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申请/专利权人：华中农业大学

摘要：本发明涉及线粒体提取技术领域，且公开了一种高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法，包括以下步骤：取鱼剪鳃、放血、取肝，洗涤后将肝脏剪碎后用含BSA的缓冲液以清洗油脂；根据肝脏含量使用胰蛋白酶消化；消化后的组织缓慢匀浆，匀浆液添加蛋白酶抑制剂后进行超声破碎；破碎后的匀浆液低速离心以去除未破碎的细胞。该高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法，操作简单易行，提取效率高，利用组织提取的MAM杂质少，另外采用胰蛋白酶消化组织间杂质，减少污染，提高细胞提取效率，并且通过适宜超声频率破碎细胞，增加MAM提取效率，如此，实现了提取黄颡鱼线粒体内质网偶联结构的目的。

主权项：1.一种高纯度的黄颡鱼肝脏线粒体内质网偶联提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1处理黄颡鱼：取新鲜的黄颡鱼，剪鳃、放血、取肝，肝脏先在PBS中清洗2-3次，然后再用添加BSA的IU-1洗涤2-3次，将洗涤后的肝脏加入预冷的IU-3，清洗3-4次以去除血液，使用手术刀剪碎后捞出放置到烧杯中，可得到鱼肝的提取样本，所述IU-1由甘露醇250mmolL、蔗糖70mmolL、Tris-HCl30mmolL、BSA3％和EDTA1mmolL混合而成，所述IU-3由甘露醇250mmolL、蔗糖70mmolL和Tris-HCl30mmolL混合而成；2消化鱼肝样本：根据肝脏样本的含量，往烧杯中中添加胰蛋白酶进行鱼肝的消化反应；3制备均浆：在消化后的组织内加入STE缓冲液，使用匀浆机匀化1min，使组织均匀化，得到均匀浆液，然后在匀浆液内添加蛋白酶抑制剂，进行超声破碎，破碎匀浆液内的细胞，所述STE缓冲液由Tris、sucrose和EDTA-2K混合而成，且Tris、sucrose、EDTA-2K的混合比例为1:1.5:1；4差速获取粗线粒：把超声破碎后的匀浆液装入离心管中，把离心管放置到离心机中低速离心，去除未破碎的细胞，收集上清液，将收集到的上清液重新装入到离心管中，进行高速离心，高速离心完毕后，收集离心管中的沉淀物，获得粗线粒体，所述低速离心时离心力为850g，离心时间为10min，高速离心时离心力为12000g，离心时间为12min；5粗线粒体重悬：把获取的粗线粒体按照组织含量用IU-2重悬，比例为1：6，采用差速离心减少粗线粒体污染，所述IU-2由甘露醇250mmolL、蔗糖70mmolL、Tris-HCl30mmolL和BSA1％混合而成；6离心沉淀：取薄壁离心管，按次序分层缓慢加入PercollMedium、线粒体悬液和MRB，离心管底层条带是纯线粒体，其上层白色条带为MAM，所述PercollMedium由甘露醇250mmolL、HEPES25mmolL、EDTA1mmolL和30％Percollvolvol混合而成，所述MRB由甘露醇250mmolL、HEPES5mmolL和EDTA0.5mmolL混合而成。

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