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申请/专利权人：广西壮族自治区食品药品检验所

摘要：本发明公开了一种鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的PCR鉴别方法，具体包括模板DNA提取、PCR扩增反应、琼脂糖电泳检测三个步骤。本发明通过找出特异性DNA片段，设计出特异性引物，通过PCR技术扩增出特异性片段，通过聚合酶链式反应PCR技术实现了对鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的高效鉴别。本发明提供的方法简单易行，稳定可靠，采用该方法能够快速准确的对鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子进行真伪鉴定，确保用药安全，有助于实现鸡骨草药材市场的健康发展。

主权项：1.一种鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的PCR鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）模板DNA提取：取供试品用75%乙醇或无水乙醇冲洗2次或擦拭表面，滤纸吸取多余水分，晾干；用研磨仪磨成极细粉末备用；称取干燥供试品粉末20mg置于1.5mL离心管中，使用新型植物组织基因组DNA提取试剂盒提取干燥供试品粉末的DNA；（2）PCR扩增反应：鉴别引物，针对鸡骨草及毛鸡骨草和相思子都有对应的特异性引物，鸡骨草扩增上游引物：5’-CAACATTCTTTAGTATTTTTTATTTCCTAT-3’，鸡骨草扩增下游引物：5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’；毛鸡骨草扩增上游引物：5’-CGCATTCTTTAGTATTGTTTATTTCGTTG-3’，毛鸡骨草扩增下游引物：5’-ACCTTGAACCACTTGCCTACA-3’；相思子扩增上游引物：5’-GTTTTTGAAAGTAAAGGAGCAATATCAACAG-3’，相思子扩增下游引物：5’-ACTTGGTTACATCCGCCCTT-3’；PCR反应体系：反应总体积为25μL，艾德莱2XF8LongFastPCRMasterMix预混液12.5μL，上下游引物各0.75μL，模板DNA1μL，无菌水10μL；另取等体积无菌水代替模板DNA，作为空白对照；反应条件：95℃预变性5分钟；94℃变性15秒、X℃退火15秒、72℃延伸20秒，循环反应35次；72℃延伸5分钟；其中，针对鸡骨草引物，X为58；针对毛鸡骨草引物，X为54；针对相思子引物，X为62；（3）琼脂糖电泳检测：按照琼脂糖凝胶电泳法，配制2%琼脂糖凝胶，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed，取经PCR扩增反应后得到的供试品产物3μL进行上样，DNA分子量标记上样量为2.5μL，电泳结束后在凝胶成像仪上进行检视；供试品凝胶电泳图中，在与对照药材凝胶电泳相应的位置上：鸡骨草和毛鸡骨草在100～200bp间有明显条带，相思子引物扩增的产物在200～300bp间有明显条带，空白对照无条带。

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