申请/专利权人：浙江工业大学

申请日：2022-04-29

公开（公告）日：2024-05-10

公开（公告）号：CN114941001B

主分类号：C12N15/53

分类号：C12N15/53;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/52;C12N15/31;C12N15/81;C12P17/06;C12N1/19;C12R1/865

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.05.10#授权;2022.09.13#实质审查的生效;2022.08.26#公开

摘要：本发明通过多水平代谢工程策略首次实现了酿酒酵母以葡萄糖为碳源从头合成樱花素，首先在酿酒酵母中成功构建一条从葡萄糖开始生产樱花素的完整合成路径，接着强化樱花素前体对香豆酸、丙二酰辅酶A的供应来提供产率。本发明获得的代谢工程菌株发酵樱花素，是迄今报道的微生物法产樱花素的最高水平。

主权项：1.酿酒酵母产樱花素工程菌株的构建方法，包括如下步骤：1菌株和质粒：大肠杆菌DH5α用于所有质粒的构建和繁殖；以酿酒酵母CEN.PK2-1C作为出发菌株；2相关基因的获取：所有天然启动子、基因和终止子均通过使用酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组DNA或可用质粒作为模板进行PCR扩增；对于密码子优化的异源基因，使用合成片段或可用质粒进行PCR扩增；来自拟南芥的At4CL1通过使用拟南芥cDNA作为模板进行扩增；密码子优化的三个基因AtPAL2、AtC4H和AtATR2均来自拟南芥，从质粒pCfB2584和pCfB2767获得，CoNOMT通过使用水稻cDNA作为模板进行扩增；两个表达盒包括来自酿酒酵母的CYB5和密码子优化的来自拟南芥的At4CL2分别从pCfB2767和pCfB2584直接扩增；EcaroL扩增来自大肠杆菌基因组DNA，并分别从相应的克隆载体pCHS和pCHI扩增了密码子优化的两个基因CHS和CHI，然后，将这些候选基因、启动子或终止子克隆到辅助质粒pH1、pH2、pH3、pH4、pH5、pH6或pUC19使用限制性连接或Gibson组装获得基因表达盒质粒；3菌株构建，包括以下子步骤：3.1菌株构建使用的方法:采用CRISPRCas9系统，使用Cas9和gRNA表达质粒在酿酒酵母菌株中进行基因缺失和DNA片段位点特异性整合；为了促进基因操作，从p42H-spCas9扩增了Cas9表达盒，并将其整合到酿酒酵母CEN.PK2-1C中的IX-1基因组位点，由此产生的菌株C00：CEN.PK2-1C，IX1::TEFp-SpCas9-ADH2t被用作DNA整合和生物合成途径工程的宿主；然后使用LiAcssDNAPEG酵母转化法将等摩尔量的纯化线性化片段与相应的gRNA质粒共转化到S.cerevisiae，并在补充有200μgL的G418的YPD平板上选择转化子；使用GreenTaqMix通过菌落PCR验证克隆；随后，这些具有正确模块整合的克隆在YPD液体培养基中培养过夜，然后在不含抗生素的平板上划线以环出gRNA载体；3.2葡萄糖从头合成樱花素途径的构建：在C00菌株基础上通过引入苯丙氨酸裂解酶AtPAL2、肉桂酸羟化酶AtC4H构建了酿酒酵母中从苯丙氨酸到香豆酸CIA的路径，标记菌株C01；后继分别引入P450还原酶AtATR2，并过表达酿酒酵母天然细胞色素CYB5，构建香豆酸CIA到对香豆酸p-HCA的生物合成途径，获得菌株C02；在C02菌株基础上继续引入酪氨酸解氨酶TAL，4-香豆酸-CoA连接酶4CL，查耳酮合成酶CHS，查耳酮异构酶CHI，柚皮素-7-O-甲基转移酶NOMT，构建一条从葡萄糖开始从头生产樱花素的完整合成路径，获得产樱花素初始菌株YHS02；3.3调整樱花素合成基因的拷贝数强化樱花素生物合成：在YHS02菌株基础上多拷贝樱花素合成途径中的苯丙氨酸解氨酶基因PAL、肉桂酸羟化酶C4H、酪氨酸解氨酶TAL、查耳酮合成酶CHS和柚皮素-7-O-甲基转移酶NOMT，并敲除半乳糖基因GAL1710，得到菌株YHS07；3.4通过移除芳香族氨基酸合成路径中的限速因子来强化樱花素前体对香豆酸的供应：在YHS07菌株基础上选择过表达两个不受芳香族氨基酸抑制的DAHP合酶突变体ARO3K222L、ARO4K229L和分支酸变位酶突变体ARO7G141S来增强酪氨酸和苯丙氨酸的合成，得到的工程菌YHS09；3.5优化L-苯丙氨酸分支并增强樱花素合成的代谢流：通过在YHS09菌株基础上敲除酪氨酸和苯丙氨酸合成途径过程中的旁路基因pdc5和aro10来增强樱花素合成的代谢流，得到菌株YHS11；接着，在YHS11工程菌基础上系统地过表达了来自大肠杆菌的异源莽草酸激酶EcaroL、内源性苯酚酸脱水酶PHA2、分支酸合酶ARO2和五功能芳香蛋白ARO1构建成功的菌株YHS16；3.6增强樱花素前体丙二酰辅酶A的含量：优化莽草酸途径前体供应提高CGA产量：在YHS16菌株基础上，通过敲除YPL062W同时插入乙酰辅酶A羧化酶ACC1突变体ACC1S659A，S1157A来强化了樱花素另一前体丙二酰辅酶A的合成，得到工程菌株YHS18。

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百度查询： 浙江工业大学 酿酒酵母产樱花素代谢工程菌株的构建方法及其应用

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