本发明牛H19IGF2ICR的序列信息研究；其中，牛H19IGF2ICR片段426bp待研究序列上链和该区亚硫酸氢盐转化后的预测DNA序列下链；黄色并下划线标出序列为引物序列位置；CpG位点用“++”标出；图12附图为本发明BSP法分析H19IGF2ICR的甲基化水平图13附图为本发明BSP法分析XISTICR的甲基化水平；图14附图为本发明BSP法分析IGF2RICR的甲基化水平；图12-14中，每条水平横链上的圆圈表示研究序列里面的CpG位点，白色和黑色的圆圈分别代表非甲基化和甲基化的CpG；每条水平横链代表一个测序的克隆；表示DNA甲基化水平的BSP测序结果的圆圈串串图是用BIQAnalyzer软件自动生成；每个样品中，甲基化位点除以所有位点表示该基因在该样品上的DNA甲基化水平；每个样品重复三次BS-PCR。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。pEF1alpha-Tet3G质粒载体、pTRE3G-BI质粒载体、293T细胞系和胎牛成纤维细胞，由实验室保存。SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、DNA纯化回收试剂Axygen、无内毒素质粒中提试剂盒，购自Promega公司；实时定量PCRRT-qPCR试剂盒SYBRPremixExTaqTMPerfectRealTime、反转录试剂盒PrimeScriptTMRTreagentKit，购自TaKaRa公司；BCA蛋白定量试剂盒购自康为世纪公司；OptiMEM，DMEM高糖培养基，胎牛血清购自Invitrogen公司；FugeneHD转染试剂购自Roche公司；TransZolUp，购自Transgene公司；Flag抗体、β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgGH+L购自碧云天公司。实施例1zfp57基因克隆利用NCBI搜索牛属zfp57基因预测序列，拷贝其转录本序列，并标注出CDS序列SEQIDNO.1。利用Primer5引物设计软件根据zfp57的CDS序列设计扩增引物Zfp57-KZ，并在其上游引物加入Kozak序列GCCACC，由于缺乏牛ZFP57蛋白抗体，因此在终止密码子前加一段Flag序列CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC。其中，扩增引物Zfp57-KZ序列如下；Zfp57-KZ-F：GCCACCATGGAGCCTAGTCACCCTTGGTGGC；SEQIDNO.2；Zfp57-KZ-R：TCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTTTCCCTTCTAAGACCTTCATTGCC；SEQIDNO.3。以胎牛成纤维细胞cDNA为模板，Zfp57-KZ为引物，PCR扩增zfp57基因，获得1713bp大小的条带，结果如图1所示。PCR反应体系为：模板2.5μL，上下游引物各0.5μL，2×PrimeSTARGCBuffer25μL，dNTPMixture4μL，PrimeSTARHSDNAPolymerase0.5μL，ddH2O17μL。PCR反应参数：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃2min；72℃10min，循环40次；4℃结束反应。对获得的PCR产物进行胶回收，获得zfp57基因片段。实施例2zfp57基因诱导表达载体的构建1实施例1获得的zfp57基因片段连接pMD-18T载体连接反应体系为：zfp57基因片段5μL，SolutionI4μL，pMD-18T载体1μL；将样品放置4℃冰箱过夜连接，获得连接产物。2连接产物转化大肠埃希菌Trans5α感受态细胞1取50μL冰浴上融化的感受态细胞，加入5μL的连接产物，轻轻混匀，冰浴放20min；242℃水浴中热激60s，快速将管转移到冰浴中2min；3在超净工作台向每个1.5mlEP管内加入500μL无菌LB培养液，混匀后置于37℃，200rmin培养1h，复苏；4复苏后4000rmin离心4min，弃去部分上清，保留100～200μL菌液将沉淀混匀，均匀涂布在含有Amp+的LB培养皿上，待菌液干后，将皿倒置，42℃电热恒温培养箱过夜培养。3筛选单克隆菌落在超净工作台挑取具有氨苄抗性的单克隆加入含有7mLLB培养液和7μLAmp+离心管中，每个培养皿进行3次重复，置于恒温摇床扩大培养约10-12h37℃，200rmin。4提取质粒pMD-18T-zfp57取摇好的菌液6ml用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒按如下步骤提取质粒，并依次标记编号。将摇好的菌液吸取700μL加入300μL的甘油中保菌－80℃储存。将标记好序列号的质粒送至南京金斯瑞公司测序，得到测序反馈信息后进行序列间的比对，并与NCBI中的对应基因序列Blast，选取不含有碱基突变与碱基错位的质粒pMD-18T-zfp57进行后续实验。5构建表达载体pTRE3G-BI-zfp57将表达载体pTRE3G-BI与质粒pMD-18T-zfp57利用PstI与EcoRI分别进行双酶切，电泳并胶回收酶切产物，将胶回收的zfp57基因目的片段与双酶切后的表达载体pTRE3G-BI连接。连接产物转化大肠埃希菌Trans5α感受态细胞，挑取具有氨苄抗性的单克隆，获得转化子，提取质粒pTRE3G-BI-zfp57。对质粒pTRE3G-BI-zfp57进行琼脂糖凝胶电泳，以空载体pTRE3G-BI为对照，结果发现，空载体pTRE3G-BI比质粒pTRE3G-BI-zfp57小1700bp，结果如图2所示，表明表达载体pTRE3G-BI-zfp57构建成功。实施例3表达载体pTRE3G-BI-zfp57转染293T细胞1293T细胞、胎牛成纤维细胞FBF的准备1293T细胞复苏将293T细胞从液氮罐取出后立即于37℃水浴锅解冻，吸取1mL37℃预热的DMEM细胞培养液配制：10.4gDMEM干粉，3.7gNaHCO3，100mL胎牛血清，补超纯水至1L，过滤分装于1.5mL离心管中，再加入293T细胞，1000rmin离心5min，弃去上清，加入1mLDMEM细胞培养液将细胞吹起。将悬起的293T细胞加入到6cm细胞培养皿内含3mL细胞培养液和3μL青霉素和链霉素双抗中，混匀，放入CO2细胞培养箱培养。加入双抗能够防止刚解冻的293T细胞发生细菌污染。2293T细胞传代待293T细胞生长至平皿80％～90％时传代。将培养皿中培养液吸尽，用300μL0.25％胰酶细胞消化液称取0.25g胰蛋白酶粉末，0.02gEDTA，加入100mL无钙镁的PBS，不断搅拌至充分溶解，0.22μm孔径滤膜过滤后小管分装，-20℃冻存备用消化3min消化时间长短以不同细胞而定后，加入1mL培养液停止消化，将皿中培养液液吸至1.5mL离心管，1000rmin离心5min后弃上清，加入1mL培养液将细胞悬起，将一半细胞悬浮液加入另一个6cm细胞培养皿内含3ml细胞培养液和3μL双抗，将剩余的细胞悬浮液平均加入24孔板的2个孔内含500μL培养液，混匀后放于CO2细胞培养箱培养。胎牛成纤维细胞的复苏与传代参照293T细胞的复苏与传代步骤。2表达载体pTRE3G-BI-zfp57和辅助载体共转染293T细胞该诱导表达系统由两个载体组成：主载体与辅助载体，鉴于293T细胞转染效率较高，因此本发明选择在293T细胞中验证zfp57诱导表达系统是否正常表达。辅助载体为调节表达载体，可以表达转录活化因子，在Dox诱导下会该转录因子会改变其构象，使其结合到反应表达载体的TRE序列区，进而启动下游靶基因zfp57的表达。在转染前30min更换24孔板中的细胞培养液，每孔500μL完全培养液；分别用50μL无血清高糖DMEM稀释1μg主载体表达载体pTRE3G-BI-zfp57与1μg辅助载体pEF1α-Tet3G，轻轻的上下吹打混匀；用100μL无血清高糖DMEM稀释6μLLongTrans，轻轻上下吹打3-4次；分别取50μL稀释的LongTrans加入到稀释的主载体与辅助载体中，上下吹打3-4次以充分混合；室温静置10min。分别取50μL主载体与试剂混合液、辅助载体与试剂混合液加入到24孔板中，轻轻混匀；置于CO2培养箱中培养。8h后加入DOX诱导剂四环素类似物，以便使目的基因和抗性基因持续表达诱导目的基因表达，24h后观察GFP表达情况。结果如图3所示，转基因细胞表达绿色荧光，表明zfp57诱导表达系统可以在真核细胞中正常表达。实施例4转染后单克隆细胞的筛选1细胞预筛将状态良好的FBF平铺接种至12孔板中，每孔接种7x104个细胞，平铺均匀。第二天，吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同G418浓度的筛选培养基，100ugml、400ugml、500ugml、700ugml、800ugml、900ugml、1000ugml，将加入了不同浓度G418的12孔板放至CO2培养箱中培养。每隔3-5天更换一次培养液，并加入不同浓度的G418。在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。最终确定本发明所用细胞的最适G418筛选浓度为800ugml。2质粒转染及单克隆的筛选质粒转染前一天将状态良好的FBF细胞平铺至4个6cm皿，每个培养皿接种3x106个细胞。当细胞汇合至85％-95％时进行细胞电转。电转步骤如下：细胞长满90％时可转-弃培养液-PBS洗2次-加300ul胰酶，培养箱中3min-加1ml培养液终止消化-离心，弃上清-Opti-MEM洗两遍-加入700ul电转液、6ug质粒-静置10min-电击510V2ms1次-静置15min-平铺至新的6cm皿中，加3ml新鲜培养液-放至CO2培养箱中培养。转染过表达载体时，将构建好的含有目的基因的主载体与辅助载体各10ug加入电转液中共孵育10min；同时在另一个电转杯中加入空载主载体与辅助载体各10ug共孵育10min，作为对照。各组孵育10min后，进行电转。电转后，静置15min，随后将电转杯中细胞与质粒混合物转移至6cm皿中，加3mlDMEM培养液，轻轻摇晃培养皿，使细胞均匀平铺在培养皿底部。放至CO2培养箱中培养。次日，将6cm皿中的细胞传至5个10cm皿中，每个皿加入8ml培养液，同时加入64ulG418浓缩液浓度为100ugml，使培养液中G418浓度为800ugml，轻轻上下、左右晃动培养皿使细胞均匀分布在培养皿中。对每个培养皿做好对应标记。放至CO2培养箱中培养。每隔3天更换一次培养液，并观察细胞的生长和死亡情况。在第10-14天会出现细胞克隆。转基因细胞表达绿色荧光，细胞克隆呈绿色荧光筛选的细胞单克隆如图4。根据细胞克隆的生长情况及克隆的大小进行单克隆细胞的挑取。3单克隆细胞的挑取电转后的细胞在10cm皿中生长14天时，克隆的大小即可满足挑取的条件。在显微镜下找出细胞状态和大小合适的单克隆并用记号笔将其圈出，以方便随后的挑取过程。将培养液弃掉，用PBS洗一次并弃掉，在圈出的单克隆处滴一滴胰酶，在台式倒置显微镜下观察细胞的消化情况，当大部分细胞被胰酶消化下来呈立体状，小心加入4ml培养液终止消化。取48孔板，并在每孔中加入400ulDMEM培养液；将已经消化好的单克隆细胞放至倒置显微镜下进行细胞单克隆的挑取；将挑取的细胞传至48孔板中，并做好相应的标记。待细胞长满48孔板时传至24孔板，待细胞长满24孔板时再将阳性细胞传至12孔板，以此再传入6孔板中。4单克隆细胞的PCR检测挑取出的单克隆细胞传代至6孔板时，将生长状态良好的单克隆细胞少量传至无菌的PCR管中，离心，弃培养液。使用裂解液2XRIPA细胞裂解液：称取Tris碱0.2416g，NaCl0.3505g，SDS0.04g，脱氧胆酸钠0.4g，加入18mLddH2O充分搅拌至完全溶解，加入TritonX-1000.2mL，用ddH2O定容至20mL，小管分装，-20℃保存备用重悬细胞，每个PCR管中加入10-20ul裂解液，65℃15min，95℃5min，裂解细胞。裂解后，将含裂解细胞的细胞裂解液作模板进行PCR，检测目的片段的插入情况。PCR体系如下：模板1ul，上下游引物Zfp57-KZ各0.6ul，HiFiDNAPolymerase0.2ul，dNTPMixture2ul，HiFibufferII2ul，ddH2O13.6ul。PCR反应参数：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃12s，循环35次；72℃2min；4℃结束反应。PCR结束后凝胶电泳检测到6株单克隆细胞出现目的条带。将经PCR鉴定目的片段稳定整合入基因组的6株阳性细胞做好标记，传至12孔板继续培养；阳性细胞长满12孔板后传至6孔板，然后再传至6cm皿，当细胞长满后将部分细胞传至12孔板，剩余细胞传至6cm皿继续培养。12孔板中的阳性克隆细胞用来做定量PCR检测，6cm皿中细胞用来做WesternBlot蛋白检测。5单克隆细胞的定量PCR检测对12孔板中的阳性克隆细胞进行总RNA提取，并分别标记好其序号。1Trizol法提取细胞总RNA，提取步骤如下：①当细胞铺满孔面积的95％后，加入Trizol约500μL，静置裂解10min，并用移液器收集到1.5mL无RNA酶离心管中；②加入0.1mL氯仿，盖紧盖子，剧烈摇晃15s，室温静置2min；③13000rpm离心15min4℃冷冻离心，RNA在最上层的水相中；吸取水相，并放入新的RNase-freeEP管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，4℃静置30min；④13000rpm离心10min4℃冷冻离心，彻底去除上清，每1mLTrizol加入1mL的RNase-free75％乙醇，并上下颠倒清洗沉淀；⑤7500rpm离心5min4℃冷冻离心，弃上清，并室温自然干燥5～10min，加入30μL的RNase-freeddH2O溶解RNA，并测定浓度以及260280，根据其浓度进行反转录。2RNA反转录按TaKaRa公司反转录试剂盒PrimeScriptTMRTreagentKit说明书，反转录体系如下：5XPrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，Random6mers1μL，RNA1μL，RNase-freeddH2O13μL。反转录程序：37℃15min；85℃5s，4℃5min。获得的cDNA放于-20℃保存。3实时荧光定量PCR根据Zfp57全基因序列设计Zfp57定量检测引物Zfp57-DL，引物序列如下：Zfp57-DL-F：GAAACAGTGGGAAGCGGATC；SEQIDNO.4；Zfp57-DL-R：ACAGTCCCCTCATCTCCCA；SEQIDNO.5。使用TaKaRa公司SYBRPremixExTaqPerfectRealTime试剂盒进行Real-TimePCR，根据试剂盒使用说明书配制反应体系。每个样品重复3次。加样完毕后，使用AppliedBiosystems公司Steponeplus实时定量PCR仪进行realtimePCR反应。反应程序如下：95℃30s；95℃5s，60℃30s；循环40次。反应结束后，运用2-ΔΔcT方法计算目的基因的相对表达量，结果如图5所示。选取表达量最高的第4株单克隆细胞株，扩大培养。用TRIZOL提取对照组细胞con和过表达zfp57的单克隆细胞，结果如图6所示，qPCR结果显示zfp57在mRNA水平显著上升。6单克隆细胞的免疫印迹检测1蛋白质的提取①吸尽DMEM细胞培养液，加入300μL胰酶消化2min，加等体积的细胞培养液停止消化，分装到1.5mL离心管中；②1000rmin离心5min，弃上清，用500μLPBS吹打悬起，300g离心5min，弃上清，加入100～200μL细胞裂解液内含蛋白酶抑制剂，冰浴裂解15min；③在4℃以12000rmin离心20min，取上清，加入与细胞裂解液等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液，95～100℃水浴锅煮10min；2蛋白定量①取50μL上一步中裂解后的上清液，用细胞裂解液稀释10倍；②4个样品包括一个空白对照各取20μL于可拆分式酶标板；③各孔加入BCA试剂A和BCA试剂B混合液1：50，共180μL，37℃孵育30min；④微量测液仪测各样品的OD值。3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳①组装SDS-PAGE电泳装置，制备两块胶板，一块用于内参对照，另一块用于检测；②将胶固定好后放入电泳槽，倒入电泳缓冲液，用微量进液器加样，BluePlusⅡProteinMarker5μL，检测样品加入25～30μL样品，内参对应加5μL，不足用1×LoadingBuffer补齐；③加样完成后开始电泳，浓缩胶时调节电压为85V，待Marker开始分带时说明样品已进入分离胶，电压升高到120V继续电泳；当发现溴酚蓝跑出凝胶即可停止电泳。4转膜①PVDF膜使用前在甲醇中浸泡1～2min，再用预冷的转膜缓冲液浸泡，胶切好后从负极至正极按海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵依次安放好；②组装转膜装置后0.25A电泳2.5h，此过程在冰盒中进行。5封闭将PVDF膜放入100gL脱脂奶粉TBST封闭液中，于低速摇床封闭3h。6抗体孵育和显影①一抗用50gL脱脂奶粉稀释分别为Flag抗体1：500、β-actin抗体1：2000后，均匀滴在PVDF膜上；4℃过夜孵育，次日，TBST低速摇床洗涤3次，每次10min；②HRP标记山羊抗兔IgG用50gL脱脂奶粉1：1000稀释均匀滴加到PVDF膜上，室温孵育2h，TBST低速摇床洗涤3次，每次10min；③倒干TBST，发光液A、B每个1mL混匀，在暗室中均匀滴加到膜上，曝光3s～4min；④放入显影液中30s以上，再放入洗涤液中清洗；置于定影液，至底片透明化，再洗涤干净。检测结果如图7所示。实施例5表达干扰zfp57对胚胎发育的影响用正常细胞株对照克隆组、zfp57转基因细胞株ZFP57克隆组为核体，做体细胞核移植，获得早期发育的牛体细胞克隆胚胎；分两批用牛精子和卵母细胞做体外受精，一批为对照IVF组用对zfp57基因没有干扰作用的对照siRNA注射，另一批卵母细胞用zfp57siRNA干扰小片段ZFP57-1580注射，获得体外受精胚胎干扰ZFP57-IVF组；结果如图8所示。其中，zfp57siRNA干扰小片段ZFP57-1580的序列如下：ZFP57-1580:GCAGAAGAAAGAAAGCAAAGG；SEQIDNO.6。如表1，干扰ZFP57-IVF组胚胎的卵裂率显著低于其他三组P西北农林科技大学西宁市畜牧兽医站一种通过诱导表达zfp57提高牛体细胞克隆效率的方法8SIPOSequenceListing1.011683DNAArtificialSequence1atggagcctagtcacccttggtggccagaccaggcatggataaagcttaaaagagacagc60atggaagagaaggtgtctgaccagccaaagccagtggaacctgtacagaagctgctccct120caggtggacgaggagggtctgccgaaagcctggaagggagagtgctggtggaaggagtgg180gtgaagaagccagtcacctttgaggatgtggcagtaaacttcacccaggaagagtggaaa240tgtctagatgtcagtcagagggtcctctaccaggatgttatatcagagactgtcagaaac300ctgatgtctgtggatctgatcgccaagcttgagcaagaagagaaacagtgggaagcagat360ctctgttccccgaatggagaaggctttcattcaggaggcaaggaggaaagccaagaacag420agtcagagtttgggagatgaggggactgttgatgacaagaaggcctcccttgctcacaga480ggcttgggcccaacctctcctccagctgggtccccggacaagacgccaacattgccagaa540tcctgggctcggccagcctttacctgtcacacctgtggcaagtgcttcagcaagcgctcc600agcctctacaaccatcagcttgttcacaacagcgcccagtgtgggaagtccttccagaac660cccaaggacctcagctccggccggcgcaagcaacccagggaaaggcccttccgctgctcg720ctctgtggcaagacctactgcgatgcttctggactgagccgtcaccgccgtgtccatctg780ggctaccggccccatgcgtgccctttctgtgggaagtgcttcagggaccagtctgagctc840aaacgccaccagaagacgcaccaaggccagaagctgggggctggaaaccagaagcatatt900gtgaggactccggataccagagctggattacagggcctggcaacagggaaccatgcagca960gtggctgtgacccaaggacccacacttaaaaccaagggtcccaagactcagccccagccg1020tcaatagacaggaaccaggtacctgccaccaagaacatggtaatcactgtgagagctcag1080gccccagagcctgtgaccaggaccccagccccagagcctgtgaccaggaccccagcccca1140gagcctgtgaccaggaccctggcagccaacatgcgagctactcgcctgaacaccaagtcc1200aactctcacccagagaagccttcaagactcaaggtcttctcttgccctcattgtccctta1260acttttagcaggaaaacccgtctctccagtcatcagaaggtccactacacagagcagtcc1320aaccgctgcttccactgtggcaagtccttcactttattctccgggctgatccggcaccag1380cagactcactggaagcagagggtctactgttgccctatatgcgacgtctgctttggggag1440aaagaggaccttttgggtcactgggggggctacagaagcaaggggctattcctgggcagt1500ccccacaagtgctgggccatcctgggtcagtggcttggcttctttcccaatgcctctgct1560gtggcagggaaggaaatggatctttctcctggatccagaccctcaggaaaggggaggaag1620ggagaggaaaaggcacgcagaagaaagaaagcaaaggcaatgaaggtcttagaagggaaa1680tga1683231DNAArtificialSequence2gccaccatggagcctagtcacccttggtggc31352DNAArtificialSequence3tcacttatcgtcgtcatccttgtaatctttcccttctaagaccttcattgcc52420DNAArtificialSequence4gaaacagtgggaagcggatc20519DNAArtificialSequence5acagtcccctcatctccca19621DNAArtificialSequence6gcagaagaaagaaagcaaagg21726DNAArtificialSequence7ggagtttgggtgaggtatagttttag26825DNAArtificialSequence8ccaaacataaaaatccctcattatc25

权利要求：1.一种提高牛体细胞克隆效率的方法，其特征在于，所述方法通过诱导表达zfp57基因使牛克隆胚胎发育过程中的印迹基因甲基化恢复正常水平，从而提高牛体细胞克隆效率。2.根据权利要求1所述的一种提高牛体细胞克隆效率的方法，其特征在于，所述方法通过以下步骤实现：1构建zfp57表达载体①zfp57基因克隆：根据zfp57基因的CDS序列设计扩增引物Zfp57-KZ；以胎牛成纤维细胞cDNA为模板，Zfp57-KZ为引物，PCR扩增获得zfp57基因；②构建zfp57表达载体：zfp57基因连接pMD-18T载体，获得质粒pMD-18T-zfp57；将质粒pMD-18T-zfp57和pTRE3G-BI分别进行双酶切，连接，转化，获得表达载体pTRE3G-BI-zfp57；2建立转基因细胞株①将表达载体pTRE3G-BI-zfp57和辅助载体共转染胎牛成纤维细胞，筛选单克隆细胞；②对获得的单克隆细胞进行PCR、实时荧光定量PCR和免疫印迹检测；3检测表达zfp57基因对牛胚胎发育的影响；4检测表达zfp57基因对牛胚胎囊胚质量的影响；5检测表达zfp57基因对牛早期胚胎印迹基因甲基化水平的影响。3.根据权利要求2所述的一种提高牛体细胞克隆效率的方法，其特征在于，所述扩增引物Zfp57-KZ的引物序列如下：Zfp57-KZ-F：GCCACCATGGAGCCTAGTCACCCTTGGTGGC；SEQIDNO.2；Zfp57-KZ-R：TCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTTTCCCTTCTAAGACCTTCATTGCC；SEQIDNO.3；其中，上游引物加入Kozak序列，下游引物加入Flag序列。4.根据权利要求2所述的一种提高牛体细胞克隆效率的方法，其特征在于，所述辅助载体为pEF1α-Tet3G。5.zfp57基因在提高牛体细胞克隆效率中的应用。

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