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申请/专利权人：汉诺威医学院;布伦瑞克工业大学

摘要：本发明提供了融合蛋白，用于在接受了移植物的患者中治疗HvG病，用于抑制宿主的针对移植物的免疫应答。所述融合蛋白适用于在HLA‑A*02或SLA‑01*0401阴性的接受体recipient患者中抑制含有或表达HLA‑A*02或SLA‑01*0401的移植物的免疫排斥，即，移植前的患者不表达HLA‑A*02或SLA‑01*0401。融合蛋白是嵌合抗原受体CAR，其在调节性T细胞Treg中表达后，在HLA‑A*02或SLA‑01*0401存在下引起调节性T细胞的特异性抑制物suppressor活性。

主权项：1.融合蛋白在制备治疗患者中HvG病的药物中的用途，所述融合蛋白包含单链可变片段抗体域scFv、铰链、跨膜域、胞内hCD28信号传导域和胞内hCD3ζhCD3zeta信号传导域，形成对HLA-A*02具有特异性的嵌合抗原受体CAR-A*02，所述融合蛋白的特征在于所述融合蛋白在CD4+CD25+CD127低人调节TTreg细胞中表达，该表达CAR-A*02的Treg是HLA-A*02阴性。

全文数据：在治疗HvG病中使用的融合蛋白本发明涉及融合蛋白，其用于治疗接受了移植物的患者中的HvG病，用于抑制宿主的针对移植物的免疫应答。融合蛋白适用于在HLA-A*02阴性的接受体recipient患者中抑制含有或表达作为人HLA-A*02的MHCI类分子的移植物的免疫排斥，即移植前的患者不表达HLA-A*02，或融合蛋白适用于抑制含有或表达作为猪SLA-01*0401猪白细胞抗原01*0401的MHCI类分子的移植物的免疫反应。融合蛋白是嵌合抗原受体CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401，其在调节性T细胞Treg中表达后分别在HLA-A*02的存在下或在SLA-01*0401的存在下引起调节性T细胞的特异性抑制物活性。本发明的CAR-A*02和CAR-SLA-01*0401的优点是抑制物活性限于移植物并且导致移植物内细胞毒性T细胞的抑制，包括针对分别表达HLA-A*02或SLA-01*0401的移植物的细胞毒性T细胞。移植是一种实体组织。融合蛋白包含下列各项或由下列各项组成：单链可变片段抗体域scFv、经修饰的hCD8铰链、hCD8跨膜域、胞内hCD28信号传导域和胞内hCD3ζhCD3zeta信号传导域，它们优选从N端到C端彼此连接，更优选从N端到C端彼此直接连接。尤其在CAR-SLA-01*0401中，融合蛋白可以含有hΔFcIgG域作为经修饰的hCD8铰链的备选，和或融合hCD28跨膜域-hCD28CD3zeta域作为hCD8跨膜域的备选，胞内hCD28信号传导域和胞内hCD3ζhCD3zeta信号传导域。此外，本发明涉及编码CAR融合蛋白的核酸序列，优选包含在病毒载体中，例如，在5'LTR和3'LTR之间，核酸序列更优选包含在适于转导Treg细胞的病毒颗粒中。其中，优选包含在病毒颗粒中的核酸序列和病毒载体用于治疗宿主抗移植物HvG病。根据本发明，HvG病的治疗通常是抑制针对移植的移植物的细胞毒性T细胞活性。此外，本发明涉及用于引入分别对HLA-A*02或SLA-01*0401特异性的抑制物活性的体外方法，其通过在Treg细胞中表达根据本发明的融合蛋白，例如，通过将编码融合蛋白CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的核酸序列导入Treg细胞中进行，所述Treg细胞通常不含或不表达HLA-A*02或SLA-01*0401，优选地，Treg细胞对患者是同基因的homogeneic，例如从患者的活组织检查中获得并分离。本发明提供了治疗HvG病的方法，其包括对患者施用表达本发明的融合蛋白CAR-A*02或融合蛋白CAR-SLA-01*0401的Treg细胞。现有技术MacDonaldetal.,TheJournalofClinicalInvestigation1-122016年3月22日描述了具有对HLA-A2特异性的scFv域的通用CAR，以及转导用于表达CAR以进行HLA-A2特异性抑制的调节性T细胞。scFv域含有单克隆抗体BB7.2的重链和轻链可变区。除scFv外，CAR还含有CD28跨膜域、CD28信号传导域和CD3ζ信号传导域。Inagumaetal.,GeneTherapy575-5842014描述了可用于使T淋巴细胞针对表达特定蛋白质的肿瘤细胞的T细胞受体的构建，包括分离当在HLA-A2复合物中结合时对肿瘤特异性蛋白具有特异性的抗体scFv，以及使用scFv作为合成T细胞受体中的域。Noyanetal.,CancerGeneTherapy19,352-3572012描述了通过慢病毒转导在造血干细胞和祖细胞中诱导的转基因表达，用于治疗实体瘤。Gallaetal.,Nuc.Ac.Res.39,1721-17312009描述了用于通过逆转录病毒颗粒转导细胞的转座酶的细胞毒性效应。DiStasietal.,NEnglJMed1673-16832011描述了通过引入编码胱天蛋白酶-9二聚体的序列以产生细胞中可诱导凋亡的系统来进行遗传操作。Longetal.,Diabetes,407-4152010描述了用于测量IL-2R的信号传导途径中的STAT5磷酸化的测定法。Hombachetal.,GeneTherapy1206-12132010描述了用于使T细胞针对特定抗原的CAR，所述CAR在scFv和跨膜域之间含有经修饰的IgG1Fc间隔物，所述跨膜域与信号传导域附着CD28-CD3ζ。发明目的本发明的目的是提供用于治疗HvG病的嵌合抗原受体CAR，其适于为Treg细胞提供对MHCI类，特别是对HLA-A*02或对CAR-SLA-01*0401的抑制物活性，其足够强以抑制表达MHCI类，例如HLA-A*02或SLA-01*0401的移植物的细胞毒性排斥，尤其是在HLA-A*02阴性的接受体患者中。发明详述本发明通过权利要求的特征实现了该目的，尤其是通过提供融合蛋白进行，所述融合蛋白是嵌合抗原受体CAR，尤其是含有对人HLA-A*02特异性的scFv域的CAR-A*02或含有对猪SLA-01*0401特异性的scFv域的CAR-SLA-01*0401，所述CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401用于治疗HvG病，例如用于治疗移植物接受体患者中的细胞毒性排斥反应。当CAR-A*02在人Treg细胞中在人HLA-A*02存在下表达时CAR-A*02提供细胞毒性T细胞的抑制。当在人Treg细胞中表达时CAR-A*02和表达CAR-A*02的人Treg细胞是用于治疗HvG病的药物化合物。相应地，当在人Treg细胞中表达时CAR-SLA-01*0401和表达CAR-SLA-01*0401的人Treg细胞是用于治疗HvG病的药物化合物，此时移植的组织是猪来源的并表达SLA-01*0401。在移植接受体的Treg细胞中表达后，CAR-SLA-01*0401具有抑制针对猪来源的移植物的HvG的优点。猪来源的移植物可以是例如胰腺组织，优选是胰岛。任选地，表达CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的Treg细胞经遗传操作以也表达FOXP3，优选组成性表达FOXP3，例如通过与导入编码CAR-A*02的核酸序列同时将编码人FOXP3的表达盒导入Treg细胞中。进一步任选地，除了为了表达FOXP3的Treg细胞的遗传操作之外或作为为了表达FOXP3的Treg细胞的遗传操作备选，在表达CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401之外还可以遗传操作Treg细胞以表达胱天蛋白酶-9个二聚体系统例如，如DiStasietal.,NEnglJMed1673-16832011所述，用于在转移到患者中后耗尽Treg细胞。FOXP3分别与融合蛋白CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的表达可以通过在一个统一的融合蛋白中表达P2A与C端融合的FOXP3的融合物，例如直接与CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的C端融合。此类融合物例如由适于产生编码CAR-P2A-FOXP3融合蛋白的一个统一mRNA的一个表达盒编码通过其从P2A域水解产生游离FOXP3。P2A-FOXP3的示例性融合物是SEQIDNO:22，其可以直接与融合蛋白的hCD3ζ域的C端融合。CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401分别是融合蛋白，所述融合蛋白包含下列各项或由下列各项组成：单链可变片段抗体域scFv、铰链、跨膜域、胞内hCD28信号传导域和胞内CD3信号传导域，也称为hCD3ζhCD3zeta域，所述域优选地从N端到C端彼此直接连接。在scFv域中，抗体的可变轻链通过铰链区连接至抗体的可变重链。CAR-A*02的特征在于选自SEQIDNO:1至SEQIDNO:12中之一的氨基酸序列的其scFv域，CD8铰链和CD8跨膜域，优选具有SEQIDNO:13的氨基酸序列，CD28信号传导域，优选具有SEQIDNO:14的氨基酸序列，和CD3信号传导域，具有SEQIDNO:15的氨基酸序列。CAR-SLA-01*0401的特征在于选自SEQIDNO:16至SEQIDNO:19中之一的氨基酸序列的其scFv域。由于根据本发明的信号传导域具有人或人源化氨基酸序列，因此这在本文中也用“h”指示。铰链可以由hΔFcIgG域形成，优选地由SEQIDNO:20形成。可以用CD8跨膜域、hCD28信号传导域和hCD3ζ信号传导域交换hCD28跨膜域、hCD28信号传导域和hCD3ζ信号传导域，优选SEQIDNO:21的融合物。CAR-A*02融合蛋白具有的优点在于它对HLA-A*02是高度特异的。CAR-SLA-01*0401融合蛋白具有的优点在于它对SLA-01*0401是高度特异性的。其在Tregs中的表达分别导致在HLA-A*02或SLA-01*0401存在下Treg增殖的增强，并导致增加的Teff效应T细胞抑制物活性。融合蛋白CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401可以在Treg中从表达盒中编码融合蛋白的核酸序列表达。任选地，编码融合蛋白CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的表达盒包含在病毒载体中以导入核酸序列，例如，通过使用含有病毒载体的病毒颗粒进行转导。对于体外产生表达CAR-A*02的Treg细胞，优选使用源自移植物接受体的Treg细胞，所述移植物接受体可以是未来的接受体或接受了移植物的接受体。Treg细胞是CD4+，CD25高和CD127低，并且必须从HLA-A*02阴性患者中分离，例如，通过细胞分选从血液样品中分离，例如使用FACS或具有特异性抗体的磁珠。对于体外产生表达CAR-SLA-01*0401的Treg细胞，优选使用源自移植物接受体的Treg细胞，其可以是未来的接受体或接受了移植物的接受体。Treg细胞是CD4+，CD25高和CD127低，并且必须分离，例如通过细胞分选从血液样品中分离，例如使用FACS或具有特异性抗体的磁珠。表达CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的Treg细胞的优点在于在引入患者之前和分别在引入编码CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的核酸序列之后，在将这些Treg细胞导入患者中之前不必需体外扩增。例如，在生产这些Treg细胞的过程中，不进行包括在培养基中在刺激剂的存在下培养这些Treg细胞的体外扩增。优选地，在引入编码CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的核酸序列后，将Treg细胞保持培养约24小时以允许表达CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401，然后进行细胞分选以分离表达CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的Treg细胞。在该培养物中，培养基中不存在用于扩增的刺激剂，例如没有抗CD3或抗CD28抗体。在该培养物中，培养基含有低剂量的IL-2，例如以50UmL培养基，以防止Treg细胞死亡。已经发现表达CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的Treg细胞有效迁移至移植物并且有效抑制针对移植物的细胞毒性应答并且表达CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的Treg细胞具有稳定的抑制活性。CAR-A*02的scFv域对HLA-A*02是非常特异的，并且迄今未发现交叉反应性或脱毒性。此外，没有发现CAR-A*02的内在活性或自身活化，排除了不依赖于HLA-A*02存在的抑制活性。发现表达CAR-A*02的Treg细胞的抑制活性明显高于幼稚TregnTreg细胞的抑制活性。可以通过将CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的编码序列在接触具有HLA-A*02或SLA-01*0401的供体前导入源自供体的Treg细胞，或者在接触HLA-A*02或SLA-01*0401的供体后导入源自供体，例如源自移植后的移植物接受体的Treg细胞中在用于产生在HLA-A*02或SLA-01*0401的存在下具有抑制活性的Treg细胞的方法中使用CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401。通常优选地，融合蛋白在其N端包含用于分泌融合蛋白的前导肽，以促进scFv域的跨膜转运和跨膜TM域在细胞膜间的排列。示例性前导序列是SEQIDNO:24，优选用于CAR-A*02，或SEQIDNO:25，优选用于CAR-SLA-01*0401。现在参考附图通过实施例更详细地描述本发明，其中-图1a示意性显示了适用于Treg细胞的逆转录病毒转导的编码根据本发明的CAR-A*02的核酸构建体，-图1b显示了在细胞膜中排列的CAR-A*02的示意性模型，-图1c显示FACS结果，指示细胞表面上CAR-A*02和比较对照CAR的表达，-图1d显示FACS结果，指示经转导的Treg表达CAR-A*02并特异性结合HLA-A*02，-图1e显示FACS结果，指示用CAR-A*02转导的Tregs不与HLA-A*01结合，-图1f显示了表面表达的FACS结果和对照CAR对PE的特异性，-图2a显示了未转导的Treg细胞和表达CAR-A*02的Treg细胞的CCR7,CD39,CD45RO,CD45RA,CTLA-4的FACS结果，-图2b显示表达CAR-A*02的Treg细胞和未转导的Treg细胞的STAT5磷酸化的FACS结果，-图2c显示了代表响应IL-2浓度的STAT5磷酸化的图，-图3a显示响应刺激细胞的表达CAR-A*02的Treg细胞活化的FACS结果，-图3b显示了响应特定刺激的表达CAR-A*02或对照CAR的Treg细胞的增殖和CD39表达的FACS结果，-图3c显示了在不同细胞比率下表达CAR-A*02的Treg细胞抑制T-效应细胞的图，*＝P汉诺威医学院布伦瑞克工业大学在治疗HvG病中使用的融合蛋白M1067PCTEP16177208.22016-06-3025BiSSAP1.3.61251PRT人工序列链1..123可变重链scFvKAZ15-C1链124..141接头链142..251可变轻链1GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyGlyThrPheSerSerTyr202530AlaIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyGlyIleIleProIlePheGlyThrAlaAsnTyrAlaGlnLysPhe505560GlnGlyArgValThrIleThrAlaAspGluSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgGlyGlyTyrAspSerArgGlySerTyrTyrTyrMetAspVal100105110TrpGlyLysGlyThrThrValThrValSerSerGlySerAlaSerAla115120125ProLysLeuGluGluGlyGluPheSerGluAlaArgValGlnSerVal130135140LeuThrGlnProProSerThrSerGlyThrProGlyGlnArgValThr145150155160IleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlyGlyAsnAlaValAsn165170175TrpTyrGlnHisPheProGlyThrAlaProThrLeuLeuIleTyrSer180185190AsnAsnGlnArgProSerGlyValProGluArgPheSerGlySerLys195200205SerGlyThrSerAlaSerLeuThrValSerGlyLeuGlnAlaGluAsp210215220GluAlaAspTyrTyrCysThrAlaTrpAspAspSerLeuArgGlyTyr225230235240LeuPheGlyThrGlyThrLysValThrValLeu2452502249PRT人工序列链1..123可变重链scFvKAZ15-F3链124..141接头链142..249可变轻链2GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyArg151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaValIleSerTyrAspGlySerAsnLysTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAspArgGluGluLeuLeuAlaLeuPheGlyGlyMetAspVal100105110TrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerGlySerAlaSerAla115120125ProLysLeuGluGluGlyGluPheSerGluAlaArgValGlnProVal130135140LeuThrGlnProSerSerValSerValAlaProGlyGlnThrAlaArg145150155160IleThrCysGlyGlyAsnAsnIleGlySerLysSerValHisTrpTyr165170175GlnGlnLysProGlyGlnAlaProValLeuValValTyrAspAspSer180185190AspArgProSerGlyIleProGluArgPheSerGlySerAsnSerGly195200205AsnThrAlaThrLeuThrIleSerArgValGluAlaArgAspGluAla210215220AspTyrTyrCysHisValTrpAspAlaLysThrAsnHisGlnValPhe225230235240GlyGlyGlyThrArgLeuThrValGln2453251PRT人工序列链1..123可变重链scFvSH1319-A5链124..141接头链142..251可变轻链3GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyGlyThrPheSerSerTyr202530AlaIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyGlyIleIleProIlePheGlyThrAlaAsnTyrAlaGlnLysPhe505560GlnGlyArgValThrIleThrAlaAspLysSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgProGlnSerArgTrpLeuGlnSerGlyAspAlaPheAspIle100105110TrpGlyGlnGlyThrMetValThrValSerSerGlySerAlaSerAla115120125ProLysLeuGluGluGlyGluPheSerGluAlaArgValGlnProVal130135140LeuThrGlnProArgSerValSerGlySerProGlyGlnSerValThr145150155160IleSerCysThrGlyThrSerSerAspValGlyGlyTyrAsnArgVal165170175SerTrpTyrGlnGlnThrProGlyThrAlaProLysLeuMetIleTyr180185190GluValSerAsnArgProSerGlyValSerAsnArgPheSerGlySer195200205LysSerGlyAsnThrAlaSerLeuThrIleSerGlyLeuGlnAlaGlu210215220AspGluAlaAspTyrTyrCysSerSerTyrThrSerSerSerThrVal225230235240ValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu2452504246PRT人工序列链1..119可变重链scFvSH1313-B8链120..137接头链138..246可变轻链4GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530AlaMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnArgLeuGluTrpMet354045GlyArgIleAsnAlaGlyAsnGlyAsnThrLysTyrSerGlnLysPhe505560GlnGlyArgValThrIleThrArgAspThrSerAlaSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAspLeuThrGlyThrLeuLeuPheAspTyrTrpGlyGlnGly100105110ThrLeuValThrValSerSerGlySerAlaSerAlaProLysLeuGlu115120125GluGlyGluPheSerGluAlaArgValGlnSerValLeuThrGlnPro130135140ProSerAlaSerGlyThrProGlyGlnArgValThrIleSerCysSer145150155160GlySerSerSerAsnIleGlySerAsnGlyValLysTrpTyrGlnGln165170175LeuProGlyThrAlaProLysLeuValIleTyrArgAspTyrGlnArg180185190ProSerGlyValProAspArgPheSerGlySerLysSerGlyThrSer195200205AlaSerLeuAlaIleSerGlyLeuGlnSerGluAspGluAlaLysTyr210215220TyrCysAlaAlaTrpAspAspSerLeuAsnValValPheGlyGlyGly225230235240ThrGlnLeuThrValLeu2455251PRT人工序列链1..123可变重链scFvSH1319-B11链124..141接头链142..251可变轻链5GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyGlyThrPheSerSerTyr202530AlaIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyGlyIleIleProIlePheGlyThrAlaAsnTyrAlaGlnLysPhe505560GlnGlyArgAlaThrIleThrAlaAspGluSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgArgAlaGluArgTrpLeuHisLeuSerGlyAlaPheAspIle100105110TrpGlyGlnGlyThrMetValThrValSerSerGlySerAlaSerAla115120125ProLysLeuGluGluGlyGluPheSerGluAlaArgValGlnProVal130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权利要求：1.融合蛋白，所述融合蛋白包含单链可变片段抗体域scFv、铰链、跨膜域、胞内hCD28信号传导域和胞内hCD3ζhCD3zeta信号传导域，形成对HLA-A*02具有特异性的嵌合抗原受体CAR-A*02或者对SLA-01*0401具有特异性的嵌合抗原受体CAR-SLA-01*0401，用于治疗患者中的HvG病，所述融合蛋白的特征在于所述单链可变片段抗体域scFv具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDNO:1至SEQIDNO:12或SEQIDNO:16至SEQIDNO:19。2.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于所述铰链和所述跨膜域具有SEQIDNO:13的氨基酸序列，所述hCD28信号传导域具有SEQIDNO:14的氨基酸序列，并且所述hCD3ζhCD3zeta信号传导域具有SEQIDNO:15的氨基酸序列。3.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于所述铰链是具有SEQIDNO:20的氨基酸序列的hΔFcIgG域。4.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于所述铰链和作为CD8跨膜域的所述跨膜域具有SEQIDNO:13的氨基酸序列，所述hCD28信号传导域具有SEQIDNO:14的氨基酸序列，并且所述hCD3ζ域具有SEQIDNO:15的氨基酸序列，或者包含hCD3ζ信号传导域的hCD28信号传导域具有SEQIDNO:21的氨基酸序列。5.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于它在CD4+CD25+CD127低HLA-A*02阴性人调节TTreg细胞中表达。6.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于所述患者为HLA-A*02阴性，并且所述患者含有或意图含有HLA-A*02阳性的实体组织移植物。7.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于所述患者是人并且含有或意图含有SLA-01*0401阳性的实体组织移植物。8.根据权利要求7的融合蛋白，其特征在于所述组织移植物包含猪胰岛细胞。9.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于它从N端至C端包含下列各项或由下列各项组成：一个具有选自由SEQIDNO:1至SEQIDNO:12组成的组的氨基酸序列的scFv域、具有SEQIDNO:13的氨基酸序列的铰链和跨膜域、具有SEQIDNO:14的氨基酸序列的hCD28信号传导域、和具有SEQIDNO:15的氨基酸序列的hCD3ζhCD3zeta信号传导域。10.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于它从N端至C端包含下列各项或由下列各项组成：一个具有选自由SEQIDNO:16至SEQIDNO:19组成的组的氨基酸序列的scFv域、具有SEQIDNO:20的氨基酸序列的作为铰链的hΔFcIgG域、hCD28跨膜域和hCD28hCD3信号传导域，具有SEQIDNO:21的氨基酸序列。11.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于它从编码任选具有另外的N端分泌前导肽的所述融合蛋白的核酸序列表达。12.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于它从编码所述融合蛋白的核酸序列表达，所述融合蛋白具有另外的N端分泌前导肽和具有SEQIDNO:22的氨基酸序列的另外的C端P2A-hFOXP3。13.根据权利要求11-12中之一的融合蛋白，其特征在于所述前导肽具有选自SEQIDNO:24和SEQIDNO:25的氨基酸序列。14.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于在HLA-A*02阳性实体组织存在下或在SLA-01*0401阳性实体组织的存在下向CD4+CD25+CD127低HLA-A*02阴性人调节性TTreg细胞提供抑制物活性。15.根据权利要求13的融合蛋白，其特征在于提供归巢至CD4+CD25+CD127低HLA-A*02阴性人调节TTreg细胞中的次级淋巴样器官的能力。16.在HLA-A*02阳性实体组织的存在下或在SLA-01*0401阳性实体组织的存在下提供具有抑制物活性的人调节性TTreg细胞的方法，所述方法包括以下步骤：a.从血液样品分离CD4+CD25+CD127低人调节TTreg细胞以产生分离的Treg细胞，b.将编码并表达根据权利要求1-15中之一的融合蛋白的核酸序列导入分离的Treg细胞中以产生表达所述融合蛋白的Treg细胞，其中不在体外培养中扩增表达所述融合蛋白的所述Treg细胞。17.根据权利要求16的方法，其特征在于分离所述人调节性T细胞是分离HLA-A*02阴性人调节性T细胞。18.在SLA-01*0401阳性实体组织存在下提供具有抑制物活性的人调节性TTreg细胞的方法，其包括以下步骤：a.从血液样品中分离CD4+CD25+CD127低人调节性TTreg细胞以产生分离的Treg细胞，b.将编码并表达根据权利要求1-15中之一的融合蛋白的核酸序列导入分离的Treg细胞中以产生表达所述融合蛋白的Treg细胞，其中不在体外培养中扩增表达所述融合蛋白的所述Treg细胞。19.根据权利要求16-18中之一的方法，其特征在于所述核酸序列包含在逆转录病毒载体中，所述逆转录病毒载体包装在逆转录病毒颗粒中并通过转导导入所述分离的Treg细胞中。20.根据权利要求16-19中之一的方法，其特征在于在步骤b之后，将所述Treg细胞保持培养24小时，然后分离表达所述融合蛋白的Treg细胞。21.根据权利要求20的方法，其特征在于所述Treg细胞在含有低剂量IL-2的培养基中保持培养，所述培养基不含刺激Treg细胞扩增的试剂。

百度查询： 汉诺威医学院 布伦瑞克工业大学 在治疗HvG病中使用的融合蛋白