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申请/专利权人：中国林业科学研究院经济林研究所

摘要：本发明公开与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记及其检测引物、方法与应用，在西伯利亚杏的6号染色体中存在与西伯利亚杏花期早晚相关7个SNP标记，设计与检测西伯利亚杏花期早晚的6对引物，通过6对引物进行PCR扩增，检测西伯利亚杏的6号染色体中与西伯利亚杏花期早晚相关的标记位点，并测序标记位点的基因型，从而判定西伯利亚杏花期早晚。通过对我国西伯利亚杏的全基因组关联分析发现位点与西伯利亚杏开花期早晚显著相关，并进一步针对该位点开发标记，提供检测西伯利亚杏开花期早晚的方法及专用引物，本发明提供的引物可以特异检测西伯利亚杏中位点的基因型,也可以作为不同花期育种中的标记辅助选择的新工具，具有非常重要的积极意义。

主权项：1.与西伯利亚杏开花期早晚相关的检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）提取基因组DNA：以西伯利亚杏材料为检测样品，提取基因组DNA；（2）进行PCR扩增：以提取的西伯利亚杏DNA为模板，利用引物对Primer1-Primer6分别进行PCR产物扩增，得到扩增产物；（3）PCR产物回收：使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物；（4）进行一代测序，判定西伯利亚杏开花期早晚；在步骤（2）中：所述Primer1的正向引物和反向引物的序列分别为SQEIDNO:1和SQEIDNO:2；所述Primer2的正向引物和反向引物的序列分别为SQEIDNO:3和SQEIDNO:4；所述Primer3的正向引物和反向引物的序列分别为SQEIDNO:5和SQEIDNO:6；所述Primer4的正向引物和反向引物的序列分别为SQEIDNO:7和SQEIDNO:8；所述Primer5的正向引物和反向引物的序列分别为SQEIDNO:9和SQEIDNO:10；所述Primer6的正向引物和反向引物的序列分别为SQEIDNO:11和SQEIDNO:12；PCR产物的凝胶电泳图显示，获得含有与西伯利亚杏开花期早晚相关的片段，分别为：若加入引物为Primer1，则得到长度为227bp的含Ps-FT-SNP1和Ps-FT-SNP2标记的西伯利亚杏F106基因组的6号染色体的片段18103605-18103831，若加入引物为Primer2，则得到长度为158bp的含Ps-FT-SNP3标记的西伯利亚杏F106基因组的的6号染色体的片段18104056-18104213，若加入引物为Primer3，则得到长度为198bp的含Ps-FT-SNP4标记的西伯利亚杏F106基因组的的6号染色体的片段18104977-18105174，若加入引物为Primer4，则得到长度为219bp的含Ps-FT-SNP5标记的西伯利亚杏F106基因组的的6号染色体的片段18106219-18106437，若加入引物为Primer5，则得到长度为240bp的含Ps-FT-SNP6标记的西伯利亚杏F106基因组的的6号染色体的片段18106550-18106789，若加入引物为Primer6，则得到长度为387bp的含Ps-FT-SNP7标记的西伯利亚杏F106基因组的的6号染色体的片段18107035-18107421；在步骤（4）中：若使用Primer1进行PCR扩增，对PCR产物进行测序，Primer1检测得到的PCR产物的序列长度为227bp，若位于该序列自5’端起的第165位碱基为G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP1位点的基因型为GG；若位于该序列自5’端起的第165位碱基为G或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP1位点的基因型为GA或AA；若位于该序列自5’端起的第183位碱基为G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP2位点的基因型为GG；若位于该序列自5’端起的第183位碱基为G或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP2位点的基因型为GA或AA；所述长度为227bp的序列为：TTTCACCGTACAAGCTCTGCCTGGGCGCCATGTGTCGACATCTGATACTTGTCTCTGGGAAAAGGCTAGACTATGCTAGTTGATGATGAATAAAAAAGGGATGCTTGGGCACACGAGTGGTGTCTGGGGTGGAACACAACATCGTGCGTGGCTATTGTCCCTATnGGAGACACACAGGCCAGnGCCTATGTGTTTCTCCATCGGACACGTCGGTTCTGATGCCATTT，其中n为G或A；若使用Primer2进行PCR扩增，对PCR产物进行测序，Primer2检测得到的PCR产物的序列长度为158bp，若位于该序列自5’端起的第85位碱基为T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP3位点的基因型为TT；若位于该序列自5’端起的第85位碱基为T或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP3位点的基因型为TA或AA；所述长度为158bp的序列为：AACAGACATGCATGCAGACATTGTTAAGAAAGAAAGACAATAAAAGCATAGATTTAGGCGAAGAACACGGAATCACTTTTGGATnGAGAAAAGGGTTTCTTTATACTTGGATTTTTGTTCTGTTTCAGAGCATCTCTAACTCCAAAATCCTGCTGCAG，其中n为T或A；若使用Primer3进行PCR扩增，Primer3检测得到的PCR产物的序列长度为198bp，若位于该序列自5’端起的第74位碱基为T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP4位点的基因型为TT；若位于该序列自5’端起的第74位碱基为T或G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP4位点的基因型为TG或GG；所述长度为198bp的序列为：CGCACACTCTCTCCAAAACACAAAACAATGGGAGAAATCTGAAAACTGGTTAAGCATTCCATGGTATGTGTTTnAAAAAACTTAAAGTATTGAGAGAGCAATTGACTATAAGACATTAATTCAGCCCCCATTTTGGTGTTTTAGTGAAACTCCCTTATTTTCTTGGGTTATTTTCTTGACCGTAGGGACTAATGGTGC，其中n为T或G；若使用Primer4进行PCR扩增，Primer4检测得到的PCR产物的序列长度为219bp，若位于该序列自5’端起的第151位碱基为G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP5位点的基因型为GG；若位于该序列自5’端起的第151位碱基为G或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP5位点的基因型为GA或AA；所述长度为219bp的序列为：GTGTTGGTGGTGTAGGCTTGGAGTTTACTGGTGGTTGGCTTCTACGAGTTCTTGGCTTAAATGGATATGTTGCTTTCTAGGACCCTTGGTGTTGGGCATGATTTTCAATGGATAGGGTTGTTGGTTGCAATCTATGTTCCCATCTCTCCAnGTAATTTTGTGGTGGGGATTTGACATTTAGGTGGTGTTAGAGCCTTCGGGCAACACTCTGACCTCTCA；其中n为G或A；若使用Primer5进行PCR扩增，Primer5检测得到的PCR产物的序列长度为240bp，若位于该序列自5’端起的第89位碱基为T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP6位点的基因型为TT；若位于该序列自5’端起的第89位碱基为T或C，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP6位点的基因型为TC或CC；所述长度为240pb的序列为：GGCTTGGCATCCGATACATGTTCATACTATGATGCCCTTCCATTAGAAGTTCGTCACGCTAAGAGGCCAATATGGATCCCCCATGGCCnGTCGAGTAAGGGTCTAGATTAAGATTCATGGAGTTGGTATTGGTACTTATGCTGGATATGCTTTGACACTCATAACACATTGTTATGTACATCGAACTATCCATGCATAGGAGTTTTTCTTTGACAGTCTTACGTTGTGGTGGGTTGTTT；其中n为T或C；若使用Primer6进行PCR扩增，Primer6检测得到的PCR产物的序列长度为387bp，若位于该序列自5’端起的第185位碱基为C，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP7位点的基因型为CC；若位于该序列自5’端起的第185位碱基为C或T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP7位点的基因型为CT或TT；所述长度为387bp的序列为：CCAAATTGGCATGTGTCGGACTCTCTTGTTAGTCCAAGACATGTGTTGTATTCTTTCCTACCATGGGGTTTGTCCCATGTGATTTTCCTATAAAGGTTTTAATAAGGCCGTTGTTTCGTGCCCGTCTTTGTATGTCTCTTTGGATTATGAATGAAATCCTTTTCTAAAACTATCATTGACATTAnGTGCCCATTAAAACTATCAATTACTTTAGCCTTTCTAGTATAAAGAGTAGCTCAAAATATGCACTTGTAGTCATTTTAATATTATTAATGAGTAATGGAAAAGACAAATCAGCAATTAGTCTAATGTTACTTCTCTTCTTAACATTCCGTATCCTATTGGCAAACATAAGTTATAAGCTTAATCCCGAATCGCATGTCTTTG；其中n为C或T；将步骤（4）得到的测序结果，与参考序列进行比对，判定西伯利亚杏的花期：若Ps-FT-SNP1的基因型为GG，Ps-FT-SNP2基因型为GG，Ps-FT-SNP3的基因型为TT，Ps-FT-SNP4基因型为TT，Ps-FT-SNP5基因型为GG，Ps-FT-SNP6基因型为TT，Ps-FT-SNP7基因型为CC，则判定待测西伯利亚杏为早花；若Ps-FT-SNP1的基因型为GA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；若Ps-FT-SNP2基因型为GA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；若Ps-FT-SNP3的基因型为TA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；若Ps-FT-SNP4基因型为TG或GG，则判定待测西伯利亚杏为晚花；若Ps-FT-SNP5基因型为GA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；若Ps-FT-SNP6基因型为TC或CC，则判定待测西伯利亚杏为晚花；若Ps-FT-SNP7基因型为CT或TT，则判定待测西伯利亚杏为晚花；所述西伯利亚杏样品为万家沟15、巴林右旗24、科右45、科左33、克什克腾22、万家沟17、山杏3号、科左38、扎鲁特08、乌拉山08或克什克腾05。

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百度查询： 中国林业科学研究院经济林研究所 与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记及其检测引物、方法与应用