申请/专利权人：河南省农业科学院烟草研究所

申请日：2023-12-27

公开（公告）日：2024-04-12

公开（公告）号：CN117867013A

主分类号：C12N15/83

分类号：C12N15/83;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/82

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.30#实质审查的生效;2024.04.12#公开

摘要：本发明涉及一种基于VIGS的高效高特异性基因沉默本氏烟草方法，目的基因与线性化载体连接方案使用同源重组一步法克隆试剂盒的快速方案进行，采用此方案的前提是PCR产物和线性化载体酶切产物电泳条带均单一，采用此方案进行连接不需要经过胶回收步骤，可以最大程度的保证浓度，提高连接成功率；具体连接体系为：线性化载体体积3μL，目标片段体积1μL，ExnaseII体积2μL，5xCEIIBuffer体积4μL，ddH2O体积10μL；37℃孵育30分钟；使用SGNVIGSTool在线软件对插入序列片段进行最优化选择，降低基因沉默‘脱靶’效率。

主权项：1.一种基于VIGS的高效高特异性基因沉默本氏烟草方法，其特征在于，它是按照以下步骤进行的：S1、RNA提取与cDNA合成S2、将目的基因mRNA序列全长提交至SGNVIGSTool在线网站，n-mer大小选择21，片段长度选择300，数据库选择Nicotianabenthamianav1.0.1；S3、提交序列，运行VIGS分析，得到与目标基因同源性较强的基因，并根据软件自动生成的尽可能避免同源区域的序列进行基因沉默最佳区域选择；S4、根据SGNVIGSTool生成的最佳基因沉默区域序列设计目的基因的基因沉默特异性引物，依据同源重组引物设计规范，使用CEDesigmV1.04软件根据TRV2载体特异性酶切位点进行具有同源臂的CEII扩增引物设计；以NtABS基因为例：基因CDS全长如下所示：ATGGGAGGGATACTCAACCGTCGGATTCCGTTCAGAGAGGGTTAGAATTTTCTTTTTGGCACTTTACAAAATGGTAGAGGAAATTGCGGCAAAGGCGGAAACTAAGCAAGGTCGATGTGTCAAAGATCACCTTATTAACTTGTGGATTGATATGTTGAAGTGTATGCTGGTGGAATTGGACCTTTGGAAAATTAAATCAACTACCCCAAGCATAGAGGAGTACTTGTCTGTTGCATGTGTAACTATTGGTGTTCCATGTTTTGTTCTCACATCACTATATCTTCTTGGACCAAAACTGTCCAAGGATGTCATAGAAAGTTCTGAGGTCAGTGCCTTATGCAATTGTACAGCTGCTGTGGCCCGATTGATTAATGATATACACAGTTACAAGAGAGAACAAGCAGAAAGTTCAACAAATATGGTATCAATATTAATAACACAAAGTCAGGGAACTATCTCTGAAGAAGAGGCTATAAGACAGATAAAGGAAATGATGGAAAGTAAGAGAAGAGAGTTGCTAGGGATGGTTCTACAAAATAAAGAAAGCCAATTGCCACAAGTGTGCAAGGATCTTTTTTGGACGACAATCAACGCAGCTTATTCTATACATACACATGGCGATGGGTATCGCTTCCCAGAGGAATTCAAGAACCATATCAACGATGTAATTTACAAACCACTCAATCAATATTCCCCATAA；S5、在本氏烟草cDNA中添加如下PCR扩增体系进行目的片段的扩增：PCR反应物分别为：2×PhantaFlashMasterMix：10μL、上游引物（10μM）：1μL、下游引物（10μM）：1μL、cDNA：2μL以及ddH2O：6μL；S6、目的基因与线性化载体连接方案使用同源重组一步法克隆试剂盒的快速方案进行，采用此方案的前提是PCR产物和线性化载体酶切产物电泳条带均单一，采用此方案进行连接不需要经过胶回收步骤，可以最大程度的保证浓度，提高连接成功率；具体连接体系为：线性化载体体积3μL，目标片段体积1μL，ExnaseII体积2μL，5xCEIIBuffer体积4μL，ddH2O体积10μL；37℃孵育30分钟；S7、重组载体依次进行转化大肠杆菌、提取质粒、转化农杆菌等操作；S8、实施烟草基因沉默高效转化；S9、持续观察注射TRV2-PDS本氏烟草的新叶是否出现白化现象。

全文数据：

权利要求：

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