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申请/专利权人：山东省林草种质资源中心(山东省药乡林场);北京林业大学

摘要：本发明涉及林木分子辅助育种技术领域，尤其为一种特有鉴别胡杨派植物方法及使用试剂盒，可对不同杨属派系种间与进化过程中相对保守性基因EXPA1的克隆，比对分析派系间的序列变异规律，并通过派系间的序列特征分析，筛选得到胡杨派特异分子标记，以及用于区分杨属五大派系树种间的特有鉴别胡杨派树种的方法及鉴定试剂盒，利用本方案试剂盒及鉴别方法，可以鉴定胡杨派树种特异扩增条带为456bp，可以用于杨属间派系的鉴定、亲缘关系分析及进化路程分析等，并为杨树的分子标记辅助育种和品种遗传改良工作提供理论基础和技术支持，还可有效鉴定五莲杨不属于胡杨派树种，具有高灵敏性、特异性以及直观、简洁、准确等优点。

主权项：1.一种特有鉴定胡杨派树种的方法，步骤如下：步骤1，杨属基因组DNA扩展蛋白1即为EXPA1基因，其同源片段引物设计如下：选取毛果杨EXPA1基因DNA全长序列中820bp～885bp的片段设计引物对1，所述引物对1为PtA1F和PtA1R，所述PtA1F的引物序列为5'-CCCAACAACAACCTTTATGG-3'，所述PtA1R的引物序列为5'-CAACCAGAACAGCGTTTGAC-3'；步骤2，获得五大派杨树基因组DNA同源EXPA1基因片段序列：提取五大派杨树代表性树种DNA，利用所述引物对1对所述EXPA1基因片段进行PCR扩增；其次，将这五大派杨树代表性树种的EXPA1基因片段进行克隆测序；所述五大派杨树分别为胡杨派、白杨派、黑杨派、青杨派和大叶杨派；选取的五大派杨树代表性树种分别为：胡杨派的胡杨、白杨派的‘鲁毛50’、黑杨派的欧美杨107、青杨派的小叶杨和大叶杨派的大叶杨；步骤3，获得胡杨派特异引物对：将获得的五大派杨树代表性树种的基因组DNA同源性EXPA1基因片段进行序列比对，挑选胡杨派在比对序列中区别其他四大派物种的特有片段，所述特有片段为5'-GCATTCCAATAGTTCTCACTCCACATTTTGGTGTATGCAAAAAAAAAA-3'的48bp片段；设计引物对2，所述引物对2为PtA2F和PtA2R，所述PtA2F的引物序列为5'-TTCCAATAGTTCTCACTCCA-3'，所述PtA2R的引物序列为5'-CTCATGCTCATCCAACCAGT-3'；步骤4，验证所述引物对2的准确性：将收集的五大派杨树代表性树种共计21个样本使用胡杨派专用试剂盒进行验证，结果显示，胡杨派的5个样本在扩增结果中均有456bp特异条带出现，而白杨派、黑杨派、青杨派和大叶杨派树种的样本中均没有所述特异条带产生；步骤5，鉴定五莲杨不属于胡杨派的树种：分别提取五莲杨雌株、雄株DNA，利用胡杨专用试剂盒进行鉴别，结果显示，五莲杨雌雄两样本中均无456bp特异条带产生，说明五莲杨雌株、雄株均不属于胡杨派的植物；所述胡杨派专用试剂盒包含所述引物对2。

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