申请/专利权人：江苏省农业科学院

申请日：2023-12-25

公开（公告）日：2024-03-22

公开（公告）号：CN117737050A

主分类号：C12N15/10

分类号：C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/6851;C12N15/11

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.09#实质审查的生效;2024.03.22#公开

摘要：本发明公开了一种种公牛冻精总RNA的提取方法及不同活力精子piRNA检测和应用，基于此方法对提取的精子RNA进行高通量转录组测序，鉴定出能够用于评估不同活力精子的piRNA标记物，建立了一种利用piRNA转录组测序为基础的荧光定量分析来检测影响精子活力中的10种功能性piRNA的方法，这些piRNA可以调节睾丸中精子的发生和精子活力形成原理，能够对公牛精子活力进行分子评价，填充公牛精液品质分子标记，对于奶牛种公牛的分子选育具有重要的参考意义。

主权项：1.一种种公牛冻精总RNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤，S1冻精的复苏和不同活力精子分离纯化1将种公牛冻精从液氮中取出，迅速置于38℃水浴中20s，迅速复苏，置于预热的1.5mL离心管中；2分别配置45％和90％的percoll溶液，配置percoll梯度溶液，即用9份percoll原液和1份1.5M的PBS配置100％的percoll溶液，再用0.15M的PBS将上述100％的percoll溶液分别稀释到45％和90％，将复苏后的冻精置于45％的percoll上层，室温1500rpm离心20min；3离心后，不同活力精子位于不同浓度的percoll溶液中，高活力精子位于90％percoll溶液中，而低活力精子位于45％percoll液层；4将分离的高低活力精子用预热的1×DPBS溶液洗涤，轻柔洗涤，1500rpm离心15min获得精子沉淀，区分高低活力精子；5用DPBS重复洗涤2遍,1500rpm离心15min，获得高低活力精子沉淀；6将精子沉淀用体细胞裂解液，室温裂解10min，去除残余体细胞，1500rpm离心10min，弃上清；7用无酶水配制的1×DPBS洗涤2遍，1500rpm离心10min，进一步获得高活力和低活力精子沉淀；S2精子RNA提取及质量检测1用Trizol重悬精子沉淀，添加50-100nM三2-氯乙基磷酸酯，70℃水浴30min，充分裂解精子；2加入0.2倍Trizol体积的纯氯仿，剧烈震荡混匀15s，室温放置2-3min，之后再12000rpm4℃离心15min；3离心后将上层水相转移至新的无RNA酶的离心管中，加入等体积的无水乙醇，震荡混匀；4按照RNA提取试剂盒说明书进行总RNA的提取；5将提取的精子RNA进行电泳检测分析，并评估精子RNA质量。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 江苏省农业科学院 种公牛冻精总RNA的提取方法及不同活力精子piRNA检测和应用

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