申请/专利权人：中国科学院生态环境研究中心;上海城投原水有限公司

申请日：2021-11-02

公开（公告）日：2023-10-27

公开（公告）号：CN113943782B

主分类号：C12Q1/6851

分类号：C12Q1/6851;C12N15/11

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.10.27#授权;2022.02.08#实质审查的生效;2022.01.18#公开

摘要：本发明公开了一种评估水体中2‑甲基异莰醇MIB浓度的方法，包括过滤水体收集蓝藻细胞，提取蓝藻DNA，并以蓝藻DNA为模板进行实时荧光定量PCR，获得水体的Cq值，然后将Cq值带入mic基因拷贝数浓度与实时荧光定量PCR的Cq值的标准曲线A中计算获得水体中mic基因浓度N；再接着将水体中mic基因浓度带入样品中MIB浓度与mic基因拷贝数浓度的标准曲线B，获得待评估水体中的MIB浓度。本发明方法克服了现有监测水体MIB浓度需要大型检测设备、检测时间长的技术缺陷，并且本发明方法的灵敏度高，检出限低，检测时间短，通量高，能实现对MIB快速准确的定量检测。

主权项：1.一种评估水体中2-甲基异莰醇MIB浓度的方法，其特征是，包括如下步骤：1）构建标准mic质粒通过基因克隆技术将蓝藻的mic基因序列片段导入载体，构建标准mic质粒，并测定构建的标准mic质粒的核酸质量浓度；2）设计特异性引物根据mic基因设计特异性引物，特异性引物对为MIBQSFMIBQSR，其中MIBQSF：SEQIDNO.2；MIBQSR：SEQIDNO.3；3）配制标准mic质粒稀释液将步骤1）构建的标准mic质粒进行十倍梯度稀释，配制成标准mic质粒稀释液；按照公式（3）计算标准mic质粒稀释液的mic基因拷贝数浓度；N=NA×cL×M（3）公式（3）中：N：标准mic质粒稀释液的mic基因拷贝数浓度，copies·µL-1;NA：阿伏伽德罗常数，6.02×1023mol-1;c：标准mic质粒稀释液的核酸质量浓度，g·µL-1；L：构建的标准mic质粒的碱基长度，bp，所述碱基长度为目的基因长度加载体长度，L=2936；M：单位碱基平均摩尔质量，660g·mol-1·bp-1；4）绘制mic基因拷贝数标准曲线A以标准mic质粒稀释液中的mic质粒为模板DNA，以步骤2）设计的特异性引物为引物，进行实时荧光定量PCR，获得标准mic质粒稀释液相应的Cq值；接着以标准mic质粒稀释液的mic基因拷贝数浓度N的对数值为纵坐标，实时荧光定量PCR测定的Cq值为横坐标，绘制标准mic质粒的mic基因拷贝数浓度与实时荧光定量PCR的Cq值的标准曲线A，标准曲线A如公式（1）所示：log10N=k×Cq+b（1）公式（1）中：Cq值：为梯度稀释的标准mic质粒稀释液实时荧光定量PCR的Cq值；N：为标准mic质粒稀释液中mic基因拷贝数浓度；log10N：标准mic质粒稀释液中mic基因拷贝数浓度的对数值；k为标准曲线A的斜率，k=-0.290；b为标准曲线的截距，b=11.92；5）测定环境样品中mic基因拷贝数浓度采集至少30个不同的环境水样并分别过滤，分别收集过滤后的滤膜上环境样品；接着使用DNA提取试剂盒分别提取环境样品的DNA，获得环境样品DNA；然后以步骤2）设计的特异性引物为引物，以提取的环境样品DNA为模板，进行实时荧光定量PCR，获得相应的环境水样Cq值；再然后将测定的环境水样Cq值带入标准曲线A中，计算获得环境水样中mic基因的拷贝数浓度N；6）测定环境水样中MIB浓度取步骤5）中的环境水样进行GC-MS测定，测定环境水样中MIB浓度Y；7）绘制MIB浓度与mic基因拷贝数浓度标准曲线B以步骤5）中通过标准曲线A计算获得的环境水样的mic基因拷贝数浓度N的对数值为横坐标，以步骤6）测定的MIB浓度Y的对数值为纵坐标，建立环境水样中MIB浓度与mic基因拷贝数浓度的标准曲线B，标准曲线B如公式（2）所示：log10Y=k1×log10N-b1（2）公式（2）中：N：环境水样中的mic基因拷贝数浓度，copiesL-1；Y:环境水样的MIB浓度，ngL-1；k1：标准曲线B的斜率；b1为标准曲线B的截距；8）采集并过滤待评估水体的水样，收集过滤后的滤膜上的待评估样品；接着使用DNA提取试剂盒提取待评估样品的DNA，获得待评估样品DNA；然后以步骤2）设计的特异性引物为引物，以提取的待评估样品DNA为模板，进行实时荧光定量PCR，获得待评估水体Cq值；再接着按照标准曲线A计算得到待评估水体中mic基因浓度N；再然后按照标准曲线B计算，获得待评估水体中MIB浓度。

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百度查询： 中国科学院生态环境研究中心;上海城投原水有限公司 一种评估水体中2-甲基异莰醇浓度的方法

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