申请/专利权人：山东大学

申请日：2022-06-10

公开（公告）日：2024-05-28

公开（公告）号：CN115058495B

主分类号：C12Q1/6844

分类号：C12Q1/6844;C12Q1/6886

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.05.28#授权;2022.10.04#实质审查的生效;2022.09.16#公开

摘要：本发明属于生物检测技术领域，涉及一种基于Atto‑425和AuNCsUiO‑66‑NH2的比率荧光和滚环扩增的piRNA体外检测方法。其中Atto‑425具有荧光报告作用，AuNCs具有荧光参考作用，UiO‑66‑NH2起到负载AuNCs以及吸附未结合荧光报告子的作用。该方法包括以下步骤：制备AuNCsUiO‑66‑NH2，将待测样本溶液加至含有环状模板的溶液中，于95℃孵育5min，然后向上述溶液中加入DNA连接酶30℃孵育1h连接环状模板，灭活连接酶后加入DNA聚合酶于30℃孵育4h进行滚环扩增，灭活聚合酶后加入荧光报告子于30℃孵育1.5h，最后加入AuNCsUiO‑66‑NH2静置30min，用荧光分光光度计测试上述混合溶液的（F‑F0）485F625并计算出待测piRNA的浓度。本发明操作简便、灵敏度高、特异性好、准确度高，是一种用于piRNA体外检测的可靠方法。

主权项：1.Atto-425作为报告分子、AuNCsUiO-66-NH2复合材料中的AuNCs作为参比荧光、UiO-66-NH2作为猝灭剂在制备piR-823体外诊断试剂盒中的应用，其特征在于，利用T4DNA连接酶连接环状模板，基于phi29DNA聚合酶实现piRNA滚环扩增，以Atto-425结合滚环扩增产物产生荧光信号；AuNCs作为参比荧光，UiO-66-NH2作为猝灭剂吸附并猝灭未结合的荧光报告分子，采用比率荧光法定量测定piR-823的浓度；所述滚环扩增步骤的目的分子为piR-823，序列为：5’-AGCGUUGGUGGUAUAGUGGUGAGCAUAGCUGC-3’，环状模板的5’端修饰有磷酸根，序列为：5’-P-CACTATACCACCAACGCTTCTAGGTTGAGTAAGTCGATGCAGCTATGCTCAC-3’,荧光报告分子的5’端修饰有Atto-425荧光分子，序列为：5’-Atto-425-TAGGTTGAGTAAGTC-3’；所述AuNCsUiO-66-NH2制作步骤如下：S1：以ZrCl4、2-氨基对苯二甲酸和乙酸为反应物，室温溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，采用水热法制备UiO-66-NH2；S2：以HAuCl4·4H2O和还原型谷胱甘肽为原料，采用水热法制备AuNCs；S3：将UiO-66-NH2和AuNCs室温搅拌混合制备得到AuNCsUiO-66-NH2。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 山东大学 基于比率荧光和滚环扩增的piRNA体外检测方法

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