申请/专利权人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

申请日：2022-06-28

公开（公告）日：2023-12-15

公开（公告）号：CN115097041B

主分类号：G01N30/02

分类号：G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/36;G01N30/72

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.12.15#授权;2022.10.14#实质审查的生效;2022.09.23#公开

摘要：本发明属于定量分析检测技术领域，具体涉及一种PRM检测促黄体生成素的试剂盒及检测方法和应用；所述试剂盒包括以下组分：促黄体生成素的重同位素标记肽段、质谱检测用试剂和纳升级高效液相色谱检测用试剂。本发明通过促黄体生成素的重同位素标记肽段对促黄体生成素进行绝对定量分析，以帮助绵羊发情阶段的判定，具有方便快捷，高选择性，高特异性及准确度高的优点，蛋白检测可达pgmg水平。同时，本发明的试剂盒还能避免放射性免疫分析试剂的使用。

主权项：1.一种基于PRM检测促黄体生成素的试剂盒的PRM检测促黄体生成素的方法，包括以下步骤：1对待测溶液进行酶解，得到含促黄体生成素的肽段，作为目标肽段；将所述目标肽段和促黄体生成素的重同位素标记肽段混合，得到混合肽段；2对所述混合肽段进行纳升级高效液相色谱分离，得到高效液相色谱分离后的肽段；3对所述高效液相色谱分离后的肽段进行PRM检测，得到质谱数据；4对所述质谱数据进行定量分析，得到促黄体生成素的定量结果；所述试剂盒包括以下组分：促黄体生成素的重同位素标记肽段、质谱检测用试剂和纳升级高效液相色谱检测用试剂；所述促黄体生成素的重同位素标记标准肽段包括重同位素标记的第一多肽和第二多肽；所述第一多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述第二多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；对待测溶液进行酶解包括以下步骤：将待测样品和UAbuffer进行第一混合，得到第一混合液；将所述第一混合液中加入二硫苏糖醇，进行还原反应，得到还原产物；将所述还原产物中加入碘乙酰胺，进行烷基化反应，得到烷基化产物；将所述烷基化产物中加入NH4HCO3水溶液和含胰蛋白酶的NH4HCO3buffer，进行酶解反应，得到含促黄体生成素的肽段的酶解液；对所述酶解液进行脱盐冻干，得到含促黄体生成素的肽段；步骤2中所述纳升级高效液相色谱分离的条件包括：进样量：2μL；流动相：流动相A和流动相B；所述流动相A为体积浓度为0.1％的甲酸水溶液；所述流动相B为甲酸-乙腈水溶液，所述甲酸-乙腈水溶液中甲酸的体积浓度为0.1％，所述甲酸-乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为84％；所述流动相的流速为300nLmin；洗脱方式：梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0～2min，所述流动相A的体积百分含量由95％匀速降低到90％，所述流动相B的体积百分含量为由5％匀速升高到10％；2～45min，所述流动相A的体积百分含量由90％匀速降低到70％，所述流动相B的体积百分含量为由10％匀速升高到30％；45～55min，所述流动相A的体积百分含量由70％匀速降低到0，所述流动相B的体积百分含量为由30％匀速升高到100％；55～60min，所述流动相B的体积百分含量维持100％；所述PRM检测的条件包括：分析时长：60min；检测模式：正离子；一级质谱扫描范围：300～1800mz；质谱分辨率：60,000@mz200；AGC强度：3e6；最大离子富集时间：200ms；每次一级MS扫描后根据靶向肽段信息列表采集20个PRM扫描；PRM扫描参数为：分离窗口：1.6Th；质谱分辨率：30,000@mz200；AGC强度：3e6；最大离子富集时间：120ms；二级碎裂模式：HCD；正态化的碰撞能量：27。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种PRM检测促黄体生成素的试剂盒及检测方法和应用

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