申请/专利权人：上海泰坦科技股份有限公司

申请日：2019-07-18

公开（公告）日：2023-06-06

公开（公告）号：CN110339209B

主分类号：A61K35/16

分类号：A61K35/16

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.06.06#授权;2019.11.12#实质审查的生效;2019.10.18#公开

摘要：本发明提供了一种去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法，所述方法包括以下步骤：1将小牛血清使用阴离子交换树脂进行吸附，收集流出的小牛血清；2将步骤1经过吸附后的小牛血清进行层析吸附，得到第二次吸附后的小牛血清；3将步骤2中得到的经过第二次吸附后的小牛血清进行超滤，得到去甲状腺结合蛋白的小牛血清；本发明能够实现小牛血清中甲状腺素T3，T4的的基本去除，不干扰测定，最终得到的小牛血清中TT3含量为0.85pmolL～0.96pmolL，TT4含量为1.33pmolL～1.44pmolL，生产成本可接受，可实现工业化。

主权项：1.一种去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1将小牛血清使用阴离子交换树脂进行吸附，收集流出的小牛血清；2将步骤1经过吸附后的小牛血清进行层析吸附，得到第二次吸附后的小牛血清；3将步骤2中得到的经过第二次吸附后的小牛血清进行超滤，得到去甲状腺结合蛋白的小牛血清；所述小牛血清在阴离子交换树脂中的流速为5～30mLmin；步骤3中超滤膜的孔径为0.5μm～5μm；步骤1中所述阴离子交换树脂的型号为D201大孔阴离子交换树脂；步骤2中所述层析为使用DEAE-Sephadex-50进行层析。

全文数据：一种去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法技术领域本发明属于生物分离领域，涉及一种去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法。背景技术小牛血清中甲状腺素T3，T4在血清中的存在方式主要有两种形式，一种是游离的，一种是以和甲状腺结合蛋白结合的形式存在。血清中游离的T3，T4血清可用活性碳吸附去除，但血清中和甲状腺结合蛋白结合的甲状腺素T3,T4难以去除。主要是血清中含有几百种蛋白，某个特定蛋白去除难度大，成本也非常高。CN100531723A公开了注射用小牛血清去蛋白提取物及其制备方法，该小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂，含有下述重量份数比的组分：小牛血清去蛋白提取物干物质1份；甘露醇9-11份；小分子右旋糖苷4.5-5.5份。本发明的小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂克服了水针和输液质量不稳定的缺陷，延长产品有效期，扩展临床应用，降低不良反应发生的几率。CN100473387A公开了一种小牛血清去蛋白注射液及其生产方法，该注射液是按照如下方法制备的：1去除小牛血清中的蛋白，然后进行粗滤，收集滤液；2对所述滤液依次用甲苯、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，每次萃取中弃去有机相保留水相；3对所述水相采用BIO-GEL-P2凝胶进行层析，得到小牛血清去蛋白注射液。所述小牛血清去蛋白注射液的活性成分为多糖，所述多糖的含量为1.0-1.2mgmL，优选为1.17mgmL。这种方法仅用凝胶层析，不能够将蛋白去除彻底。CN102805754A公开了一种小牛血清去蛋白提取物的纯化方法，该方法包括：采幼牛静脉血，分离出血清，用乙醇去蛋白，减压去除乙醇，加入复合蛋白酶水解，水解之后离心分离留上清，上清液超滤；超滤液先以葡聚糖G-15凝胶层析脱盐，收集280nm处有特异吸收的洗脱部分；以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离，收集第二个280nm处有特异吸收的洗脱部分；采用微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活；得到小牛血清去蛋白提取物。这种方法仅采用凝胶层析和超滤的步骤结合，虽然除掉了很多非活性成份，降低产物的分子量范围和发生不良反应的几率，提高了产品的纯度、安全性和生物活性，但是去除的效果仍有待加强。因此，如何开发一种高效去除小牛血清中甲状腺素T3、T4的方法，对于小牛血清的应用具有重要的意义。发明内容针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法，以达到高效率去除甲状腺结合蛋白的目的。为达此目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供了一种去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法，所述方法包括以下步骤：1将小牛血清使用阴离子交换树脂进行吸附，收集流出的小牛血清；2将步骤1经过吸附后的小牛血清进行层析吸附，得到第二次吸附后的小牛血清；3将步骤2中得到的经过第二次吸附后的小牛血清进行超滤，得到去甲状腺结合蛋白的小牛血清。本发明提供的去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法，采用离子交换的方法，先去除大部分甲状腺结合蛋白，再加上亲和层析，将甲状腺结合蛋白几乎完全去除，实现小牛血清中甲状腺素T3，T4的的基本去除，不干扰测定，生产成本可接受，可实现工业化。在本发明中，小牛血清中的甲状腺结合蛋白是酸性蛋白，等电点pH值为5.1，在阴离子交换树脂上可被吸附，血清中的主要蛋白成分，如白蛋白等，在确定的条件下，基本不吸附。通过步骤1的层析在去除血清中大部分甲状腺结合蛋白，达到去除血清中T3，T4的目的，同时保留了血清中的主要蛋白成分。强阴离子交换树脂的吸附，可以去除95％的甲状腺结合蛋白，实现T3，T4基本去除。本发明中，经过阴离子交换树脂吸附过的稀释血清，通过进一步层析吸附，将残余的5％牛甲状腺结合蛋白几乎去除完全。步骤2中的层析成本是工艺中最高的一步。但是吸附效果好，再生后可反复使用50次，从产业化角度讲，实现了产品制备的成本可控。为顺利进行前面的两步层析吸附，起始用于阴离子吸附的小牛血清，先进行稀释，以降低蛋白浓度和聚合物生成，保证蛋白的层析行为不受蛋白的粘度和分子间结合的影响。两步层析吸附后的稀释血清，蛋白浓度低于血清的蛋白浓度几倍，进一步采用超滤的方法将吸附后的血清的蛋白浓缩，达到或接近正常小牛血清的浓度，除菌过滤，分装，成无甲状腺素T3、T4的血清产品。在前期研究中发现血清中游离的甲状腺素T3、T4在第一步阴离子吸附过程中也同时被去除，是由于阴离子交换树脂的疏水骨架可能通过疏水作用，将疏水性的甲状腺素T3、T4吸附掉。一般来说，小牛血清的TT3均值为2.3nmolL，TT4为90nmolL和人的接近，游离的均值为FT3为20pmolL，FT4为1.07nmolL。而使用本发明的方法，最终达到可以使得TT3含量在1pmolL以下，TT4的含量在1.5pmolL以下。其中，TT3为总三碘甲腺原氨酸，TT4为总甲状腺素，FT3为游离三碘甲腺原氨酸，FT4为游离甲状腺素。在本发明中，小牛血清一般使用水进行稀释即可。优选地，步骤1中所述吸附前，将小牛血清进行稀释。优选地，所述稀释的稀释倍数为2～6倍，例如可以是2倍、3倍、4倍、5倍或6倍等，优选为4～5倍。优选地，步骤1中所述阴离子交换树脂的型号为D201大孔阴离子交换树脂。优选地，所述小牛血清在阴离子交换树脂中的流速为5～30mLmin，例如可以是5mLmin、6mLmin、7mLmin、8mLmin、10mLmin、12mLmin、15mLmin、20mLmin、25mLmin、28mLmin或30mLmin等。优选地，步骤2中所述层析为使用DEAE-Sephadex-50进行层析。优选地，所述DEAE-Sephadex-50的用量为小牛血清质量的0.02～0.5倍，例如可以是0.02倍、0.05倍、0.08倍、0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍或0.5倍等。在本发明中，使用较少的用量即可实现良好的层析效果。优选地，步骤3中所述超滤膜的孔径为0.5μm～5μm，例如可以是0.5μm、0.8μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm或5μm等。优选地，步骤3中所述超滤后还包括除菌过滤的步骤。优选地，步骤3中所述除菌过滤后还包括将得到的小牛血清进行分装，然后在-20℃冷冻保存的步骤。优选地，所述制备方法包括以下步骤：1将小牛血清进行稀释2～6倍，使用D201大孔阴离子交换树脂进行吸附，控制小牛血清的流速为5～30mLmin，收集流出的小牛血清；2将步骤1经过吸附后的小牛血清使用DEAE-Sephadex-50进行层析吸附，DEAE-Sephadex-50的用量为小牛血清质量的0.02～0.5倍，得到第二次吸附后的小牛血清；3将步骤2中得到的经过第二次吸附后的小牛血清使用孔径为0.5μm～5μm的超滤膜进行超滤，然后除菌过滤，分装后在-20℃下冷冻保存，得到去甲状腺结合蛋白的小牛血清。本发明将纯化后牛甲状腺结合蛋白，作为抗原，免疫小鼠制备了牛甲状腺结合蛋白的单克隆抗体，用小鼠制备腹水，纯化抗体，再和琼脂糖凝胶进行偶联。相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明提供的去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法，采用离子交换的方法，先去除大部分甲状腺结合蛋白，再加上亲和层析，将甲状腺结合蛋白几乎完全去除，实现小牛血清中甲状腺素T3，T4的的基本去除，不干扰测定，最终得到的小牛血清中TT3含量为0.85pmolL～0.96pmolL，TT4含量为1.33pmolL～1.44pmolL，生产成本可接受，可实现工业化。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。实施例1本实施例提供一种去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法1将小牛血清进行稀释3倍，使用D201大孔阴离子交换树脂进行吸附，控制小牛血清的流速为25mLmin，收集流出的小牛血清；2将步骤1经过吸附后的小牛血清使用DEAE-Sephadex-50进行层析吸附，DEAE-Sephadex-50的用量为小牛血清质量的0.05倍，得到第二次吸附后的小牛血清；3将步骤2中得到的经过第二次吸附后的小牛血清使用孔径为3μm的超滤膜进行超滤，然后除菌过滤，分装后在-20℃下冷冻保存，得到去甲状腺结合蛋白的小牛血清。实施例2本实施例提供一种去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法1将小牛血清进行稀释2倍，使用D201大孔阴离子交换树脂进行吸附，控制小牛血清的流速为5mLmin，收集流出的小牛血清；2将步骤1经过吸附后的小牛血清使用DEAE-Sephadex-50进行层析吸附，DEAE-Sephadex-50的用量为小牛血清质量的0.02倍，得到第二次吸附后的小牛血清；3将步骤2中得到的经过第二次吸附后的小牛血清使用孔径为0.5μm的超滤膜进行超滤，然后除菌过滤，分装后在-20℃下冷冻保存，得到去甲状腺结合蛋白的小牛血清。实施例3本实施例提供一种去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法1将小牛血清进行稀释6倍，使用D201大孔阴离子交换树脂进行吸附，控制小牛血清的流速为30mLmin，收集流出的小牛血清；2将步骤1经过吸附后的小牛血清使用DEAE-Sephadex-50进行层析吸附，DEAE-Sephadex-50的用量为小牛血清质量的0.5倍，得到第二次吸附后的小牛血清；3将步骤2中得到的经过第二次吸附后的小牛血清使用孔径为5μm的超滤膜进行超滤，然后除菌过滤，分装后在-20℃下冷冻保存，得到去甲状腺结合蛋白的小牛血清。实施例4本实施例提供一种去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法1将小牛血清进行稀释4倍，使用D201大孔阴离子交换树脂进行吸附，控制小牛血清的流速为20mLmin，收集流出的小牛血清；2将步骤1经过吸附后的小牛血清使用DEAE-Sephadex-50进行层析吸附，DEAE-Sephadex-50的用量为小牛血清质量的0.04倍，得到第二次吸附后的小牛血清；3将步骤2中得到的经过第二次吸附后的小牛血清使用孔径为4μm的超滤膜进行超滤，然后除菌过滤，分装后在-20℃下冷冻保存，得到去甲状腺结合蛋白的小牛血清。实施例5本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中步骤1中的流速为2mLmin。实施例6本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中步骤1中的流速为35mLmin。实施例7本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中步骤3中超滤膜的孔径为0.1μm。实施例8本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中步骤3中超滤膜的孔径为6μm。对比例1本对比例与实施例1的区别在于，本对比例中包括步骤1。对比例2本对比例与实施例1的区别在于，本对比例中包括步骤2。对比例3本对比例与实施例1的区别在于，本对比例中包括步骤3。将实施例1-8和对比例1-3中的小牛血清进行TT3和TT4含量检测，结果如下表1所示：表1综合表1中的数据可知，本发明提供的去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法去除效果非常好，最终测定的TT3含量在0.85pmolL～0.96pmolL，TT4含量在1.33pmolL～1.44pmolL，含量非常低。而如果步骤1中流速、步骤3中的滤膜孔径发生变化后，会影响去除的效果；如果缺少3个步骤中任意一个步骤，去除效果大幅下降，不利于实际生产和批量供应。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

权利要求：1.一种去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1将小牛血清使用阴离子交换树脂进行吸附，收集流出的小牛血清；2将步骤1经过吸附后的小牛血清进行层析吸附，得到第二次吸附后的小牛血清；3将步骤2中得到的经过第二次吸附后的小牛血清进行超滤，得到去甲状腺结合蛋白的小牛血清。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述吸附前，将小牛血清进行稀释；优选地，所述稀释的稀释倍数为2～6倍；优选为4～5倍。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述阴离子交换树脂的型号为D201大孔阴离子交换树脂。4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述小牛血清在阴离子交换树脂中的流速为5～30mLmin。5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述层析为使用DEAE-Sephadex-50进行层析。6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述DEAE-Sephadex-50的用量为小牛血清质量的0.02～0.5倍。7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述超滤膜的孔径为0.5μm～5μm。8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述超滤后还包括除菌过滤的步骤。9.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述除菌过滤后还包括将得到的小牛血清进行分装，然后在-20℃冷冻保存的步骤。10.根据权利要求1-9中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：1将小牛血清进行稀释2～6倍，使用D201大孔阴离子交换树脂进行吸附，控制小牛血清的流速为5～30mLmin，收集流出的小牛血清；2将步骤1经过吸附后的小牛血清使用DEAE-Sephadex-50进行层析吸附，DEAE-Sephadex-50的用量为小牛血清质量的0.02～0.5倍，得到第二次吸附后的小牛血清；3将步骤2中得到的经过第二次吸附后的小牛血清使用孔径为0.5μm～5μm的超滤膜进行超滤，然后除菌过滤，分装后在-20℃下冷冻保存，得到去甲状腺结合蛋白的小牛血清。

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