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申请/专利权人：浙江泛亚生物医药股份有限公司

摘要：本发明提供一种蝉花单17‑7‑1菌株的鉴定方法，包括提取待检测菌株的DNA；对待检测菌株DNA采用引物S11进行PCR扩增；获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后获得待检测菌株的RAPD条带图谱；将获得的待检测菌株RAPD图谱进行分析获得判定结果。采用本发明鉴定方法，可快速、准确的鉴定蝉花单17‑7‑1菌株。

主权项：1.一种蝉花单17-7-1菌株的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1，提取待检测菌株的DNA；步骤2，对步骤1获得的待检测菌株DNA采用引物进行PCR扩增，引物序列为SEQIDNO：1；步骤3，将步骤2获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后获得待检测菌株的RAPD条带图谱；步骤4，将步骤3获得的待检测菌株RAPD图谱进行分析获得判定结果；所述步骤4中，将步骤3获得的RAPD条带图谱进行分析，待检测菌株在3000bp~2000bp之间具有一条条带，鉴定待检测菌株为蝉花菌株单17-7-1菌株；所述蝉花单17-7-1菌株的保藏号为CGMCCNo.3453。

全文数据：一种蝉花菌株的RAPD分子标记鉴定方法技术领域本发明涉及一种蝉花菌株的鉴定方法，属于分子生物学技术领域。背景技术蝉花，别名虫花，是某些蝉若虫受蝉花寄生后的产物，是一种菌虫复合体。此菌于1838年由Miquel定名为蝉棒束孢霉Isariacicadae。此后出现多种同物异名，如蝉草Cordycepscicadae，辛克莱球壳孢Sphaeriasinclairii，辛克莱虫草Cordycepssinclairii，辛克莱棒束孢Isariasinclairii，基生棒束孢Isariabasili，丛生虫壳菌Torrubiacaespitosa，哈里棒束孢Isariahariottii，小蝉茸Cordycepssobolifera，蒙克苏棒束孢Isariamokanshawii和多枝棒束孢Isariaarbuscula等等。常采到的是蝉花及其寄主山蝉若虫寄生后的复合体。根据历史产区浙江的1467份样品的调查，药材蝉花主要是蝉花寄生后的虫菌复合体。蝉花属半知菌类真菌，其子实体自虫体头部长出，单生或丛聚成束，浅黄色，长1.5～8.0cm，前端膨大，呈纺锤形或呈鸡冠花状。该蝉花采用如下方法进行培养：从液氮中取出蝉花单17-7-1和其他不同地域蝉花的保藏样品，在超净工作台上将其接到PSA斜面培养基上，22℃-25℃培养10d，然后在超净工作台将PSA斜面培养基中长好的蝉花接到SAAY液体培养基中，22℃-25℃摇菌24h，收集菌丝并液氮速冻，-80℃保存备用。蝉花单17-7-1的主要形态特征为：在PDA培养基上25℃培养10d，菌落圆形，平展，初絮状，后粉状，白色至浅黄色，直径5～6cm。菌丝无色，分枝，具有隔膜，宽1.2～2.5μm。分生孢子梗多分枝，宽3.0～5.5μm，由每轮2～5个个产孢细胞组成轮状分枝。产孢细胞瓶形，基部球状膨大，向上变细窄，4.5～6.5×2.5～3.5μm。分生孢子圆柱形，单细胞，无色，平滑，链生，直或弯曲，6.5～8.8～11.0×2.5～3.5μm。蝉花单17-7-1经实验验证，其培养物具有易于培养、产量高的特点，具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功能，因此具有广泛的工业化应用价值。由于地理来源不同、寄主不同的蝉花，其次生代谢产物方面具有较大的变异性。本专利的目的是利用RAPD分子标记技术鉴定蝉花单17-7-1菌株和其他不同地域蝉花的区别。发明内容本发明的目的在于提供蝉花单17-7-1菌株的鉴定方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种蝉花单17-7-1菌株的鉴定方法，该方法包括如下步骤：步骤1，提取待检测菌株的DNA；步骤2，对步骤1获得的待检测菌株DNA采用下列引物进行PCR扩增，S11：GTAGACCCGTSEQIDNO：1；步骤3，将步骤2获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后获得待检测菌株的RAPD条带图谱；步骤4，将步骤3获得的待检测菌株RAPD图谱进行分析获得判定结果。进一步的，所述步骤2所采用的PCR扩增反应体系如下：总体积50μL，DNA样本：50ng，dNTP：6nmol，引物：20pmol，Taq酶：2U，Buffer：5μL，加ddH2O至50μL。进一步的，所述步骤2所采用的PCR扩增反应条件如下：先95℃5分钟；然后依次95℃40秒，38℃1分钟，72℃2分钟，共循环40次；然后72℃延伸10分钟，最后降温至4℃保存。进一步的，所述步骤4中，将步骤3获得的RAPD条带图谱进行分析，如果待检测菌株在3000bp～2000bp之间具有一条条带，则鉴定待检测菌株为蝉花菌株单17-7-1菌株。本发明涉及的蝉花菌株为浙江泛亚生物医药股份有限公司所有，编号为单17-7-1已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC注册保藏，保藏号为CGMCCNo.3453。本发明有益效果：本发明通过筛选大量的随机引物最终获得本发明引物，该引物具有非常高的特异性，具有唯一的特异性条带在3000bp～2000bp之间，能很好的区分生产菌株单17-7-1和其他不同地域蝉花。由于目前其他菌株并未进行过全基因组测序，如果要从整个基因组区分不同地域蝉花分子水平的不同，则需要对其他不同地域蝉花进行重测序每个样至少还需要三次重复，再进行个体差异性分析，需要消耗大量的金钱，大量的时间。相对于以往的蝉花全基因组测序结果，本发明RAPD分子标记只是一段10nt碱基的引物随机结合到DNA上的，只需通过PCR和电泳就能得到结果，具有耗时短，价格低，操作简便的特点。附图说明图1为引物S6对应的RAPD条带图谱；图2为引物S7对应的RAPD条带图谱；图3为引物S10对应的RAPD条带图谱；图4为引物S30对应的RAPD条带图谱；图5为引物S31对应的RAPD条带图谱；图6为引物S33对应的RAPD条带图谱；图7为引物S37对应的RAPD条带图谱；图8为引物S46对应的RAPD条带图谱；图9为引物S61对应的RAPD条带图谱；图10为引物S67对应的RAPD条带图谱；图11为引物S92对应的RAPD条带图谱；图12为引物S103对应的RAPD条带图谱；图13为引物S136对应的RAPD条带图谱；图14为引物S140对应的RAPD条带图谱；图15为引物S151对应的RAPD条带图谱；图16为引物S216对应的RAPD条带图谱；图17为引物S219对应的RAPD条带图谱；图18为引物S11对应的RAPD条带图谱；图19为引物S9对应的RAPD条带图谱；图20为引物S12对应的RAPD条带图谱；图21为引物S21对应的RAPD条带图谱；图22为引物S34对应的RAPD条带图谱；图23为引物S35对应的RAPD条带图谱；图24为引物S36对应的RAPD条带图谱；图25为引物S41对应的RAPD条带图谱；图26为引物S42对应的RAPD条带图谱；以上图1-17中，泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为IC407的PCR结果,泳道3为15LQ4的PCR结果,泳道4为15FY13的PCR结果，泳道5为16JR41的PCR结果，泳道6为Marker，泳道7为16JR42的PCR结果，泳道8为15AX22的PCR结果，泳道9为16AJ26的PCR结果，泳道10为15JGS4的PCR结果，泳道11为14DBS50的PCR结果；以上图18中，泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果；以上图19-26中，泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ8的PCR结果,泳道3为15JJ10的PCR结果,泳道4为15JJ14的PCR结果，泳道5为15JJ18的PCR结果，泳道6为15AX27的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15AX30的PCR结果，泳道10为15AX36的PCR结果，泳道11为15AX39的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果；图27为引物S11对应的RAPD条带图谱泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道2为15JJ5的RAPD条带大小估算为4000bp～3000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道3为15JJ7的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道4为15JJ8的RAPD条带大小估算为4000bp～3000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道5为15JJ10的RAPD条带大小估算为4000bp～3000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道6为15JJ14的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，250bp～300bp之间；泳道8为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道9为15JJ17的RAPD条带大小估算为4000bp～3000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间。泳道10为15JJ18的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道11为15AX22的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道12为15AX27的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道13为15AX30的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间。图28为引物S11对应的RAPD条带图谱泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15AX33的PCR结果，泳道3为15AX34的PCR结果，泳道4为15AX36的PCR结果，泳道5为15AX38的PCR结果，泳道6为15AX39的PCR结果,泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JGS2的PCR结果，泳道10为15JGS4的PCR结果，泳道11为15JGS11的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道2为15AX33的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间；泳道3为15AX34的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道4为15AX36的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道5为15AX38的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道6为15AX39的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道8为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道9为15JGS2的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道10为15JGS4的RAPD条带大小估算为无；泳道11为15JGS11的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道12为15JGS35的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道13为15JGS38的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间。图29为引物S11对应的RAPD条带图谱泳道1Marker，泳道2为单17-7-1的PCR结果，泳道3为15FY8的PCR结果，泳道4为15FY13的PCR结果，泳道5为15FY14的PCR结果，泳道6为15LQ4的PCR结果，泳道7为14DBS50的PCR结果，其中泳道1Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道2为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道3为15FY8的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，250bp～300bp之间；泳道4为15FY13的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间；泳道5为15FY14的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，250bp～300bp之间；泳道6为15LQ4的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，750bp～500bp之间；泳道7为14DBS50的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间。图30为引物S11对应的RAPD条带图谱泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15JJ5的PCR结果，泳道3为15JJ7的PCR结果，泳道4为15JJ8的PCR结果，泳道5为15JJ10的PCR结果，泳道6为15JJ14的PCR结果，泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JJ17的PCR结果，泳道10为15JJ18的PCR结果，泳道11为15AX22的PCR结果，泳道12为15AX27的PCR结果，泳道13为15AX30的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道2为15JJ5的RAPD条带大小估算为4000bp～3000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道3为15JJ7的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道4为15JJ8的RAPD条带大小估算为4000bp～3000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道5为15JJ10的RAPD条带大小估算为4000bp～3000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道6为15JJ14的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，250bp～300bp之间；泳道8为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道9为15JJ17的RAPD条带大小估算为4000bp～3000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道10为15JJ18的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道11为15AX22的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道12为15AX27的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道13为15AX30的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间。图31为引物S11对应的RAPD条带图谱泳道1为单17-7-1的PCR结果，泳道2为15AX33的PCR结果，泳道3为15AX34的PCR结果，泳道4为15AX36的PCR结果，泳道5为15AX38的PCR结果，泳道6为15AX39的PCR结果,泳道7为Marker，泳道8为单17-7-1的PCR结果，泳道9为15JGS2的PCR结果，泳道10为15JGS4的PCR结果，泳道11为15JGS11的PCR结果，泳道12为15JGS35的PCR结果，泳道13为15JGS38的PCR结果，其中泳道7Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道2为15AX33的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道3为15AX34的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道4为15AX36的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道5为15AX38的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道6为15AX39的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道8为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道9为15JGS2的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道10为15JGS4的RAPD条带大小估算为无；泳道11为15JGS11的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道12为15JGS35的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间；泳道13为15JGS38的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间。图32为引物S11对应的RAPD条带图谱泳道1Marker，泳道2为单17-7-1的PCR结果，泳道3为15FY8的PCR结果，泳道4为15FY13的PCR结果，泳道5为15FY14的PCR结果，泳道6为15LQ4的PCR结果，泳道7为14DBS50的PCR结果，其中泳道1Marker条带按照分子量大小从上往下顺序依次为：10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道2为单17-7-1的RAPD条带大小估算为3000bp～2000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道3为15FY8的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道4为15FY13的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间；泳道5为15FY14的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间；泳道6为15LQ4的RAPD条带大小估算为2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，750bp～500bp之间；泳道7为14DBS50的RAPD条带大小估算为5000bp～3000bp之间，2000bp～1500bp之间，1500bp～1000bp之间，1000bp～750bp之间，750bp～500bp之间。具体实施方式以下实施例所用蝉花单17-7-1菌株于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC注册保藏，保藏号为CGMCCNo.3453；其他不同地域蝉花分别采集自安溪编号分别为：15AX22，15AX27，15AX30，15AX33，15AX34，15AX36，15AX38，15AX39、九江编号分别为：15JJ5，15JJ7，15JJ8，15JJ10，15JJ14，15JJ17，15JJ18、井冈山编号分别为：15JGS2，15JGS4，15JGS11，15JGS35，15JGS38、富阳编号分别为：15FY8，15FY13，15FY14、大别山编号为：14DBS50、乐清编号为：15LQ4；编号安徽繁昌IC407、江苏句容16JR41、16JR42、浙江安吉16AJ26，以上菌株均为蝉棒束孢。实施例1基于RAPD技术，先人工合成多个随机多态核苷酸序列作为引物，所述引物序列见表1。表1引物序列编号引物名称引物序列5'到3'SEQIDNO：1S11GTAGACCCGTSEQIDNO：2S6TGCTCTGCCCSEQIDNO：3S7GGTGACGCAGSEQIDNO：4S10CTGCTGGGACSEQIDNO：5S30GTGATCGCAGSEQIDNO：6S31CAATCGCCTGSEQIDNO：7S33CAGCACCCACSEQIDNO：8S37GACCGCTTGTSEQIDNO：9S46ACCTGAACGGSEQIDNO：10S61TTCGAGCCAGSEQIDNO：11S67GTCCCGACGASEQIDNO：12S92CAGCTCACGASEQIDNO：13S103AGACGTCCACSEQIDNO：14S136GGAGTACTGGSEQIDNO：15S140GGTCTAGAGGSEQIDNO：16S151GAGTCTCAGGSEQIDNO：17S216GGTGAACGCTSEQIDNO：18S219GTCCGTATGGSEQIDNO：19S9TGGGGGACTCSEQIDNO：20S12CCTTGACGCASEQIDNO：21S21CAGGCCCTTCSEQIDNO：22S34TCTGTGCTGGSEQIDNO：23S35TTCCGAACCCSEQIDNO：24S36AGCCAGCGAASEQIDNO：25S41ACCGCGAAGGSEQIDNO：26S42GGACCCAACC采用CTAB法提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花DNA，采用上述各引物进行聚合酶链式反应扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测RAPD条带。其中PCR反应条件如下：反应体系：总体积50μL，DNA样本：50ng，dNTP：6nmol，引物：20pmol，Taq酶：2U，Buffer：5μL，加ddH2O至50μL。PCR反应条件：95℃5min；95℃40sec，38℃1min，72℃2min，共循环40次；72℃10min，4℃保存。1.2％琼脂糖凝胶电泳，电压100V40min；凝胶成像仪Alphamager拍摄。检测结果见图1-26。由电泳图可以看出，除引物S11图18外，其他引物的电泳图中不同地域蝉花与单17-7-1菌株都具有一条或者多条相同的电泳条带，还有个别引物PCR结果无条带。只有引物S11的电泳图中单17-7-1菌株在3000bp～2000bp之间具有一条独有的条带，而其他不同地域的蝉花并不具有，可以明显的区分蝉花单17-7-1与其他不同地域蝉花。实施例2以实施例1筛选得到的引物S11建立对蝉花单17-7-1的鉴定方法。RAPD指纹图谱稳定性实验1：试验操作：1.采用CTAB法提取同一批次蝉花单17-7-1和不同地域蝉花DNA，采用引物S11进行聚合酶链式反应扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测RAPD条带。2.PCR反应条件如下：反应体系：总体积50μL，DNA样本：50ng，dNTP：6nmol，引物：20pmol，Taq酶：2U，Buffer：5μL，加ddH2O至50μL。PCR反应条件：95℃5min；95℃40sec，38℃1min，72℃2min，共循环40次；72℃10min，4℃保存。3.1.2％琼脂糖凝胶电泳，电压100V40min。4.凝胶成像仪Alphamager拍摄。实验结果：以S11为引物，对同一批次提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花的DNA为模板的PCR而获得的电泳图谱分别如图27、图28、图29所示。从电泳图谱上看，以同一批次抽提的DNA为模板，并重复3次，得到主要的扩增片段是一致的。从以上试验结果可以得出，RAPD检测DNA多态性是一种稳定的、可靠的方法。RAPD指纹图谱稳定性实验2：试验操作：1.CTAB法提取不同批次的蝉花单17-7-1和不同地域蝉花DNA，采用引物S11进行聚合酶链式反应扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测RAPD条带。2.PCR反应条件如下：反应体系：总体积50μL，DNA样本：50ng，dNTP：6nmol，引物：20pmol，Taq酶：2U，Buffer：5μL，加ddH2O至50μL。PCR反应条件：95℃5min；95℃40sec，38℃1min，72℃2min，共循环40次；72℃10min，4℃保存。3.1.2％琼脂糖凝胶电泳，电压100V40min。4.凝胶成像仪Alphamager拍摄。实验结果：以S11为引物，对不同批次提取蝉花单17-7-1和不同地域蝉花的DNA为模板的PCR而获得的电泳图谱如图30、图31、图32所示。从电泳图谱上看，以不同批次抽提的DNA为模板，并重复3次，得到主要的扩增片段基本是一致的。从以上试验结果可以得出，RAPD检测不同样本DNA多态性是一种稳定的、可靠的方法。从中可见采用引物S11，可以明显的区分蝉花单17-7-1与其他不同地域蝉花的不同，因此利用RAPD分子标记技术并以引物S11作为鉴定蝉花单17-7-1的方法非常可行。序列表浙江泛亚生物医药股份有限公司一种蝉花菌株的RAPD分子标记鉴定方法26SIPOSequenceListing1.0110DNA人工序列ArtificialSequence1gtagacccgt10210DNA人工序列ArtificialSequence2tgctctgccc10310DNA人工序列ArtificialSequence3ggtgacgcag10410DNA人工序列ArtificialSequence4ctgctgggac10510DNA人工序列ArtificialSequence5gtgatcgcag10610DNA人工序列ArtificialSequence6caatcgcctg10710DNA人工序列ArtificialSequence7cagcacccac10810DNA人工序列ArtificialSequence8gaccgcttgt10910DNA人工序列ArtificialSequence9acctgaacgg101010DNA人工序列ArtificialSequence10ttcgagccag101110DNA人工序列ArtificialSequence11gtcccgacga101210DNA人工序列ArtificialSequence12cagctcacga101310DNA人工序列ArtificialSequence13agacgtccac101410DNA人工序列ArtificialSequence14ggagtactgg101510DNA人工序列ArtificialSequence15ggtctagagg101610DNA人工序列ArtificialSequence16gagtctcagg101710DNA人工序列ArtificialSequence17ggtgaacgct101810DNA人工序列ArtificialSequence18gtccgtatgg101910DNA人工序列ArtificialSequence19tgggggactc102010DNA人工序列ArtificialSequence20ccttgacgca102110DNA人工序列ArtificialSequence21caggcccttc102210DNA人工序列ArtificialSequence22tctgtgctgg102310DNA人工序列ArtificialSequence23ttccgaaccc102410DNA人工序列ArtificialSequence24agccagcgaa102510DNA人工序列ArtificialSequence25accgcgaagg102610DNA人工序列ArtificialSequence26ggacccaacc10

权利要求：1.一种蝉花单17-7-1菌株的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1，提取待检测菌株的DNA；步骤2，对步骤1获得的待检测菌株DNA采用引物进行PCR扩增，引物序列为SEQIDNO：1；步骤3，将步骤2获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后获得待检测菌株的RAPD条带图谱；步骤4，将步骤3获得的待检测菌株RAPD图谱进行分析获得判定结果。2.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2所采用的PCR扩增反应体系为：总体积50μL，DNA样本：50ng，dNTP：6nmol，引物：20pmol，Taq酶：2U，Buffer：5μL，加ddH2O至50μL。3.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2所采用的PCR扩增反应条件如下：先95℃5分钟；然后依次95℃40秒，38℃1分钟，72℃2分钟，共循环40次；然后72℃延伸10分钟，最后降温至4℃保存。4.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤4中，将步骤3获得的RAPD条带图谱进行分析，待检测菌株在3000bp～2000bp之间具有一条条带，鉴定待检测菌株为蝉花菌株单17-7-1菌株。

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