申请/专利权人：中外制药株式会社

申请日：2015-04-07

公开（公告）日：2024-06-07

公开（公告）号：CN106459206B

主分类号：C07K16/30

分类号：C07K16/30;A61K39/395;A61P35/00;A61P43/00

优先权：["20140407 JP 2014-078457","20141226 JP 2014-264589"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.07#授权;2017.03.22#实质审查的生效;2017.02.22#公开

摘要：本发明人发现，通过应用具有癌症特异性抗原结合结构域、和TNF超家族结合结构域或TNF受体超家族结合结构域的抗原结合分子，能够通过仅在癌症特异性抗原表达细胞存在下对属于TNF超家族或TNF受体超家族的因子发挥激动剂活性而活化免疫细胞，维持抗肿瘤活性，避免肝毒性等副作用。进一步地，本发明人发现，通过将该抗原结合分子与具有癌症特异性抗原结合结构域和T细胞受体复合物结合结构域的抗原结合分子联用，能够避免副作用，增加该抗肿瘤活性。

主权项：1.多特异性抗体，其包含下述结构域：1人GPC3结合Fab结构域，2CD137激动剂抗体Fab结构域，以及3FcRn结合结构域，其中FcRn结合结构域是对Fcγ受体的结合活性降低的、抗体的Fc区。

全文数据：免疫活化抗原结合分子技术领域[0001]本发明涉及应用双特异性抗体的新的癌症治疗方法。背景技术[0002]癌症是全世界中死亡的主要原因之一。除了一部分的癌症种类，其发现时无法手术的情况不少，进一步应用主要的治疗方法化疗剂的治疗成果也绝不能称为是好的。使得癌症治疗困难的主要原因不仅是癌细胞本身的不均一性，暗示肿瘤微环境起重要作用非专利文献1。近年来，显示用减弱抑制性T细胞的抗CTLA-4抗体治愈无法切除的恶性黑色素瘤等的可能性非专利文献2。这暗示，肿瘤免疫激活可成为新的癌症治疗策略的基础。[0003]理解的是，在肿瘤免疫中具有重要作用的T细胞的活化通过下列2个信号：1T细胞受体TCR与由肿瘤主要组织相容性复合物MHCI类分子呈递的抗原肽的结合和活化;2Τ细胞表面上的共刺激分子与抗原呈递细胞上其配体的结合和活化。进一步描述，以Τ细胞表面上的CD1374-1ΒΒ为首的属于肿瘤坏死因子TNF超家族、TNF受体超家族的分子的活化，对于Τ细胞活化是重要的非专利文献3。[0004]TNF超家族以及TNF受体超家族中包含CD137、CD137L、CD40、CD40L、0X40、0X40L、〇027、070、见^]\1、1^6!11'、1^疆、1^疆1^、030、00153、6叮1?、61了虬等分子。据报告，00137不仅在Τ细胞表面，也在树突细胞DC、Β细胞、ΝΚ细胞、中性粒细胞等其它免疫细胞表面表达非专利文献4。[0005]已证实⑶137激动剂抗体显示抗肿瘤效果，实验显示，这主要归于⑶8阳性Τ细胞和ΝΚ细胞的活化非专利文献5。但是，临床以及非临床中，CD137激动剂抗体的非特异性肝毒性产生的副作用成为问题，药剂的开发没有进展非专利文献6;非专利文献7。该副作用的主要原因暗示牵涉通过抗体恒定区与Fey受体结合非专利文献8。另外据报告，属于TNF受体超家族的受体的激动剂抗体在体内发挥激动剂活性，因此通过Fcγ受体表达细胞FcγRII表达细胞）的抗体的交联是必要的（非专利文献9。也即，CD137激动剂抗体的抗肿瘤效果的药效与肝毒性等副作用都牵涉抗体与Fey受体的结合，因此认为，如果增强抗体与Fcγ受体的结合，期望药效增加但肝毒性的副作用也增加，如果降低抗体与Fcγ受体的结合，副作用降低但药效也降低，迄今为止，没有报告药效与副作用分离的CD137激动剂抗体。进一步，CD137激动剂抗体的抗肿瘤效果本身根本不强，期望避免毒性同时进一步增加药效。[0006]双特异性抗体的特征是具有至少2个结合结构域，其分子形态是本领域技术人员已经公知的。其中，2个结合结构域中的1个与癌表面抗原特异性结合，并且第2结合结构域与Τ细胞表面抗原的CD3结合的分子也被构建非专利文献10。该双特异性单链抗体显示癌症抗原依赖性地活化Τ细胞而发挥抗肿瘤效果。[0007]磷脂酰肌醇聚糖3GPC3是属于通过糖基磷脂酰肌醇与细胞表面结合的一组硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、也即磷脂酰肌醇聚糖家族的蛋白质（非专利文献11。磷脂酰肌醇聚糖在细胞的增殖、分化、迀移中起重要作用。GPC3在通过外科切除或者活检得到的肝细胞癌组织的70%以上中表达，在邻接的非肿瘤性肝脏病变、大部分成人组织中完全不表达或几乎不表达非专利文献12;非专利文献13。进一步，也有报告称，肝细胞癌组织GPC3表达高的患者预后差非专利文献14，认为GPC3是对于肝细胞癌有希望的靶分子。[0008]现有技术文献非专利文献非专利文献l:Hanahan,Cell,2011，144，646-74非专利文献2:Prieto,ClinCancerRes.2012，18，2039-47非专利文献3:Summers,Nat.Rev.Immunol·,2012，12，339-51非专利文献4:Vinay,CellBiolInt·，2009，33，453-65非专利文献5:Houot,Blood,2009，114，3431-8非专利文献6:Ascierto,SeminOncol·,2010，37，508-16非专利文献7:Dubrot,CancerImmunol.Immunother.,2010,59,1223-33非专利文献8:Schabowsky,Vaccine,2009,28,512-22非专利文献9:Li,ProcNatlAcadSciUSA.2013,11048,19501-6非专利文献10:Brandi,CancerImmunol.Immunother.,2007,56,1551-63非专利文献ll:Filmus,J.Clin.Invest·,2001,108,497-501非专利文献12:Zhu-Zu-W,Gut,2001,48,558-564非专利文献13:Yamauchi,Mod.Pathol·,2005,18,1591-1598非专利文献14:Yorita,LiverInt·,2010,1,120-131。发明内容[0009]发明要解决的课题本发明是鉴于上述情况做出的，本发明提供了避免毒性同时活化免疫细胞且发挥优异抗肿瘤效果的、对TNF超家族或TNF受体超家族具有激动剂活性的抗原结合分子，以及包含该抗原结合分子作为有效成分的药物组合物，或者利用该药物组合物治疗癌症的方法。[0010]解决课题的手段本发明人发现，即使仅具有TNF超家族结合结构域或仅具有TNF受体超家族结合结构域的抗原结合分子没有活化免疫细胞的作用，具有癌症特异性抗原结合结构域与TNF超家族结合结构域、或者癌症特异性抗原结合结构域与TNF受体超家族结合结构域的抗原结合分子，也能够通过仅在癌症特异性抗原表达细胞存在下对属于TNF超家族或TNF受体超家族的因子发挥激动剂活性而活化免疫细胞，维持抗肿瘤活性，避免肝毒性等副作用。进一步地，本发明人发现，通过将该抗原结合分子与具有癌症特异性抗原结合结构域和T细胞受体复合物结合结构域的抗原结合分子组合应用，能够避免副作用，增加其抗肿瘤活性，从而完成本发明。[0011]也即，本发明提供下列。[0012]〔1〕抗原结合分子，其包含下述结构域：1癌症特异性抗原结合结构域，以及2肿瘤坏死因子TNF超家族结合结构域或肿瘤坏死因子TNF受体超家族结合结构域。[0013]〔2〕〔1〕中记载的抗原结合分子，其进一步包含FcRn结合结构域。[00M]〔3〕〔2〕中记载的抗原结合分子，其中FcRn结合结构域是对Fcγ受体的结合活性降低的、抗体的Fc区。[0015]〔4〕〔1〕至〔3〕中任一项记载的抗原结合分子，其中TNF超家族结合结构域或TNF受体超家族结合结构域是CD137结合结构域。[0016]〔5〕〔1〕至〔4〕中任一项记载的抗原结合分子，其为双特异性抗体。[0017]〔6〕药物组合物，其包含〔1〕至〔5〕中任一项记载的抗原结合分子作为有效成分。[0018]〔7〕〔6〕中记载的药物组合物，其为诱导细胞毒性的组合物。[0019]〔8〕〔6〕中记载的药物组合物，其为癌症治疗用组合物。[0020]〔9〕药物组合物，其由〔1〕至〔5〕中任一项记载的第1抗原结合分子与第2抗原结合分子组合而成，所述第2抗原结合分子包含下述结构域：1癌症特异性抗原结合结构域，以及2T细胞受体复合物结合结构域。[0021]〔10〕〔9〕中记载的药物组合物，其中第2抗原结合分子是进一步包含FcRn结合结构域的抗原结合分子。[0022]〔11〕〔10〕中记载的药物组合物，其中FcRn结合结构域是对Fcγ受体的结合活性降低的、抗体的Fc区。[0023]〔12〕〔9〕至〔11〕中任一项记载的药物组合物，其中T细胞受体复合物结合结构域是T细胞受体结合结构域。[0024]〔13〕〔9〕至〔11〕中任一项记载的药物组合物，其中T细胞受体复合物结合结构域是CD3结合结构域。[0025]〔14〕〔9〕至〔13〕中任一项记载的药物组合物，其中第2抗原结合分子是双特异性抗体。[0026]〔15〕〔9〕至〔14〕中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和第2抗原结合分子混合。[0027]〔16〕〔9〕至〔14〕中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和第2抗原结合分子联用。[0028]〔17〕〔9〕至〔14〕中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和第2抗原结合分子同时施用。[0029]〔18〕〔9〕至〔14〕中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和第2抗原结合分子分别施用。[0030]〔19〕〔9〕至〔18〕中任一项记载的药物组合物，其为诱导细胞毒性的组合物。[0031]〔20〕〔9〕至〔18〕中任一项记载的药物组合物，其为癌症治疗用组合物。[0032]〔21〕药物组合物，其包含含有下述结构域的第1抗原结合分子作为有效成分：1癌症特异性抗原结合结构域、以及2肿瘤坏死因子TNF超家族结合结构域或肿瘤坏死因子TNF受体超家族结合结构域，其用于与包含下述结构域的第2抗原结合分子联用：1癌症特异性抗原结合结构域、以及2T细胞受体复合物结合结构域。[0033]〔22〕〔21〕中记载的药物组合物，其为诱导细胞毒性的组合物。[0034]〔23〕〔21〕中记载的药物组合物，其为癌症治疗用组合物。[0035]〔24〕〔21〕至〔23〕中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和或第2抗原结合分子是进一步包含FcRn结合结构域的抗原结合分子。[0036]〔25〕〔24〕中记载的药物组合物，其中FcRn结合结构域是对Fcγ受体的结合活性降低的、抗体的Fc区。[0037]〔26〕〔21〕至〔25〕中任一项记载的药物组合物，其中TNF超家族结合结构域或TNF受体超家族结合结构域是CD137结合结构域或者CD40结合结构域。[0038]〔27〕〔21〕至〔26〕中任一项记载的药物组合物，其中T细胞受体复合物结合结构域是T细胞受体结合结构域。[0039]〔28〕〔21〕至〔26〕中任一项记载的药物组合物，其中T细胞受体复合物结合结构域是CD3结合结构域。[0040]〔29〕〔21〕至〔28〕中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和或第2抗原结合分子是双特异性抗体。[0041]〔30〕〔21〕至〔29〕中任一项记载的药物组合物，其与第2抗原结合分子同时施用。[0042]〔31〕〔21〕至〔29〕中任一项记载的药物组合物，其与第2抗原结合分子分别施用。[0043]〔32〕药物组合物，其包含含有下述结构域的第2抗原结合分子作为有效成分：1癌症特异性抗原结合结构域、以及2T细胞受体复合物结合结构域；其用于与包含下述结构域的第1抗原结合分子联用：1癌症特异性抗原结合结构域、以及2肿瘤坏死因子TNF超家族结合结构域或肿瘤坏死因子TNF受体超家族结合结构域。[0044]〔33〕〔32〕中记载的药物组合物，其为诱导细胞毒性的组合物。[0045]〔34〕〔32〕中记载的药物组合物，其为癌症治疗用组合物。[0046]〔35〕〔32〕至〔34〕中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和或第2抗原结合分子是进一步包含FcRn结合结构域的抗原结合分子。[0047]〔36〕〔35〕中记载的药物组合物，其中FcRn结合结构域是对Fcγ受体的结合活性降低的、抗体的Fc区。[0048]〔37〕〔32〕至〔36〕中任一项记载的药物组合物，其中T细胞受体复合物结合结构域是T细胞受体结合结构域。[0049]〔38〕〔32〕至〔36〕中任一项记载的药物组合物，其中T细胞受体复合物结合结构域是CD3结合结构域。[0050]〔39〕〔32〕至〔38〕中任一项记载的药物组合物，其中TNF超家族结合结构域或TNF受体超家族结合结构域是CD137结合结构域或者CD40结合结构域。[0051]〔40〕〔32〕至〔39〕中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和或第2抗原结合分子是双特异性抗体。[0052]〔41〕〔32〕至〔40〕中任一项记载的药物组合物，其与第1抗原结合分子同时施用。[0053]〔42〕〔32〕至〔40〕中任一项记载的药物组合物，其与第1抗原结合分子分别施用。[0054]〔43〕诱导细胞毒性、抑制细胞增殖、激活对癌细胞或包含癌细胞的肿瘤组织的免疫、或者治疗或预防癌症的方法，其包括施用前述〔1〕~〔5〕中任一项记载的抗原结合分子或者前述〔6〕~〔42〕中任一项记载的药物组合物的步骤。[0055]〔44〕前述〔1〕~〔5〕中任一项记载的抗原结合分子或者前述〔6〕~〔42〕中任一项记载的药物组合物，其用于在诱导细胞毒性、抑制细胞增殖、激活对癌细胞或包含癌细胞的组织的免疫、或者治疗或预防癌症中使用。[0056]〔45〕前述〔1〕~〔5〕中任一项记载的抗原结合分子在制备前述〔6〕~〔42〕中任一项记载的药物组合物中的应用。[0057]〔46〕制备前述〔6〕~〔42〕中任一项记载的药物组合物的方法，其包括使用前述〔1〕~〔5〕中任一项记载的抗原结合分子的步骤。[0058]另外，本发明涉及癌症治疗或预防方法，其特征在于向需要治疗的患者施用本发明的抗原结合分子或者本发明的药物组合物。另外，本发明涉及用于本发明方法的试剂盒，其包含本发明的抗原结合分子。另外，本发明涉及本发明的抗原结合分子在制备用于诱导细胞毒性的药物组合物例如，用于癌症的治疗或预防的药物组合物）中的应用。另外，本发明涉及用于在本发明的方法中使用的本发明的抗原结合分子或者本发明的药物组合物。附图说明[0059]【图1】是显示通过IFN-γELISA评价抗小鼠⑶137抗体产生的T细胞活化作用的结果的图。CtrlmlgGl表示阴性对照小鼠IgGl抗体。[0060]【图2】是概念上显示各种分子形式的抗小鼠⑶137抗体产生的T细胞活化作用的图。[0061]【图3】是概念上显示抗人GPC3抗小鼠CD137双特异性抗体产生的GPC3抗原依赖性T细胞活化作用的图。[0062]【图4】是显示通过IFN-γELISA评价抗人GPC3抗小鼠⑶137双特异性抗体产生的GPC3抗原依赖性T细胞活化作用的结果的图。[0063]【图5】是显示通过IFN-γELISA评价改变抗人GPC3抗小鼠⑶137双特异性抗体的抗体恒定区产生的对GPC3抗原依赖性T细胞活化作用的影响的结果的图。[0064]【图6】是显示通过IFN-γELISA评价抗人GPC3抗小鼠⑶137双特异性抗体与抗人GPC3抗小鼠CD3双特异性抗体的混合物产生的T细胞活化增强作用的结果的图。CtrlhlgGl表示阴性对照人IgGl抗体Alexis公司）。[0065]【图7】是显示抗人GPC3小鼠⑶137双特异性抗体和抗小鼠⑶137抗体在CT26肿瘤小鼠同基因（syngeneic模型中的抗肿瘤效果的图。箭头表示抗体施用时。[0066]【图8】是显示抗人GPC3小鼠⑶137双特异性抗体和抗小鼠⑶137抗体在CT26肿瘤小鼠同基因模型中对血中谷草转氨酶AST的影响的图。[0067]【图9】是显示抗人GPC3小鼠⑶137双特异性抗体和抗小鼠⑶137抗体在CT26肿瘤小鼠同基因模型中对血中谷丙转氨酶ALT的影响的图。[0068]【图10】是显示抗人GPC3小鼠CD137双特异性抗体和抗小鼠CD137抗体在CT26肿瘤小鼠同基因模型中对血中总胆红素的影响的图。[0069]【图11】是显示抗人GPC3小鼠CD137双特异性抗体和抗小鼠CD137抗体在CT26肿瘤小鼠同基因模型中的肝脏病理组织学所见的照片。分别地，a以及d是施用溶剂、b以及e是施用lD8-MB492、c以及f是施用GPC3ERY22-3-1D8的小鼠代表例的肝脏切片进行苏木精伊红染色的病理组织照片。箭头表示肝细胞的变性·坏死，*表示炎症所见。[0070]【图12】是显示抗人GPC3小鼠⑶137双特异性抗体和抗人GPC3小鼠⑶3双特异性抗体联用产生的在LLC肿瘤小鼠同基因模型中的抗肿瘤效果的图。箭头表示抗体施用时。[0071]【图13】是表示构成IgGl、IgG2、IgG3以及IgG4的Fc区的氨基酸残基与kabat的EU编号本说明书中也称为EUINDEX的关系的图。[0072]【图14-1】是显示用于评价抗人CD137抗体与片段化人CD137-FC融合蛋白质的结合的ELISA的结果的图。图中的"Non"表示不固定抗原的孔未包被）中的ELISA显色值。[0073]【图14-2】是显示图14-1中示出各样品的ELISA显色值除以未包被Non中的ELISA显色值对不固定抗原的孔的结合的值相对于未包被的比）的图。[0074]【图15】是显示抗人⑶137抗体的IFNγ诱导活性的图。[0075]【图16】是显示抗人CD137抗体的Τ细胞活化作用与结合曲线的图。[0076]【图17】是显示通过IFN-γELISA评价抗人GPC3抗小鼠CD40双特异性抗体与抗人GPC3抗小鼠CD3双特异性抗体的混合物产生的T细胞活化增强作用的结果的图。CtrlhIgG1表示阴性对照人IgG1抗体。[0077]【图18】是显示通过IFN-γELISA评价抗人GPC3抗人CD137双特异性抗体GPC3FAE-BMS的T细胞活化作用的结果的图。CtrlhlgGl表示阴性对照人IgGl抗体。[0078]【图19】是显示以B细胞活化IL-6的产生量评价各种抗人GPC3抗人⑶137双特异性抗体的⑶137介导的激动剂活性的结果的图。CtrlhlgGl表示阴性对照人IgGl抗体。具体实施方式[0079]以下定义是为了容易地理解本说明书中说明的本发明而提供。[0080]抗原结合分子本发明中的"抗原结合分子"是包含本发明的"结合结构域"的分子即可，没有特别限定，进一步地，也可以包含具有5个氨基酸左右以上的长度的肽、蛋白质。其不限于生物来源的肽、蛋白质，例如，也可以是由人工设计的序列组成的多肽。另外，其也可以是天然多肽、或合成多肽、重组多肽等中的任一种。[0081]本发明的抗原结合分子的优选例可以列举，含有抗体的Fc区中包含的FcRn结合结构域的抗原结合分子。作为延长活体内施用的蛋白质的血中半衰期的方法，向目的蛋白质加入抗体的FcRn结合结构域、利用FcRn介导的再循环功能的方法是公知的。[0082]本发明中，"FcRn结合结构域"具有对FcRn的结合活性即可，没有特别限定，例如，可列举以FcRn为抗原的抗体的可变区、Fab、抗体的Fc区、它们的片段。本发明的优选实施方式之一可列举抗体的Fc区、或者含有Fc区中的FcRn结合区域的片段。此处，"Fc区"可应用例如，来自天然型IgG的Fc区。天然型IgG意味着，包含与天然发现的IgG相同的氨基酸序列、并属于由免疫球蛋白γ基因实质上编码的抗体种类的多肽。例如，天然型人IgG意味着天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3、天然型人IgG4等。天然型IgG中也包含由其自然产生的突变体等。作为人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgG4抗体的恒定区，基因多态性引起的多数同种异型序列在Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,NIHPublicationNo.91-3242中记载，本发明中可应用其中任一。特别地，作为人IgGl的序列，EU编号第356~358位的氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。[0083]作为抗体的Fc区，存在例如IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM型的Fc区。本发明的抗体的Fc区可应用例如，天然型人IgG抗体衍生的Fc区。作为本发明的Fc区，可应用例如天然型IgG的恒定区，具体地，天然型人IgGl起源的恒定区（序列编号：1、天然型人IgG2起源的恒定区（序列编号:2、天然型人IgG3起源的恒定区（序列编号：3、天然型人IgG4起源的恒定区（序列编号:4衍生的Fc区。天然型IgG的恒定区中也包含由其自然产生的突变体等。[0084]这种抗体的Fc区可以如下适当获得，例如，将单克隆抗体等抗体用胃蛋白酶等蛋白酶部分消化，随后将片段吸附在蛋白A柱、或蛋白G柱，随后通过适当的洗脱缓冲液等洗脱。所述蛋白酶能够通过适当设定pH等酶反应条件消化单克隆抗体等抗体即可，没有特别限定，例如，可示例胃蛋白酶、无花果蛋白酶等。[0085]抗体的同种型由恒定区的结构决定。IgG1、IgG2、IgG3、IgG4各同种型的恒定区分别称为0丫1、0丫2、〇丫3、〇丫4。构成人0丫1、0丫2、0丫3、〇丫4的？：区的多肽的氨基酸序列在序列编号:5、6、7、8中示例。构成各氨基酸序列的氨基酸残基与kabat的EU编号本说明书中也称为EUINDEX的关系在图13中示出。[0086]Fc区指除去Fab'）2的区域，其包含二条轻链、以及包含使得链间二硫键在2个重链间形成的CH1结构域和CH2结构域间的恒定区的一部分的二条重链。构成本说明书中公开的抗原结合分子的Fc区可以通过将IgGl、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体等用胃蛋白酶等蛋白酶部分消化，随后将吸附在蛋白A柱上的级分再洗脱而适当获得。所述蛋白酶能够通过适当设定pH等酶反应条件限制性地消化全长抗体产生Fab'）2即可，没有特别限定，例如，可示例胃蛋白酶、无花果蛋白酶等。[0087]本发明的FcRn结合结构域特别优选对Fcγ受体的结合活性降低的结构域。此处，Fcγ受体本说明书中有时记载为Fcγ受体、FcγR或者FcgR指能够与IgGl、IgG2、IgG3、IgG4的Fc区结合的受体，也意味着实质上由Fey受体基因编码的蛋白质家族中的所有成员。在人中，该家族包括，包含同种型FcγRIa、FcγRib和FcγRIc的FcγRICD64;包含同种型FcγRlla包含同种异型Η131Η型）和R131R型）、FcγRllb包含FcγRIIb-1和FcγRIIb-2和FcyRIIc的FcyRIICD32;和包含同种型FcyRIIIa包含同种异型V158和F158和FcγRlllb包含同种异型FcγRIIIb-NAl和FcγRIIIb-NA2的FcγRIIICD16、以及所有未发现的人FcγR类或者FcγR同种型或者同种异型，但不限于这些。FcγR包括人、小鼠、大鼠、兔和猴子衍生的那些，但不限于这些，也可由所有生物衍生。小鼠FeyR类中包括FcγRICD64、FcγRIICD32、FcγRIIICD16和FcγRIII-2CD16-2、以及所有未发现的小鼠FcγR类或者FcγR同种型或者同种异型，但不限于这些。这样的Fcγ受体的适当例子可列举人FcγRICD64、FcγRllaCD32、FcγRllbCD32、FcγRlllaCD16和或FcyRIIIbCD16〇[0088]FcγR中存在携带ITAM基于免疫受体酪氨酸的活化基序）的活性型受体和携带ITIM基于免疫受体酪氨酸的抑制基序）的抑制型受体。FcγR分类为FcγRI、FcγRllaR、FcγRllaH、FcγRIIIa、FcγRlllb的活性型FcγR、与FcγRllb的抑制型FcγR。[0089]FcγRI的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别记载于NM_000566.3以及NP_000557.l，FcγRlla的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别记载于BC020823.1以及AAH20823.1，FcyRIIb的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别记载于BC146678.1以及AAI46679.l，FcγRllla的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别记载于BC033678.1以及AAH33678.1，以及FcγRlllb的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别记载于BC128562.1以及AAI28563.1RefSeq登录号）。另外，FcγRlla中存在FcγRlla的第131号氨基酸置换为组氨酸H型）或精氨酸R型）的2种基因多态性J.Exp.Med,172，19-25，1990。另外，FeyRllb中存在FcγRllb的第232号氨基酸置换为异亮氨酸（I型或苏氨酸（T型）的2种基因多态性Arthritis.Rheum.46:1242-12542002。另外，FcyRIIIa中存在FcyRIIIa的第158号氨基酸置换为缬氨酸V型或苯丙氨酸F型）的2种基因多态性J.Clin.Invest.1005:1059-10701997。另外，FcyRIIIb中存在ΝΑΙ型、NA2型2种基因多态性〇·Clin.Invest.85:1287-12951990。[0090]对Fcγ受体的结合活性是否降低可通过FACS、ELISA形式、ALPHA筛选扩增发光接近均匀试验）、利用表面等离子体共振（SPR现象的BIAC0RE法等公知的方法确认（Proc.Natl.Acad.Sci.USA200610311,4005-4010〇[0091]ALPHA筛选通过使用供体和受体2个珠的ALPHA技术基于下述原理实施。仅在与供体珠结合的分子和与受体珠结合的分子生物学相互作用、2个珠近接的状态时，检测到发光信号。通过激光激发的供体珠内的光敏剂将周边的氧转化为激发状态的单线态氧。单线态氧在供体珠周边扩散，到达接近的受体珠时引起珠内的化学发光反应，最终发出光。与供体珠结合的分子不和与受体珠结合的分子相互作用时，由于供体珠产生的单线态氧不到达受体珠，不引起化学发光反应。[0092]例如，在抗原结合分子含有抗体的Fc区作为FcRn结合结构域的情况下，制备具有野生型Fc区的抗原结合分子、与具有加入用于改变与Fcγ受体的结合的氨基酸突变而成的突变Fc区的抗原结合分子，使生物素标记的抗原结合分子与供体珠结合，使用谷胱甘肽S转移酶GST标签化的Fcγ受体与受体珠结合。在具有突变Fc区的抗原结合分子存在下，具有野生型Fc区的抗原结合分子与Fcγ受体相互作用生成520-620nm的信号。具有突变Fc区的抗原结合分子不进行标签化的情况下，其与具有野生型Fc区的抗原结合分子竞争Fcγ受体间的相互作用。通过对作为竞争的结果表示的荧光的减少进行定量，能够确定相对结合亲和性。应用Sulfo-NHS-生物素等对抗原结合分子生物素化是公知的。作为用GST对Fcγ受体标签化的方法，可以适当采用使编码Fcγ受体的多核苷酸与编码GST的多核苷酸符合读框地融合而成的融合基因在携带能够表达它们的载体的细胞等中表达，并应用谷胱甘肽柱纯化的方法等。得到的信号通过拟合于应用例如GRAPHPADPRISMGraphPad公司、SanDiego等的软件利用非线形回归分析的一站竞争one-sitecompetition模型而适当分析。[0093]观察相互作用的物质中的一个配体）固定在传感器芯片的金薄膜上，从传感器芯片的背侧照射光使得金薄膜与玻璃的界面发生全反射，则在反射光的一部分中形成反射强度降低的部分SPR信号）。观察相互作用的物质中的另一个分析物在传感器芯片表面流动且配体与分析物结合，则固定化的配体分子的质量增加，传感器芯片表面的溶剂的折射率改变。通过该折射率的改变，SPR信号的位置移动（相反，结合解离则信号的位置返回）。Biacore系统表示上述的移动量，也即以传感器芯片表面的质量变化为纵轴，以质量的时间变化作为测定数据传感器图）。从传感器图的曲线求得动力学参数:结合速度常数ka和解离速度常数kd，从该常数的比求得亲和力KD。在BIAC0RE法中，也适当应用抑制测定方法。抑制测定方法的例子在Proc.Natl.Acad.Sci.USA200610311，4005-4010中记载。[0094]本说明书中，"与Fcγ受体的结合活性降低"是指，例如，基于上述的分析方法，与作为对照的具有Fc区的抗原结合分子的结合活性比较，被测抗原结合分子的结合活性显示50%以下，优选地45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、20%以下、15%以下，特别优选地10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下的结合活性。[0095]作为对照的抗原结合分子可以适当使用例如具有包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4单克隆抗体的Fc区的结构域的抗原结合分子。该Fc区的结构在序列编号：1RefSeq登录号AAC82527.1的N末端添加A、序列编号：2RefSeq登录号AAB59393.1的N末端添加A、序列编号:3RefSeq登录号CAA27268.1的N末端添加A、序列编号:4RefSeq登录号AAB59394.1的N末端添加A中记载。另外，使用具有某种特定同种型的抗体的Fc区的突变体的抗原结合分子作为被测物质的情况下，通过应用具有该特定同种型的抗体的Fc区的抗原结合分子作为对照，验证该突变体具有的突变引起的对于与Fey受体的结合活性的效果。如上述，验证了与Fcγ受体的结合活性降低的具有Fc区的突变体的抗原结合分子得以适当制备。[0096]作为这种突变体的例子，按照EU编号指定的氨基酸231A-238S的缺失W02009011941、C226S、C229S、P238S、（C220SJ.Rheumatol200734，11、C226S、C229SHum.Antibod.Hybridomas199011，47-54、C226S、C229S、E233P、L234V、L235ABlood2007109，1185-1192等突变体是公知的。[0097]也即，适当列举具有下列Fc区的抗原结合分子，在构成特定同种型的抗体的Fc区的氨基酸之中，按照EU编号指定的下述任一氨基酸:220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、332位被置换。作为Fc区的起源的抗体的同种型没有特别限定，可适当利用源自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4单克隆抗体的Fc区，适当利用源自天然型人IgGl抗体的Fc区。[0098]例如，也可以适当使用具有下列Fc区的抗原结合分子，在构成IgGl抗体的Fc区的氨基酸之中，进行按照EU编号指定的下述任一的置换数字是按照EU编号指定的氨基酸残基的位置，分别地，位于数字前的单字母氨基酸密码表示置换前的氨基酸残基，位于数字后的单字母氨基酸密码表示置换前的氨基酸残基的Fc区：aL234F、L235E、P331S、bC226S、C229S、P238S、cC226S、C229S、dC226S、C229S、E233P、L234V、L235A，或从231位至238位的氨基酸序列缺失的Fc区。[0099]另外，也可以适当使用具有下列Fc区的抗原结合分子，在构成IgG2抗体的Fc区的氨基酸之中，进行按照EU编号指定的下述任一的置换数字是按照EU编号指定的氨基酸残基的位置，分别地，位于数字前的单字母氨基酸密码表示置换前的氨基酸残基，位于数字后的单字母氨基酸密码表示置换前的氨基酸残基的Fc区：eH268Q、V309L、A330S、P331SfV234AgG237AhV234A、G237AiA235E、G237AjV234A、A235E、G237A。[0100]另外，也可以适当使用具有下列Fc区的抗原结合分子，在构成IgG3抗体的Fc区的氨基酸之中，进行按照EU编号指定的下述任一的置换数字是按照EU编号指定的氨基酸残基的位置，分别地，位于数字前的单字母氨基酸密码表示置换前的氨基酸残基，位于数字后的单字母氨基酸密码表示置换前的氨基酸残基的Fc区：kF241ADD265AmV264A。[0101]另外，也可以适当使用具有下列Fc区的抗原结合分子，在构成IgG4抗体的Fc区的氨基酸之中，进行按照EU编号指定的下述任一的置换数字是按照EU编号指定的氨基酸残基的位置，分别地，位于数字前的单字母氨基酸密码表示置换前的氨基酸残基，位于数字后的单字母氨基酸密码表示置换前的氨基酸残基的Fc区：nL235A、G237A、E318AoL235EpF234A、L235A。[0102]作为其它的优选例，可列举具有下列Fc区的抗原结合分子，在构成天然型人IgGl抗体的Fc区的氨基酸之中，按照EU编号指定的下述任一氨基酸置换为对应的IgG2或者IgG4中该EU编号对应的氨基酸:233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、331位。[0103]作为其它的优选例，可适当列举具有下列Fc区的抗原结合分子，在构成天然型人IgGl抗体的Fc区的氨基酸之中，按照EU编号指定的下述任一或一个以上的氨基酸置换为其它氨基酸:234位、235位、297位。置换后存在的氨基酸的种类没有特别限定，具有234位、235位、297位的任一或一个以上的氨基酸置换为丙氨酸的Fc区的抗原结合分子是特别优选的。[0104]作为其它的优选例，可适当列举具有下列Fc区的抗原结合分子，在构成IgGl抗体的Fc区的氨基酸之中，按照EU编号指定的265位的氨基酸置换为其它氨基酸。置换后存在的氨基酸的种类没有特别限定，具有265位的氨基酸置换为丙氨酸的Fc区的抗原结合分子是特别优选的。[0105]本发明的抗原结合分子中包含的"癌症特异性抗原结合结构域"、"肿瘤坏死因子TNF超家族结合结构域"、"肿瘤坏死因子TNF受体超家族结合结构域"以及"T细胞受体复合物结合结构域"（下文中，这4种结合结构域总称为抗原结合结构域意味着，与作为各自的抗原的癌症特异性抗原、属于TNF超家族的因子、属于TNF受体超家族的因子、或T细胞受体复合物的一部分或者全部特异性结合的区域，例如，包含抗体的抗原结合区域的区域列举为结合结构域。在抗原的分子量大的情况下，抗体的抗原结合区域仅能够与抗原的特定部分结合。该特定部分称为表位。抗原结合结构域可由一个或者多个抗体的可变结构域提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区VL和抗体重链可变区VH。这种抗原结合结构域的例子可适当列举"scFv单链Fv"、"单链抗体singlechainantibody"、"Fv"、"scFv2单链Fv2"、"Fab"或者"Fab'）2"等。[0106]此处，"癌症特异性抗原"可将癌细胞与健康细胞区分，意味着癌细胞表达的抗原，例如，其包含伴随细胞的恶化而表达的抗原，或细胞癌化时细胞表面、蛋白质分子上出现的异常的糖链。具体地，可列举例如，ALK受体多营养因子受体）、多营养因子、KS14胰腺癌抗原、卵巢癌抗原（CA125、前列腺酸磷酸、前列腺特异性抗原（PSA、黑色素瘤相关抗原P97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量黑色素瘤抗原HMW-MAA、前列腺特异性膜抗原、癌胚抗原CEA、多型上皮粘蛋白抗原、人乳脂肪球抗原，CEA、TAG-72、C017-1A、GICA19-9、CTA-1和LEA等的结肠直肠肿瘤相关抗原，Burkitt淋巴瘤抗原-38.13、CD19、人B淋巴瘤抗原-⑶20、CD33，神经节苷脂⑶2、神经节苷脂⑶3、神经节苷脂GM2和神经节苷脂GM3等黑色素瘤特异性抗原，肿瘤特异性移植型细胞表面抗原TSTA，T抗原、DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的包膜抗原等由病毒诱导的肿瘤抗原，结肠的CEA、5T4癌胚滋养层糖蛋白和膀胱肿瘤癌胚抗原等癌胚抗原甲胎蛋白、人肺癌抗原L6和L20等分化抗原、纤维肉瘤的抗原、人白血病T细胞抗原Gp37、拟糖蛋白、鞘脂、EGFR上皮增殖因子受体等乳癌抗原、NY-BR-16、NY-BR-16和HER2抗原P185HER2、多型上皮粘蛋白（PEM、恶性人淋巴球抗原AP0-1、胎儿红细胞中发现的I抗原等分化抗原、成人红细胞中发现的原内胚层I抗原、移植前的胚、胃癌中发现的IMa、乳腺上皮中发现的M18、M39、骨髓细胞中发现的SSEA-l、VEP8、VEP9、Myl、V頂-D5、结肠直肠癌中发现的〇156-2231^-1-85血液组!1、睾丸和卵巢癌中发现的50?-1、结肠癌中发现的C14、肺癌中发现的F3、胃癌中发现的AH6、Y半抗原、胚性癌细胞中发现的Ley、TL5血液组A、A431细胞中发现的EGF受体、胰腺癌中发现的E1系列血液组B、胚性癌细胞中发现的FC10.2、胃癌抗原、腺癌中发现的⑶-514血液组Lea、腺癌中发现的NS-10、⑶-43血液组Leb、A431细胞的EGF受体中发现的G49、结肠癌中发现的MH2血液组ALebLey、结肠癌中发现的19.9、胃癌粘蛋白、骨髓细胞中发现的T5A7、黑色素瘤中发现的R24、胚性癌细胞中发现的4.2、⑶3、01.1、0?厶-1、612、0?厶-2、02、和姐：22:25:8以及4~8细胞阶段的胚中发现的SSEA-3和SSEA-4、皮下T细胞淋巴瘤抗原、MART-1抗原、唾液酰TnSTn抗原、结肠癌抗原NY-C0-45、肺癌抗原NY-LU-12突变体A、腺癌抗原ART1、副肿瘤性相关脑-睾丸癌抗原癌神经抗原MA2、副肿瘤性神经抗原）、神经癌腹部抗原2N0VA2、血液细胞癌抗原基因520、肿瘤相关抗原⑶-029、肿瘤相关抗原MAGE-C1癌睾丸抗原CT7、MAGE-B1MAGE-XP抗原）、MAGE-B2DAM6、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b和MAGE-X2、癌-睾丸抗原NY-E0S-l、YKL-40和上述多肽中任一的片段或者对它们修饰而成的结构等（前述的修饰磷酸基、糖链等）、EpCAM、EREG、CA19-9、CA15-3、唾液酰SSEA-1SLX、HER2、PSMA、CEA、CLEC12A等。作为本发明的癌症特异性抗原结合结构域的对象的癌症特异性抗原特别优选在细胞表面表达的那些，这种癌症特异性抗原列举例如，CD19、CD20、EGFR、HER2、EpCAM、EREG。[0107]另外，作为属于"TNF超家族"或"TNF受体超家族"的因子，促成各种免疫细胞的活化的、具有3聚体结构的配体和该配体结合的3聚体结构的受体是已知的（Nat.Rev.Immunol.，2012，12，339-51。作为属于TNF超家族或TNF受体超家族的因子，可列举例如CD137、CD137L、CD40、CD40L、0X40、0X40L、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、RANK、RANKL、CD30、〇0153、61了1?、61了此。作为优选因子，可列举例如0137、040。作为进一步优选的因子，可列举例如CD137。[0108]另外，"T细胞受体复合物"可以是T细胞受体自身，也可以是构成T细胞受体连同T细胞受体复合物的衔接头分子。作为衔接头分子的适当分子是CD3。[0109]作为Τ细胞受体，可以是可变区，也可以是恒定区，优选的Τ细胞受体结合结构域结合的表位是恒定区中存在的表位。作为恒定区的序列，可列举例如RefSeq登录号CAA26636.1的T细胞受体α链序列编号：9、RefSeq登录号C25777的T细胞受体β链序列编号：10、RefSeq登录号Α26659的Τ细胞受体γ1链序列编号：11、RefSeq登录号ΑΑΒ63312.1的T细胞受体γ2链序列编号：12、RefSeq登录号AAA61033.1的T细胞受体δ链序列编号：13的序列。[0110]本发明中，在"CD3结合结构域"用作Τ细胞受体复合物结合结构域的情况下，CD3结合结构域可以通过一个或多个抗体可变结构域提供。优选地，CD3结合结构域包含CD3抗体的轻链可变区（VL和⑶3抗体的重链可变区（VH。这种⑶3结合结构域的例子可适当列举"scFv单链Fv"、"单链抗体singlechainantibody"、"Fv"、"scFv2单链Fv2"、"Fab"或者卞妯'）2"等。[0111]本发明所述的CD3结合结构域可以与任一表位结合，只要是构成人CD3的γ链、δ链或ε链序列中存在的表位即可。本发明中，优选地，与人CD3复合物的ε链的细胞外区域中存在的表位结合的包含CD3抗体的轻链可变区VL和CD3抗体的重链可变区VH的CD3结合结构域被适当使用。作为这种CD3结合结构域，包含0ΚΤ3抗体Proc.Natl.Acad.Sci.USA198077，4914-4917、各种公知的⑶3抗体的轻链可变区（VL和⑶3抗体的重链可变区VH的CD3结合结构域被适当使用。另外，通过前述方法用构成人CD3的γ链、δ链或ε链免疫期望的动物获得的具有期望性质的CD3抗体所衍生的CD3结合结构域可适当使用。作为CD3结合结构域的来源的CD3抗体适当使用如下述适当人源化的抗体、人抗体。对于构成CD3的γ链、S链或ε链的结构，其多核苷酸序列在序列编号：14ΝΜ_000073.2、16ΝΜ_000732.4以及18ΝΜ_000733.3中记载，其多肽序列在序列编号：15ΝΡ_000064.1、17ΝΡ_000723.1以及19ΝΡ_000724.1中记载括号内表示RefSeq登录号）。[0112]另外，本发明的"抗原结合分子"的优选实施方式之一可列举，包含本发明的抗体的可变区的抗体。[0113]本发明中提供的抗体的例子可列举以下[1]至[9]的抗体。[0114][1]具有序列编号66中记载的氨基酸序列作为重链可变区、以及序列编号85中记载的氨基酸序列作为轻链可变区的抗体；[2]具有序列编号67中记载的氨基酸序列作为重链可变区、以及序列编号86中记载的氨基酸序列作为轻链可变区的抗体；[3]具有序列编号70中记载的氨基酸序列作为重链可变区、以及序列编号89中记载的氨基酸序列作为轻链可变区的抗体；[4]具有序列编号76中记载的氨基酸序列作为重链可变区、以及序列编号95中记载的氨基酸序列作为轻链可变区的抗体；[5]具有序列编号77中记载的氨基酸序列作为重链可变区、以及序列编号96中记载的氨基酸序列作为轻链可变区的抗体；[6]具有序列编号78中记载的氨基酸序列作为重链可变区、以及序列编号97中记载的氨基酸序列作为轻链可变区的抗体；[7][1]~阅中任一项中记载的抗体，具有序列编号99中记载的氨基酸序列作为重链恒定区、以及序列编号59中记载的氨基酸序列或序列编号60中记载的氨基酸序列作为轻链恒定区的抗体；[8]与[1]~[7]中任一项中记载的抗体具有同等的活性的抗体；[9]与与[1]~[7]中任一项中记载的抗体结合的表位相同的表位结合的抗体。[0115]上述[8]中记载的抗体中，"同等的活性"是指，对⑶137的激动剂活性是上述[1]~[7]中任一项中记载的抗体的结合活性的70%以上、优选地80%以上、更优选地90%以上。[0116]另外，本发明也另外提供上述[9]中记载的、与与本发明公开的抗CD137抗体结合的表位相同的表位结合的抗体。这种抗体可以通过例如以下的方法得到。[0117]被测抗体与特定抗体共享表位可以通过这两者对相同表位的竞争而确认。抗体间的竞争通过交叉阻断cross-blocking分析等检测。例如，竞争ELISA分析是优选的交叉阻断分析。具体地，在交叉阻断分析中，将微量滴定板的孔上包被的CD137蛋白质在候选的竞争抗体存在下或者非存在下预温育后，添加本发明的抗CD137抗体。与孔中的CD137蛋白质结合的本发明的抗CD137抗体的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗体被测抗体的结合能力间接相关。也即，对于同一表位被测抗体的亲和性越大，本发明的抗CD137抗体与包被CD137蛋白质的孔的结合量越低，被测抗体与包被CD137蛋白质的孔的结合量越增加。[0118]与孔结合的抗体量可以通过预先标记抗体而容易地测定。例如，生物素标记的抗体可以通过使用抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物和适当的底物测定。特别地，利用过氧化物酶等的酶标记的交叉阻断分析称为竞争ELISA分析。抗体可以用能够检测或测定的其它标记物质标记。具体地，放射标记或荧光标记等是公知的。[0119]进一步，在被测抗体具有来自与本发明的抗CD137抗体不同的种类的恒定区的情况下，与孔结合抗体的量也可以通过识别该抗体的恒定区的标记抗体测定。或者，即使是来自同种类的抗体，在类型不同的情况下，通过识别各类型的抗体，可以测定与孔的结合的抗体的量。[0120]与候选的竞争抗体不存在下实施的对照试验中得到的结合活性比较，如果候选抗体可以阻断抗⑶137抗体的结合至少20%、优选地至少20~50%、进一步优选地至少50%，则该候选竞争抗体是结合与本发明的抗CD137抗体实质上相同的表位、或竞争结合相同表位的抗体。[0121]作为与上述[1]至[7]中任一项中记载的抗体结合的表位相同的表位结合的抗体的优选例子，可列举例如，识别具有CD137蛋白质中的SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC的序列序列编号113的区域的抗体。[0122]进一步地，可以列举识别具有CD137蛋白质中的DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC的序列序列编号108的区域的抗体。[0123]通过将上述的抗人CD137抗体改变为与癌症特异性抗原抗体例如，抗人GPC3抗体的双特异性抗体，评价癌症特异性抗原依赖性CD137激动剂能力，可以提供发挥期望的抗肿瘤效果的抗癌症抗原抗人CD137双特异性抗体。[0124]作为本发明的非限定性的一个实施方式，提供包含癌症特异性抗原结合结构域以及人CD137结合结构域的双特异性抗体。[0125]本发明中提供的双特异性抗体的例子可以列举以下[i]至[iv]的抗体。[0126][i]双特异性抗体，具有序列编号122中记载的氨基酸序列重链可变区）、以及序列编号123中记载的氨基酸序列轻链可变区作为人CD137结合结构域；[ii]双特异性抗体，具有序列编号124中记载的氨基酸序列（重链可变区）、以及序列编号82中记载的氨基酸序列轻链可变区作为人CD137结合结构域；[iii]双特异性抗体，具有序列编号125中记载的氨基酸序列重链可变区）、以及序列编号84中记载的氨基酸序列轻链可变区作为人CD137结合结构域；[iv]与与[i]~[iii]中任一项中记载的双特异性抗体结合的表位相同的表位结合的抗体。[0127]对于癌症特异性抗原结合结构域中包含的重链可变区以及轻链可变区，取决于作为靶的癌症抗原，本领域技术人员可以适当选择与该癌抗原结合的重链可变区序列以及轻链可变区序列。[0128]另外，本发明也另外提供了上述[iv]中记载的、与与本发明中公开的抗癌症特异性抗原抗人CD137双特异性抗体结合的表位相同的表位结合的双特异性抗体。这种抗体可以例如通过以下的方法得到。[0129]被测抗体与特定抗体共享表位可以通过这两者对相同表位的竞争而确认。抗体间的竞争通过交叉阻断分析等检测。例如，竞争ELISA分析是优选的交叉阻断分析。具体地，交叉阻断分析中，将微量滴定板的孔上包被的CD137蛋白质在候选的竞争抗体存在下或者非存在下预温育后，添加本发明的抗CD137抗体。与孔中的CD137蛋白质结合的本发明的抗CD137抗体的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗体被测抗体）的结合能力间接相关。也即，对于同一表位被测抗体的亲和性越大，本发明的抗CD137抗体与包被CD137蛋白质的孔的结合量越低，被测抗体与包被CD137蛋白质的孔的结合量越增加。[0130]与孔结合的抗体量可以通过预先标记抗体而容易地测定。例如，生物素标记的抗体可以通过使用抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物和适当的底物测定。特别地，利用过氧化物酶等的酶标记的交叉阻断分析称为竞争ELISA分析。抗体可以用能够检测或测定的其它标记物质标记。具体地，放射标记或荧光标记等是公知的。[0131]进一步，在被测抗体具有来自与本发明的抗CD137抗体不同的种类的恒定区的情况下，与孔结合抗体的量也可以通过识别该抗体的恒定区的标记抗体测定。或者，即使是来自同种类的抗体，在类型不同的情况下，通过识别各类型的抗体，可以测定与孔的结合的抗体的量。[0132]与候选的竞争抗体不存在下实施的对照试验中得到的结合活性比较，如果候选抗体可以阻断抗⑶137抗体的结合至少20%、优选地至少20~50%、进一步优选地至少50%，则该候选竞争抗体是结合与本发明的抗CD137抗体实质上相同的表位、或竞争结合相同表位的抗体。[0133]作为又一实施方式，被测抗体关于与其它抗体结合而竞争或者交差竞争的能力可以由本领域技术人员利用该技术领域中已知的标准合分析而适当确定，例如BIAcore分析、或者流式细胞术等。[0134]另外，确定表位的空间构象的方法包含例如，X线结晶学和二维核磁共振（参见MethodsinMolecularBiology,G.E.Morrised.,Vol.66,EpitopeMappingProtocols1996〇[0135]作为与与上述[i]至[iii]中任一项中记载的双特异性抗体结合的人CD137表位相同的表位结合的双特异性抗的优选例子，可以列举例如，识别具有人CD137蛋白质中的SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC的序列（序列编号113的区域、具有DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC的序列（序列编号108的区域、具有LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC的序列（序列编号111的区域、或具有LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTC的序列序列编号106的区域的双特异性抗体。[0136]进一步优选地，可以列举例如，识别具有人CD137蛋白质中的LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC的序列（序列编号111的区域、或具有LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTC的序列（序列编号106的区域的双特异性抗体。[0137]作为本发明的非限定性的一个实施方式，提供了包含癌症特异性抗原结合结构域以及人CD40结合结构域的双特异性抗体。[0138]对于癌症特异性抗原结合结构域中包含的重链可变区以及轻链可变区，取决于作为靶的癌症抗原，本领域技术人员能够适当选择与该癌抗原结合的重链可变区序列以及轻链可变区序列。[0139]抗体的结合活性抗体的抗原结合活性的测定中可以使用公知的手段AntibodiesALaboratoryManual.EdHarlow,DavidLane,ColdSpringHarborLaboratory,1988。例如，可以使用ELISA酶联免疫吸附测定法）、EIA酶免疫测定法）、RIA放射免疫测定法）、FACS、ALPHA筛选扩增发光接近均匀试验）、利用表面等离子体共振SPR现象的BIAC0RE法或荧光免疫法等。进一步，作为测定抗体对细胞中表达的抗原的结合活性的方法，可以列举例如，前述AntibodiesALaboratoryManual中第359-420页中记载的方法。[0140]另外，作为测定缓冲液等中悬浮的细胞表面上表达的抗原和抗体对该抗原的结合的方法，特别地，可以适当应用使用流式细胞仪的方法。使用的流式细胞仪可以列举例如，FACSCanto™II，FACSAria™，FACSArray™，FACSVantage™SE，FACSCalibur™以上来自BDBiosciences公司），EPICSALTRAHyPerSort，CytomicsFC500，EPICSXL-MCLADCEPICSXLADC,CellLabQuantaCellLabQuantaSC以上来自BeckmanCoulter公司）等。[0141]作为被测CD137抗体对抗原的结合活性的适当的测定方法的一个例子，可以列举下列方法，用识别与表达CD137的细胞反应的被测抗体的FITC标记的二次抗体染色后，用FACSCaliburBD公司）测定，用CELLQUESTSoftwareBD公司）分析其荧光强度。[0142]选述本说明书，抗体是指天然的、或者通过部分或完全合成制备的免疫球蛋白。抗体可以从其天然存在的血浆、血清等天然资源或产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清分离，或者可以通过利用基因重组等的方法部分或完全合成。抗体的例子可以适当列举免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚类。人免疫球蛋白已知IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgM9种类型洞种型）。本发明的抗体可以包含这些同种型之中的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。[0143]制备具有期望的结合活性的抗体的方法是本领域技术人员公知的，可以作为多克隆或者单克隆抗体获得。作为本发明的抗体，可以适当制备来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体包含通过杂交瘤产生的抗体、和通过遗传工程技术由包含抗体基因的表达载体转化的宿主细胞产生的抗体等。[0144]为了获得抗体而免疫的哺乳动物不限于特定的动物，优选地，考虑与用于制备杂交瘤的细胞融合中使用的亲本细胞的相容性而选择。一般地，适当使用啮齿类动物例如小鼠、大鼠、仓鼠，或兔、猴等。[0145]按照公知的方法用敏化抗原免疫上述动物。例如，作为一般的方法，通过向哺乳动物的腹腔内或者皮下注射而施用敏化抗原，实施免疫。具体地，用PBS磷酸缓冲盐水）、生理盐水等以适当稀释倍率稀释的敏化抗原按照期望与常规的佐剂例如弗式完全佐剂混合，乳化后，该敏化抗原以4至21日间隔向哺乳动物施用数次。另外，敏化抗原免疫时可以施用适当的载体。特别地，分子量小的部分肽用作敏化抗原的情况下，有时期望用与白蛋白、匙孔血蓝蛋白等载体蛋白质缀合的该敏化抗原肽免疫。[0146]另外，产生期望抗体的杂交瘤可以使用DNA免疫如下制备。DNA免疫是这样的免疫方法，在施用了以可使免疫动物中表达编码该抗原蛋白质的基因的方式构建的载体DNA的该免疫动物中，通过敏化抗原在该免疫动物体内表达，而赋予免疫刺激。与向免疫动物施用蛋白质抗原的一般的免疫方法相比，DNA免疫如下述预期是优异的。[0147]-维持膜蛋白质的结构并能够给予免疫刺激-无需纯化免疫抗原。[0148]为了通过DNA免疫得到本发明的单克隆抗体，首先，向免疫动物施用表达抗原蛋白质的DNA。编码抗原蛋白质的DNA可以通过PCR等公知的方法合成。得到的DNA插入适当的表达载体中，向免疫动物施用。表达载体可以适当利用例如pcDNA3.1等市售的表达载体。载体向生物体的施用方法可以利用一般应用的方法。例如，通过将表达载体吸附的金粒子用基因枪向免疫动物个体细胞内导入，进行DNA免疫。[0149]如此免疫哺乳动物，确认血清中与抗原结合的抗体效价升高之后，从哺乳动物采取免疫细胞，提供进行细胞融合。优选的免疫细胞可以特别使用脾细胞。[0150]与前述免疫细胞融合的细胞应用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具有用于筛选的适当的选择标记物。选择标记物是指能够或不能在特定的培养条件下生存的性质。选择标记物公知次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺失（以下简称为HGPRT缺失）、或胸苷激酶缺失（以下简称为TK缺失等。具有HGPRT、TK缺失的细胞具有次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷敏感性（以下简称为HAT敏感性）。撤!1敏感性的细胞在HAT选择培养基中不能进行DNA合成而死亡，但是，与正常细胞融合则能够利用正常细胞的补救途径继续DNA合成，因而即使在HAT选择培养基中也增殖。[0151]HGPRT缺失、TK缺失的细胞可以在分别包含6-硫代鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤（以下简称为SAG、或5'-溴脱氧尿苷的培养基中选择。在DNA中掺入这些嘧啶类似物的正常细胞死亡。另一方面，没有掺入这些嘧啶类似物的缺失这些酶的细胞能够在选择培养基中生存。此外，称为G418抗性的选择标记物通过新霉素抗性基因赋予对2-脱氧链霉胺系抗生素庆大霉素类似物的抗性。适于细胞融合的各种骨髓瘤细胞是公知的。[0152]作为这种骨髓瘤细胞，可以适当使用例如，？3?3163六88.6531.1111111龍〇1·19791234，1548-1550、P3x63Ag8U.lCurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology197881，1-7、NS-1C.Eur.J.Immunol.197667，511-519、MPC-11Cell197683,405-415^SP20Nature19782765685,269-270^F0J.Immunol.Methods1980351-2,1-21^S1945.XX0.BU.1J.Exp.Med.19781481,313-323、R210Nature19792775692,131-133等。[0153]基本上依照公知的方法，例如KohlerandMilstein等的方法MethodsEnzymol·198173,3-46等，进行前述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。[0154]更具体地，例如，在细胞融合促进剂存在下在常规的营养培养液中，可以实施前述细胞融合。融合促进剂使用例如聚乙二醇PEG、仙台病毒HVJ等，为了进一步提高融合效率按照期望添加使用二甲亚砜等辅助剂。[0155]免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞，免疫细胞为1至10倍为优选。作为前述细胞融合中应用的培养液，例如，使用适于前述骨髓瘤细胞株的增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、此外还有这种细胞培养中应用的常规的培养液，进一步地，可以适当添加胎牛血清FCS等血清补充液。[0156]对于细胞融合，将前述免疫细胞与骨髓瘤细胞以预定量在前述培养液中充分混合，将预先加温为37°C左右的PEG溶液例如平均分子量1000至6000左右）以通常30至60%wv的浓度添加。通过将混合液轻轻混合，期望的融合细胞杂交瘤形成。随后，逐渐添加上述列举的适当的培养液，通过反复离心除去上清，能够除去不利于杂交瘤生长的细胞融合剂等。[0157]如此得到的杂交瘤可以通过常规的选择培养液例如HAT培养液包含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养液培养而选择。可以应用上述HAT培养液继续培养足够时期通常，所述足够时期是数日至数周）以杀死期望的杂交瘤以外的细胞非融合细胞）。随后，通过常规的有限稀释法，实施产生期望抗体的杂交瘤的筛选和单一克隆。[0158]如此得到的杂交瘤可以利用根据用于细胞融合的骨髓瘤具有的选择标记物的选择培养液选择。例如，具有HGPRT、TK缺失的细胞可以通过HAT培养液包含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养液培养而选择。也即，在HAT敏感性骨髓瘤细胞用于细胞融合的情况下，在HAT培养液中，与正常细胞成功进行细胞融合的细胞可以选择性增殖。应用上述HAT培养液继续培养足够时期以杀死期望的杂交瘤以外的细胞非融合细胞）。具体地，一般通过数日至数周的培养，可以选择期望的杂交瘤。随后，通过常规的有限稀释法，可以实施产生期望抗体的杂交瘤的筛选和单一克隆。[0159]期望抗体的筛选和单一克隆可以通过基于公知的抗原抗体反应的筛选方法适当实施。期望抗体可以例如通过FACS荧光激活细胞分选术筛选。FACS是这样的系统，其通过用激光分析与荧光抗体接触的细胞并测定各个细胞发出的荧光而能够测定抗体与细胞表面的结合。[0160]为了通过FACS筛选产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤，首先配制表达产生的抗体结合的抗原的细胞。用于筛选的优选细胞是强制表达该抗原的哺乳动物细胞。通过将用作宿主细胞的未转化的哺乳动物细胞作为对照应用，能够选择性检测抗体对细胞表面的抗原的结合活性。也即，通过选择不与宿主细胞结合、与强制表达抗原的细胞结合的产生抗体的杂交瘤，能够获得产生期望单克隆抗体的杂交瘤。[0161]或者，将表达作为对象的抗原的细胞固定，能够基于ELISA的原理评价抗体对该抗原表达细胞的结合活性。例如，在ELISA板的孔中固定抗原表达细胞。使杂交瘤的培养上清与孔内的固定细胞接触，检测与固定细胞结合的抗体。在单克隆抗体衍生自小鼠的情况下，与细胞结合的抗体可通过抗小鼠免疫球蛋白抗体检测。通过这些筛选选择的产生对抗原具有结合能力的期望抗体的杂交瘤可以通过有限稀释法等克隆。[0162]如此制备的产生单克隆抗的杂交瘤可以在常规的培养液中传代培养。另外，该杂交瘤可以在液氮中长期保存。[0163]按照常规方法培养该杂交瘤，能够从该培养上清获得期望的单克隆抗体。或者，将杂交瘤施用于与其具有相容性的哺乳动物并增殖，能够从其腹水中获得单克隆抗体。前者的方法适于得到高纯度的抗体。[0164]也可以适当应用从该杂交瘤等抗体产生细胞克隆的抗体基因所编码的抗体。通过将克隆的抗体基因掺入适当的载体导入宿主，表达该基因所编码的抗体。用于抗体基因的分离、载体的导入、以及宿主细胞的转化的方法例如，已经由Vandamme等确立（Eur.J.Biochem.19901923，767-775。如下述的重组抗体的制备方法也是另外公知的。[0165]为了获得编码抗体的可变区V区）的cDNA，通常，首先从杂交瘤提取总RNA。用于从细胞提取mRNA的方法可以利用例如如下的方法。[0166]-胍超速离心法Biochemistry19791824，5294-5299-AGPC法（Anal.Biochem.19871621，156-159。[0167]提取的mRNA可以使用例如mRNAPurificationKitGEHealthcareBioscience制）等纯化。或者，如QuickPrepmRNAPurificationKitGEHealthcareBioscience制）等的用于从细胞直接提取总mRNA的试剂盒也是市售的。应用这样的试剂盒，能够从杂交瘤获得mRNA。从得到的mRNA，可以用逆转录酶合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可以通过AMVReverseTranscriptaseFirst-strandcDNASynthesisKit生化学工业公司制）等合成。另外，为了cDNA的合成和扩增，可以适当利用SMARTRACEcDNA扩增试剂盒Clontech制）和应用PCR的5'-RACE法Proc.Natl.Acad.Sci.USA19888523，8998-9002、NucleicAcidsRes.198917⑶，2919-2932。进一步，在这样的cDNA合成过程中，可以在cDNA的两个末端导入后述的适当限制酶位点。[0168]从得到的PCR产物纯化作为目的的cDNA片段，随后与载体DNA连接。如此制备重组载体，选择导入大肠杆菌等的克隆后，可以从形成该克隆的大肠杆菌配制期望的重组载体。随后，关于该重组载体是否具有作为目的的cDNA的核苷酸序列，通过公知的方法例如双脱氧核苷酸链终止法等确认。[0169]为了获得编码可变区的基因，利用使用用于可变区基因扩增的引物的5'_RACE法是简便的。首先，以由杂交瘤细胞提取的RNA为模板合成cDNA，得到5'-RACEcDNA文库。5'-RACEcDNA文库的合成中适当应用SMARTRACEcDNA扩增试剂盒等市售的试剂盒。[0170]以得到的5'-RACEcDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。基于公知的抗体基因序列，可以设计用于小鼠抗体基因扩增的引物。这些引物按照免疫球蛋白的亚类为不同的核苷酸序列。因此，期望预先用IsoStrip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒（RocheDiagnostics等市售试剂盒确定亚类。[0171]具体地，例如，在以获得编码小鼠IgG的基因为目的时，可以利用能够扩增编码作为重链的γ1、γ2a、γ2b、γ3、作为轻链的κ链和λ链的基因的引物。为了扩增IgG的可变区基因，一般地，3'侧的引物中利用与靠近可变区的恒定区相当的部分退火的引物。另一方面，5'侧的引物中利用5'RACEcDNA文库制备试剂盒所附带的引物。[0172]利用如此扩增的PCR产物，可以重构由重链和轻链的组合形成的免疫球蛋白。以重构的免疫球蛋白对抗原的结合活性为指标，可筛选期望抗体。例如可以如下筛选；1使含有由杂交瘤得到的cDNA编码的V区的抗体与期望的抗原表达细胞接触的步骤、2检测该抗原表达细胞与抗体的结合的步骤，和3选择与该抗原表达细胞结合的抗体的步骤。[0173]检测抗体与该抗原表达细胞的结合的方法是公知的。具体地，通过前述FACS等技术，能够检测抗体与该抗原表达细胞的结合。为了评价抗体的结合活性，可以适当利用该抗原表达细胞的固定标本。[0174]作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，也适当应用利用噬菌体载体的淘选方法。在从多克隆抗体表达细胞群以重链和轻链的亚类的文库获得抗体基因的情况下，利用噬菌体载体的筛选方法是有利的。编码重链和轻链的可变区的基因可以通过用适当的接头序列连接形成单链FvscFv。通过将编码scFv的基因插入B策菌体载体，可以获得scFv在表面表达的噬菌体。该噬菌体与期望抗原接触后，通过回收与抗原结合的噬菌体，能够回收编码具有目的结合活性的scFv的DNA。通过按照需要重复该操作，能够富集具有期望结合活性的scFv〇[0175]得到编码作为目的的抗体的V区的cDNA后，通过识别在该cDNA的两个末端插入的限制酶位点的限制酶消化该cDNA。优选的限制酶识别并消化构成抗体基因的核苷酸序列中出现频率低的核苷酸序列。进一步，为了以正确方向在载体中插入1个拷贝的消化片段，给予粘性末端的限制酶的插入是优选的。通过将编码如上述消化的抗体的V区的cDNA插入适当的表达载体，能够获得抗体表达载体。此时，如果编码抗体恒定区（C区）的基因与编码前述V区的基因符合读框地融合，则获得嵌合抗体。此处，嵌合抗体指恒定区与可变区的来源不同的抗体。因此，除小鼠-人等异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也包含在本发明的嵌合抗体中。通过在预先具有恒定区的表达载体中插入前述V区基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体地，例如，在携带编码期望抗体恒定区（C区）的DNA的表达载体的5'侧，可以适当配置消化前述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。通过由相同组合限制酶消化的两个基因符合读框地融合，构建嵌合抗体表达载体。[0176]在单克隆抗体的制备中，将抗体基因以在表达控制区域控制下表达的方式掺入表达载体。用于表达抗体的表达控制区域包含例如增强子、启动子。另外，为了使表达的抗体分泌到细胞外，可以在氨基末端添加适当的信号序列。信号序列从表达的多肽的羧基末端部分切断，抗体可向细胞外分泌。随后，通过利用该表达载体转化适当的宿主细胞，能够获得表达编码抗体的DNA的重组细胞。[0177]为了抗体基因的表达，将编码抗体重链Η链和轻链L链）的DNA分别掺入不同的表达载体。利用掺入Η链和L链的载体，通过同时转化相同的宿主细胞共转染），能够表达具有Η链和L链的抗体分子。或者，通过将编码Η链和L链的DNA掺入单一的表达载体，能够转化宿主细胞参考国际公开W09411523。[0178]用于通过将分离的抗体基因导入适当的宿主而制备抗体的宿主细胞和表达载体的多种组合是公知的。这些表达系统都可用于分离本发明的癌症特异性抗原结合结构域、肿瘤坏死因子受体超家族TNFRSF、Τ细胞受体复合物结合结构域。[0179]在使用真核细胞作为宿主细胞的情况下，可以适当使用动物细胞、植物细胞、或真菌细胞。具体地，作为动物细胞，可以示例下列细胞。[0180]1哺乳类细胞:CH0、C0S、骨髓瘤、ΒΗΚ幼仓鼠肾）、Hela、Vero等⑵两栖类细胞:爪蟾卵母细胞等3昆虫细胞:sf9、sf21、Tn5等。[0181]或者，作为植物细胞，公知应用普通烟草（Nicotianatabacum等烟草Nicotiana属来源的细胞的抗体基因表达体系。植物细胞的转化可适当应用愈伤组织培养细胞。[0182]进一步地，真菌细胞可利用下列细胞。[0183]-酵母:酿酒酵母Saccharomycescerevisiae等酵母Saccharomyces属、毕赤酵母Pichiapastoris等毕赤酵母属-丝状真菌：黑曲霉Aspergillusniger等曲霉菌Aspergillus属。[0184]另外，利用原核细胞的抗体基因的表达系统也是公知的。例如，在应用细菌细胞的情况下，可以适当利用大肠杆菌E.coli、枯草芽胞杆菌等细菌细胞。在这些细胞中，通过转化导入包含作为目的的抗体基因的表达载体。通过体外培养转化的细胞，能够从该转化细胞的培养物获得期望抗体。[0185]在重组抗体的产生中，除上述宿主细胞之外，也可以利用转基因动物。也即，从导入了编码期望抗体的基因的动物，可以得到该抗体。例如，抗体基因可以通过符合读框地插入编码乳汁中固有地产生的蛋白质的基因的内部而作为融合基因构建。乳汁中分泌的蛋白质可以利用例如，山羊β酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注射到山羊胚胎中，将该注射的胚胎导入雌性山羊。从接受胚胎的山羊生出的转基因山羊（或其后代产生的乳汁，可以获得期望抗体，其为与乳汁蛋白质的融合蛋白质。另外，为了增加从转基因山羊产生的包含期望抗体的乳汁量，可以对转基因山羊施用激素（BioTechnology1994，127，699-702。[0186]在对人施用本说明书中记载的抗原结合分子的情况下，例如，作为该分子中的各种结合结构域，在应用包含抗体的可变区的结构域的情况下，为了降低对人的异种抗原性等，可以适当采用人为改变的基因重组型抗体衍生的抗原结合结构域。基因重组型抗体中包含例如人源化Humanized抗体等。这些改变抗体应用公知的方法适当制备。[0187]用于制备本说明书中记载的抗原结合分子中的各种结合结构域的抗体可变区通常由被4个构架区（FR分开的3个互补决定区（complementarity-determiningregion，CDR构成。CDR是实质上决定抗体的结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富于多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列即使在具有不同的结合特异性的抗体之间也常常显示高同一性。因此，一般地，通过CDR的移植，某一抗体的结合特异性可以移植到其它抗体中。[0188]人源化抗体也称为重构reshaped人抗体。具体地，人以外的动物、例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的一般的基因重组技术也是已知的。具体地，作为用于将小鼠的抗体的CDR移植到人的FR的方法，例如重叠延伸PCROverlapExtensionPCR是公知的。在重叠延伸PCR中，在用于合成人抗体的FR的引物中，添加编码要移植的小鼠抗体的⑶R的核苷酸序列。对4个FR各自制备引物。一般地，在将小鼠CDR移植到人FR中，选择与小鼠FR同一性高的人FR对于CDR的功能的维持是有利的。也即，一般地，优选利用包含与要移植的小鼠CDR邻接的FR的氨基酸序列同一性高的氨基酸序列的人FR。[0189]另外，设计连接的核苷酸序列使其互相符合读框地连接。利用分别的引物个别合成人FR。其结果是，得到在各FR中附加编码小鼠CDR的DNA的产物。设计编码各产物的小鼠CDR的核苷酸序列使其互相重叠。随后，进行使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR部分互相退火的互补链合成反应。通过该反应，人FR经由小鼠CDR的序列连接。[0190]通过与其5'末端和3'末端退火的附加了适当限制酶识别序列的引物，扩增最终3个⑶R与4个FR连接的V区基因的全长。通过使如上述得到的DNA和编码人抗体C区的DNA符合读框地融合地插入表达载体中，能够制备人型抗体表达用载体。该重组载体导入宿主建立重组细胞之后，培养该重组细胞，通过表达编码该人源化抗体的DNA，该人源化抗体在该培养细胞的培养物中产生参考欧洲专利公开EP239400、国际公开W01996002576。[0191]通过对如上述制备的人源化抗体与抗原的结合活进行定性或定量测定、评价，能够适当选择人抗体的FR，使得在经由CDR连接时该CDR形成良好的抗原结合部位。按照需要，也可以置换FR的氨基酸残基，使得重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合部位。例如，应用用于将小鼠⑶R向人FR移植的PCR方法，可以在FR中导入氨基酸序列的突变。具体地，与FR退火的引物中可以导入部分核苷酸序列突变。在通过该引物合成的FR中，导入核苷酸序列突变。通过用上述方法测定和评价置换了氨基酸的突变型抗体与抗原的结合活性，能够选择具有期望性质的突变FR序列（Sato,K.etal·，CancerRes,1993，53，851-856。[0192]另外，以具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物（参照国际公开W01993012227、TO1992003918、TO1994002602、TO1994025585、TO1996034096、W01996033735作为免疫动物，可以通过DNA免疫获得所需的人抗体。[0193]进一步地，已知使用人抗体文库，通过淘选获取人抗体的技术。例如，人抗体的V区作为单链抗体scFv通过菌体展示法在·菌体表面表达。可选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对所选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体的V区的DNA序列。确定了与抗原结合的scFv的DNA序列后，使该V区序列与所需的人抗体C区的序列符合读框地融合，然后插入适当的表达载体，由此可制备表达载体。将该表达载体导入上述例举的优选的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表达，由此可获得该人抗体。这些方法已公知（参照国际公开W01992001047、TO1992020791、TO1993006213、TO1993011236、W01993019172、W01995001438、W01995015388。[0194]除噬菌体展示法以外，作为应用人抗体文库通过淘选获得人抗体的技术，已知使用无细胞翻译系统的技术、在细胞或病毒表面展示抗原结合分子的技术、使用乳剂的技术等。例如，作为使用无细胞翻译系统的技术，可以使用通过终止密码子除去等经由核糖体形成mRNA与翻译的蛋白质的复合物的核糖体展示法、应用嘌呤霉素等化合物使基因序列和翻译的蛋白质共价结合的cDNA展示法、mRNA展示法、应用核酸的结合蛋白质形成基因和翻译的蛋白质的复合物的CIS展示法等。另外，作为在细胞或者病毒表面展示抗原结合分子的技术，除噬菌体展示法以外，也可使用大肠杆菌展示法、革兰氏阳性菌展示法、酵母展示法、哺乳类细胞展示法、病毒展示法等。作为使用乳剂的技术，可以使用通过在乳剂中包入基因以及翻译相关分子的体外病毒展示法等。这些方法是已经公知的（NatBiotechnol.2000Dec;1812:1287-92、NucleicAcidsRes.2006;3419:el27、ProcNatlAcadSciUSA.2004Mar2;1019:2806-10^ProcNatlAcadSciUSA.2004Jun22;10125:9193_8、ProteinEngDesSel.2008Apr;214:247-55、ProcNatlAcadSciUSA.2000Sep26;9720:10701-5、MAbs.2010Sep-0ct;25:508-18、MethodsMolBiol.2012;911:183-98。[0195]本发明中"特异性"是指特异性结合的分子中的一个分子对其一个或多个结合配偶体分子以外的分子不显示任何有意义结合的状态。另外，也用于抗原结合结构域对于某一抗原中包含的多个表位之中的特定表位具有特异性的情况。另外，在抗原结合结构域结合的表位包含在多个不同的抗原中的情况下，具有该抗原结合结构域的抗原结合分子能够与包含该表位的各种抗原结合。[0196]另外，意味着抗原中存在的抗原决定簇的"表位"是指本说明书中公开的抗原结合分子中的各种结合结构域结合的抗原上的部位。因此，例如，表位可以根据其结构定义。另外，也可以根据识别该表位的抗原结合分子中对抗原的结合活性定义该表位。在抗原是肽或多肽的情况下，也可以根据构成表位的氨基酸残基指定表位。另外，在表位是糖链的情况下，也可以根据特定的糖链结构指定表位。[0197]直线状表位是包含识别氨基酸一级序列的表位的表位。直线状表位典型地在固有序列中包含至少3个、和最普通至少5个、例如约8~约10个、6~20个氨基酸。[0198]与直线状表位相比，立体结构表位是包含表位的氨基酸的一级序列不是识别的表位的单一决定成分的表位（例如，氨基酸的一级序列不一定被决定表位的抗体识别的表位）。立体结构表位可能包含与直线状表位相比增加数目的氨基酸。关于立体结构表位的识另IJ，抗体识别肽或者蛋白质的三维结构。例如，在蛋白质分子折叠形成三维结构的情况下，形成立体结构表位的某些氨基酸和或者多肽主链并列，使得抗体识别表位成为可能。确定表位的立体结构的方法中包含例如，X线结晶学、二维核磁共振光谱学以及位点特异性自旋标记和电子顺磁共振光谱学，但不限于这些。例如，参考EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology1996、第66卷、Morris编辑）。[0199]确认通过被测抗原结合分子的与癌症特异性抗原中的表位的结合的方法在下文中示例，根据下列示例，也可适当实施其它结合结构域与对象抗原中的表位的结合的确认方法。[0200]例如，包含针对癌症特异性抗原的抗原结合结构域的被测抗原结合分子识别该抗原分子中存在的线状表位可例如如下确认。例如，为了上述目的，合成包含构成癌症特异性抗原的细胞外结构域的氨基酸序列的线状肽。该肽可以化学合成。或者，利用癌症特异性抗原的cDNA中的编码与细胞外结构域相应的氨基酸序列的区域，通过遗传工程技术得到。随后，评价包含构成细胞外结构域的氨基酸序列的线状肽、与包含对癌症特异性抗原的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合活性。例如，以固定的线状肽作为抗原，通过ELISA，能够评价该抗原结合分子对该肽的结合活性。或者，基于该抗原结合分子对表达癌症特异性抗原的细胞的结合中线状肽产生的抑制水平，能够阐明对线状肽的结合活性。通过这些试验，能够阐明该抗原结合分子对线状肽的结合活性。[0201]包含对上述抗原的抗原结合结构域的被测抗原结合分子识别立体结构表位可以如下确认。例如可列举，包含对癌症特异性抗原的抗原结合结构域的抗原结合分子与癌症特异性抗原表达细胞接触时与该细胞强结合，另一方面，该抗原结合分子与固定化的包含构成癌症特异性抗原的细胞外结构域的氨基酸序列的线状肽实质上不结合等。此处，实质上不结合是指对抗原表达细胞的结合活性的80%以下、通常50%以下、优选地30%以下、特别优选地15%以下的结合活性。[0202]作为测定包含抗原结合结构域的被测抗原结合分子对抗原表达细胞的结合活性的方法，可列举例如AntibodiesALaboratoryManual记载的方法（EdHarlow,DavidLane,ColdSpringHarborLaboratory1988359-420。也即，能够以抗原表达细胞为抗原通过ELISA、FACS荧光激活细胞分选术的原理评价。[0203]在ELISA形式中，包含抗原结合结构域的被测抗原结合分子对抗原表达细胞的结合活性通过比较由酶反应生成的信号水平定量地评价。也即，在固定了抗原表达细胞的ELISA板中加入被测抗原结合分子，与该细胞结合的被测抗原结合分子利用识别被测抗原结合分子的酶标记抗体检测。或者，在FACS中，制备被测抗原结合分子的稀释系列，确定对抗原表达细胞的抗体结合效价titer，从而能够比较被测抗原结合分子对抗原表达细胞的结合活性。[0204]被测抗原结合分子对在缓冲液等中悬浮的细胞表面上表达的抗原的结合可以通过流式细胞仪检测。流式细胞仪已知例如下列装置。[0206]例如，作为包含上述抗原结合结构域的被测抗原结合分子对抗原的结合活性的适当测定方法的一个例子，可以列举下列方法。首先，用识别与表达抗原的细胞反应的被测抗原结合分子的FITC标记的二次抗体染色。通过将被测抗原结合分子经适当缓冲液适当稀释，将该抗原结合分子配制为期望浓度应用。例如，可以以l〇μgml至10ngml之间的任一浓度使用。随后，通过FACSCaliburBD公司）测定荧光强度和细胞数。抗体与该细胞的结合量反映在通过应用CELLQUESTSoftwareBD公司）的分析得到的荧光强度、也即几何均值GeometricMean中。也即，通过得到该几何均值，能够测定由被测抗原结合分子的结合量表示的被测抗原结合分子的结合活性。[0207]包含本发明的抗原结合结构域的被测抗原结合分子与某一抗原结合分子共享表位可以通过这两者对相同表位的竞争确认。抗原结合分子间的竞争通过交叉阻断分析等检测。例如，竞争ELISA分析是优选的交叉阻断分析。[0208]具体地，在交叉阻断分析中，将微量滴定板的孔上包被的抗原在候选的竞争抗原结合分子存在下或者不存在下预温育后，添加被测抗原结合分子。与孔中的抗原结合的被测抗原结合分子的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗原结合分子的结合能力间接相关。也即，对于同一表位竞争抗原结合分子的亲和性越大，被测抗原结合分子与包被抗原的孔的结合活性越低。[0209]经由抗原与孔结合的被测抗原结合分子的量可以通过预先标记抗原结合分子而容易地测定。例如，生物素标记的抗原结合分子可以通过使用抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物和适当的底物测定。特别地，利用过氧化物酶等的酶标记的交叉阻断分析称为竞争ELISA分析。抗原结合分子可以用能够检测或测定的其它标记物质标记。具体地，放射标记或荧光标记等是公知的。[0210]与候选的竞争抗原结合分子不存在下实施的对照试验中得到的结合活性比较，如果竞争抗原结合分子可以阻断包含抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合至少20%、优选地至少20~50%、进一步优选地至少50%，则该被测抗原结合分子是结合与竞争抗原结合分子实质上相同的表位、或竞争结合相同表位的抗原结合分子。[0211]在包含本发明的抗原结合结构域的被测抗原结合分子所结合的表位的结构被鉴定的情况下，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子共享表位可以通过比较这两个抗原结合分子对在构成该表位的肽中导入氨基酸突变而成的肽的结合活性而评价。[0212]作为测定该结合活性的方法，例如，可以通过在前述ELISA形式中比较被测抗原结合分子以及对照抗原结合分子对导入了突变的线状肽的结合活性而测定。作为ELISA以外的方法，对与柱结合的该突变肽的结合活性也可以通过使被测抗原结合分子和对照抗原结合分子流过该柱后对洗脱液中洗脱的抗原结合分子进行定量而测定。将突变肽作为例如与GST的融合肽吸附于柱的方法是公知的。[0213]另外，在鉴定的表位是立体表位的情况下，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子共享表位可以用下列方法评价。首先，配制表达作为抗原结合结构域的对象的抗原的细胞和表达在表位中导入突变的抗原的细胞。对于将这些细胞悬浮于PBS等适当的缓冲液的细胞悬浮液，添加被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。随后，对于用适当缓冲液洗涤的细胞悬浮液，添加能够识别被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的FITC标记的抗体。利用标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数通过FACSCaliburBD公司）测定。对于被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的浓度，通过适当缓冲液适当稀释配制为期望浓度应用。例如，以1〇μgml至10ngml之间的任一浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量反映在通过利用CELLQUESTSoftwareBD公司）的分析得到的荧光强度、也即几何均值中。也即，通过该几何均值，能够测定由标记抗体的结合量表示的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的结合活性。[0214]另外，本发明的"抗原结合分子"包含在单一多肽链内形成本发明的"抗体可变区"的重链和轻链两者，也可为缺乏恒定区的抗体片段。该抗体片段例如也可为双抗体diabody;Db、scFv、单链抗体、scFv2、scFab'）2。[0215]Db是由2条多肽链构成的二聚体（Hoi1igerPetal·，Proc·Natl·Acad.Sci.USA90:6444-64481993、EP404,097号、W09311161号等），对于各自的多肽链，相同链中L链可变区（VL以及Η链可变区（VH通过短至不能彼此缔合的接头、例如5个残基左右的接头连接。[0216]同一多肽链上编码的VL和VH由于其间的接头短不能形成单链可变区片段，其通过二聚化而形成2个抗原结合部位。[0217]另外，本说明书中，术语"scFv"、"单链抗体"、或者"scFv2"指单一多肽链内包含来自重链和轻链两者的可变区、但缺乏恒定区的抗体片段。一般地，单链抗体还包含能够形成认为允许抗原结合的期望结构的、VH结构域和VL结构域间的多肽接头。单链抗体在ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag,NewYork,269~3151994中由Pluckthun详细论述。同样地，参考国际专利申请公开W01988001649和美国专利第4，946，778号和第5，260，203号。在特定实施方式中，单链抗体还可以是双特异性和或人源化的。[0218]scFv是构成Fv的VH和VL通过肽接头连接而成的抗原结合结构域Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.19888516，5879-5883。通过该肽接头VH和VL可以保持为接近的状态。[0219]scFv2是二个VL和二个VH的4个可变区通过肽接头等接头连接的构成单链的单链抗体JImmunol.Methods19992311-2，177-189。这二个VH和VL可以从不同的单克隆抗体衍生。例如，可以适当列举如JournalofImmunology199415211，5368-5374中公开的识别同一抗原中存在的二种表位的双特异性bispecificscFv2。scFv2可由本领域技术人员通过公知方法制备。例如，可将scFv用肽接头等接头连接而制备。[0220]本说明书中构成scFv2的抗原结合结构域的组成方式可列举特征在于二个VH和二个VL以单链多肽的N末端侧为起点按照¥!1、¥1^、¥!1、¥1^[¥!1]接头[¥1^]接头[¥!1]接头[¥1^]的顺序排列的抗体，但二个VH和二个VL的顺序不特别限于上述组成方式，可以以任何顺序排列。例如，也可列举如下顺序的组成方式。[0221][VL]接头[VH]接头[VH]接头[VL][VH]接头[VL]接头[VL]接头[VH][VH]接头[VH]接头[VL]接头[VL][VL]接头[VL]接头[VH]接头[VH][VL]接头[VH]接头[VL]接头[VH]。[0222]scFv2的分子形态在W02006132352中也详细记载，本领域技术人员根据这些记载，可以适当制备用于制备本说明书中公开的抗原结合分子的期望scFv2。[0223]此处，Fv可变片段）意味着抗体的轻链可变区（VL1ightchainvariableregion和抗体的重链可变区（VHheavychainvariableregion对组成的抗体衍生的抗原结合结构域的最小单位。1988年Skerra和Pluckthun发现，通过细菌信号序列下游插入抗体基因在大肠杆菌中诱导该基因的表达，以均一且保持活性的状态从大肠杆菌的周质级分配制FvScience19882404855，1038-1041。对于从周质级分配制的Fv，VH和VL以具有与抗原结合的方式缔合。[0224]另外，本发明的抗原结合分子也可以缀合PEG等载体聚合物、抗癌剂等有机化合物。另外，可以插入糖基化序列，以获得期望效果为目的适当加入糖链。[0225]作为连接抗体可变区的接头，可以应用能够通过遗传工程导入的任意肽接头、或合成化合物接头（例如，参考ProteinEngineering,93，299-305，1996中公开的接头等，但本发明中优选肽接头。肽接头的长度没有特别限定，可按照目的由本领域技术人员适当选择，优选长度是5个氨基酸以上上限没有特别限定，通常是30氨基酸以下、优选地20氨基酸以下），特别优选地15个氨基酸。在scFv2中包含3个肽接头的情况下，可以应用完全相同长度的肽接头，也可以应用不同长度的肽接头。[0226]例如，在肽接头的情况，可以列举：[η是1以上的整数]。但是，肽接头的长度、序列可按照目的由本领域技术人员适当选择。[0227]合成化学物接头化学交联剂是在肽的交联中常规应用的交联剂，例如Ν-羟基琥珀酰亚胺NHS、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯DSS、双磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸酯BS3、二硫代双琥珀酰亚胺基丙酸酯）（DSP、二硫代双磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯）（DTSSP、乙二醇双（琥珀酰亚胺基丁二酸酯）（EGS、乙二醇双（磺基琥珀酰亚胺基丁二酸酯）（磺基-EGS、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯①ST、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯（磺基-DST、双（2-琥珀酰亚胺氧基羰基氧基）乙基砜BS0C0ES、双2-磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基）乙基砜磺基-BS0C0ES等，这些交联剂是市售的。[0228]在连接4个抗体可变区的情况下，通常需要3个接头，可以应用完全相同的接头，也可以应用不同的接头。[0229]另外，"Fab"由一条轻链、以及一条重链的CH1区域和可变区构成。Fab分子的重链不能与其它重链分子形成二硫键。[0230]"Fab'）2"以及"Fab'"通过用作为蛋白酶的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等处理免疫球蛋白（单克隆抗体而制备，意味着在铰链区中2条Η链间存在的二硫键的前后消化生成的抗体片段。例如，通过用木瓜蛋白酶处理IgG，可以制备包含在铰链区中2条Η链间存在的二硫键的上游切割的VLL链可变区）和CLL链恒定区）的L链、以及包含VHΗ链可变区）和CHγ1Η链恒定区中的γ1区域）的Η链片段通过C末端区的二硫键结合而成的相同的2个抗体片段。这2个相同的抗体片段分别称为Fab'。[0231]卞&13'）2"包含二条轻链、以及含有011结构域和012结构域的一部分的恒定区的二条重链使得链间二硫键在2条重链间形成。构成本说明书中公开的抗原结合分子的Fab'）2可以如下适当获得，将具有期望抗原结合结构域的全长单克隆抗体等用胃蛋白酶等蛋白酶部分消化后，将Fc片段在蛋白A柱上吸附除去。所述蛋白酶没有特别限定，能够通过适当设定pH等酶反应条件限制性地消化全长抗体而生成Fab'）2即可，可示例例如胃蛋白酶、无花果蛋白酶等。[0232]本发明的"抗原结合分子"的优选实施方式之一可列举多特异性抗体。在多特异性抗体的Fc区应用对Fcγ受体的结合活性降低的Fc区的情况下，也适当使用源自多特异性抗体的Fc区。本发明的多特异性抗体特别优选双特异性抗体。[0233]对于多特异性抗体的缔合，可以应用在抗体Η链的第二恒定区（CH2或Η链的第三恒定区（CH3的界面导入电荷斥力来抑制非目的Η链彼此缔合的技术W02006106905。[0234]在CH2或CH3的界面导入电荷斥力来抑制不希望的Η链彼此缔合的技术中，作为在Η链的其它恒定区的界面接触的氨基酸残基，可列举例如，CH3区域中EU编号第356号的残基、EU编号第439号的残基、EU编号第357号的残基、EU编号第370号的残基、EU编号第399号的残基、EU编号第409号的残基相对的区域。[0235]更具体地，例如，可制备在包含2种Η链CH3区域的抗体中，选自第一Η链CH3区中以下（1~3中示出氨基酸残基的组的1组至3组的氨基酸残基具有同种电荷的抗体；（1Η链CH3区域中包含的氨基酸残基、即EU编号第356位和439位的氨基酸残基、（2Η链CH3区域中包含的氨基酸残基、即EU编号第357位和370位的氨基酸残基、（3Η链CH3区域中包含的氨基酸残基、即EU编号第399位和409位的氨基酸残基。[0236]进一步，可制备抗体使得作为选自与上述第一Η链CH3区域不同的第二Η链CH3区域中前述（1~3中示出氨基酸残基的组的氨基酸残基的组，前述第一Η链CH3区域中具有同种电荷的前述（1~（3中示出氨基酸残基的组对应的1组至3组的氨基酸残基具有与前述第一Η链CH3区域中对应的氨基酸残基相反的电荷。[0237]上述（1~（3中记载的各自氨基酸残基在缔合时互相接近。本领域技术人员能够对于期望的Η链CH3区域或者Η链恒定区用市售软件通过同源模建等发现与上述（1~3中记载的氨基酸残基对应的部位，可适当地对该部位的氨基酸残基进行改变。[0238]上述抗体中，"具有电荷的氨基酸残基"优选选自例如以下a或者b中任一组中包含的氨基酸残基：a谷氨酸E、天冬氨酸D、b赖氨酸K、精氨酸R、组氨酸H。[0239]在上述抗体中，"具有同种电荷"意味着例如，2个以上的氨基酸残基都具有上述a或者b的任一组中包含的氨基酸残基。"具有相反电荷"意味着例如，在2个以上的氨基酸残基中至少1个氨基酸残基具有上述a或者b的任一组中包含的氨基酸残基的情况下，剩余的氨基酸残基具有在不同组中包含的氨基酸残基。[0240]在优选实施方式中，对于上述抗体，第一Η链CH3区域和第二Η链CH3区域也可通过^硫键交联。[0241]作为本发明中进行改变的氨基酸残基，不限于上述抗体的可变区或者抗体的恒定区的氨基酸残基。本领域技术人员能够对于多肽突变体或者异源多聚体用市售软件通过同源模建等发现形成界面的氨基酸残基，能够对该部位的氨基酸残基进行改变而控制缔合。[0242]另外，本发明的多特异性抗体的缔合中也可应用另外其它的公知技术。通过将抗体的一个Η链的可变区中存在的氨基酸侧链置换为更大的侧链knob;突起）、另一Η链的相对可变区中存在的氨基酸侧链置换为更小的侧链hole;空隙），可将突起配置在空隙中，从而能够有效地引起具有Fc区的具有不同氨基酸的多肽彼此缔合W01996027011、RidgwayJBetal.,ProteinEngineering19969，617-621,MerchantAMetal.NatureBiotechnology199816，677-681、US20130336973〇[0243]此外，本发明的多特异性抗体的形成中也可应用另外其它的公知技术。应用将抗体的一个Η链的CH3的一部分制成与该部分对应的IgA来源的序列、另一Η链的CH3的互补部分中导入与该部分对应的IgA来源的序列的链交换工程化结构域CH3,可通过CH3的互补缔合有效引起具有不同序列的多肽的缔合ProteinEngineeringDesign&Selection,23;195-202,2010。应用该公知技术也可有效形成目的多特异性抗体。[0244]此外，在多特异性抗体的形成中，也可应用如下技术，W02011028952、W02014018572、NatBiotechnol.2014Feb;322:191-8.中记载的利用抗体的CH1与CL的缔合、VH、VL的缔合的抗体制备技术，W02008119353、W02011131746中记载的使用分别配制的单克隆抗体制备双特异性抗体的技术FabArmExchange，W02012058768、W02013063702中记载的控制抗体重链的CH3间的缔合的技术，W02012023053中记载的制备由二种轻链和一种重链构成的双特异性抗体的技术，Christoph等人NatureBiotechnologyVol.31，p753-7582013中记载的利用分别表达包含1条Η链和1条L链的抗体的一条链的2个细菌细胞株的制备双特异性抗体的技术等。[0245]多特异性抗体的形成的一个实施方式可列举，如上述的，将二种单克隆抗体在还原剂存在下混合，使核心铰链的二硫键断裂，随后再缔合并异二聚化而获得双特异性抗体的方法FAE，通过在CH3区的相互作用界面导入静电相互作用W02006106905，能够诱导再缔合时进一步有效的异二聚化W02015046467。在应用天然型IgG的FAE中，再缔合随机发生，因此理论上仅以50%的效率得到双特异性抗体，但是，在该方法中可以以高收率制备双特异性抗体。[0246]另外，即使在无法有效形成目的多特异性抗体的情况下，通过从产生的抗体中分离、纯化目的多特异性抗体，也可得到本发明的多特异性抗体。例如，报告了通过在2种Η链可变区中导入氨基酸置换产生等电点差异、可将2种同源体与目的异源抗体通过离子交换层析而纯化的方法W02007114325。另外，作为纯化异源体的方法，迄今报告了，将包含与蛋白Α结合的小鼠IgG2a的Η链和不与蛋白Α结合的大鼠IgG2b的Η链的异源二聚化抗体利用蛋白六纯化的方法评098050431、评095033844。另外，通过应用将186与蛋白六的结合部位的EU编号第435位和436位的氨基酸残基置换为Tyr、His等与蛋白Α的结合力不同的氨基酸的Η链，使各Η链与蛋白Α的相互作用变化，通过应用蛋白Α柱，也可有效纯化单独的异源二聚化抗体。[0247]另外，也可以获得能够赋予对不同的多数Η链的结合能力的共同L链，并将其用作多特异性抗体的共同L链。通过将这样的共同L链和不同的多数Η链基因导入细胞表达IgG，能够有效表达多特异性IgGNatureBiotechnology199816，677-681。选择共同Η链时，也可以利用选择对任意不同的Η链显示高结合能力的共同L链的方法（W02004065611。[0248]另外，作为本发明的Fc区，可以适当使用Fc区的C末端的异质性改善的Fc区。更具体地，提供了在构成来自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区的二条多肽的氨基酸序列之中以EU编号指定的446位甘氨酸以及447位赖氨酸缺失的Fc区。[0249]这些技术也可以组合应用多个，例如2个以上。另外，这些技术也可以对要缔合的2个Η链适当地分别应用。进一步地，这些技术也可以与上述对Fcγ受体结合活性降低的Fc区组合应用。另外，本发明的抗原结合分子也可以是基于加入上述改变的抗原结合分子单独制备的具有同一氨基酸序列的抗原结合分子。[0250]本发明所述的抗原结合分子第1抗原结合分子包含前述的：1癌症特异性抗原结合结构域、以及2肿瘤坏死因子TNF超家族结合结构域、或肿瘤坏死因子TNF受体超家族结合结构域，即可，其结构不限。通过包含这2个结合结构域，第1抗原结合分子特异性激活表达属于TNF超家族或TNF受体超家族的分子的细胞，所述细胞是表达癌症特异性抗原的细胞或含有该细胞的肿瘤组织中包含的细胞，可以对表达癌症特异性抗原的该细胞或含有该细胞的肿瘤组织诱导优异的特异性的细胞毒性作用。本发明的癌症特异性抗原结合结构域、TNF超家族结合结构域以及TNF受体超家族结合结构域可以分别从上述癌症特异性抗原或属于TNF超家族或TNF受体超家族的抗原中适当选择。这些结合结构域可以通过肽键直接连接，也可以通过接头连接。[0251]本发明的抗原结合分子也可以另外包含FcRn结合结构域。应用上述抗体的Fc区作为该FcRn结合结构域时，优选对Fcγ受体的结合活性降低的Fc区。通过降低对Fcγ受体的结合活性，可以抑制Fcγ受体表达细胞和表达属于TNF受体超家族的因子的细胞之间的交联产生的细胞因子释放等免疫活化引起的副作用。[0252]本发明的抗原结合分子可以用上述公知方法制备。[0253]例如，在（1癌症特异性抗原结合结构域应用Fab'）2、（2TNF超家族结合结构域或TNF受体超家族结合结构域应用Fab'）2、（3FcRn结合结构域应用含有对Fcγ受体的结合活性降低的Fc区的结构域的情况下，（1和2中记载的抗原结合结构域与（3中记载的含有Fc区的结构域通过肽键直接连接时，连接的多肽形成抗体结构。为了制备这样的抗体，除了从前述杂交瘤的培养液纯化，还可以从稳定地携带编码构成该抗体的多肽的多核苷酸的期望宿主细胞的培养液纯化该抗体。[0254]另外，除此之外，在通过接头连接各结构域的情况下，除上述示例的接头之外，采用的接头还可以适当使用具有例如His标签、HA标签、myc标签、FLAG标签等肽标签的接头。另外，可以另外适当利用氢键、二硫键、共价键、离子相互作用或者这些的组合产生的互相结合的性质。例如，利用抗体的CH1和CL间的亲和性，以及异源Fc区缔合时应用源自前述多特异性抗体的Fc区。[0255]本发明中，可将第1抗原结合分子与第2抗原结合分子进一步组合应用。[0256]该第2抗原结合分子包含：1癌症特异性抗原结合结构域、以及2T细胞受体复合物结合结构域即可，与第1抗原结合分子同样地其结构不限，可应用与第1抗原结合分子同样的方法获得。另外，第2抗原结合分子包含癌症特异性抗原结合结构域和T细胞受体复合物结合结构域即可，其结构也不必与第1抗原结合分子相同。另外，第1抗原结合分子的癌症特异性抗原结合结构域结合的癌症特异性抗原与第2抗原结合分子的癌症特异性抗原结合结构域结合的癌症特异性抗原可以是相同的抗原也可以是不同的抗原，优选相同的癌症特异性抗原。在癌症特异性抗原相同的情况下，第1抗原结合分子和第2抗原结合分子结合的表位可以相同也可以不同。通过组合应用这些第1抗原结合分子和第2抗原结合分子，能够得到优异的细胞毒性活性。第2抗原结合结构域中包含的癌症特异性抗原结合结构域以及T细胞受体复合物结合结构域可以分别从上述癌症特异性抗原或属于T细胞受体复合物的抗原中适当选择。[0257]本发明的第2抗原结合分子也与第1抗原结合分子同样地，还可包含FcRn结合结构域。应用上述抗体的Fc区作为该FcRn结合结构域时，与第1抗原结合分子同样地优选对Fcγ受体的结合活性降低的Fc区。通过降低对Fcγ受体的结合活性，可以抑制Fcγ受体表达细胞和Τ细胞受体复合物表达细胞和或表达属于TNF受体超家族的因子的细胞之间的交联产生的细胞因子释放等免疫活化引起的副作用。[0258]另外，本发明涉及编码本发明的抗原结合分子的多核苷酸。本发明的抗原结合分子可以掺入任意表达载体。用表达载体转化适当的宿主，能够产生表达抗原结合分子的细胞。培养表达抗原结合分子的细胞，从培养上清回收表达产物，则能够获得由该多核苷酸编码的抗原结合分子。也即，本发明涉及包含编码本发明的抗原结合分子的多核苷酸的载体、携带该载体的细胞、和包含培养该细胞并从培养上清回收抗原结合分子的制备抗原结合分子的方法。这些可以通过例如与前述重组抗体同样的技术获得。[0259]药物组合物在另外的观点中，本发明提供包含上述第1抗原结合分子作为有效成分的药物组合物。另外，本发明涉及以该抗原结合分子作为有效成分包含的、诱导细胞毒性的药物组合物细胞毒性诱导治疗剂）、细胞增殖抑制剂和抗癌剂。本发明的药物组合物也可以用作癌症治疗剂或者癌症预防剂。本发明的细胞毒性诱导治疗剂、细胞增殖抑制剂和抗癌剂优选施用于患有癌症的对象或者具有复发可能性的对象。[0260]另外，本发明中，包含上述第1抗原结合分子作为有效成分的细胞毒性诱导治疗剂、细胞增殖抑制剂和抗癌剂可以表现为包含将该抗原结合分子施用于对象的步骤的诱导细胞毒性的方法、抑制细胞增殖的方法、活化对癌细胞或含有癌细胞的肿瘤组织的免疫的方法、或者预防或治疗癌症的方法，或者，也可以表现为用于诱导细胞毒性的药物组合物、该抗原结合分子在制备细胞增殖抑制剂和抗癌剂中的应用，或者，也可以表现为用于在细胞毒性的诱导、细胞增殖的抑制、对癌细胞或包含癌细胞的肿瘤组织的免疫的活化或癌症的治疗或预防中使用的该抗原结合分子。[0261]本发明中，"包含抗原结合分子作为有效成分"意味着包含该抗原结合分子作为主要活性成分，不限制该抗原结合分子的含有率。[0262]进一步，本发明中的药物组合物、或用于诱导细胞毒性的药物组合物、细胞增殖抑制剂和抗癌剂（以下称为药物组合物等可以与上述第2抗原结合分子组合应用。通过在包含第1抗原结合分子的药物组合物等中组合应用第2抗原结合分子，能够强化对表达该抗原的细胞的细胞毒性作用。此处，"组合应用第2抗原结合分子"可以是第2抗原结合分子在包含第1抗原结合分子的药物组合物等中一起混合，也可以是在与包含第1抗原结合子的药物组合物等不同的药物组合物等中包含第2抗原结合分子。其剂型可以相同也可以不同。另外，在第1抗原结合分子和第2抗原结合分子在不同的药物组合物等中包含的情况下，这些药物组合物等可对对象同时施用，也可以分别施用。进一步，这些药物组合物等也可提供为试剂盒。[0263]另外，通过与第2抗原结合分子或包含第2抗原结合分子作为有效成分的药物组合物等联用，本发明中的第1抗原结合分子或包含第1抗原结合分子作为有效成分的药物组合物可用作用于提高其细胞毒性活性的诱导、或强化细胞毒性活性的药物组合物。另外，通过与第1抗原结合分子或包含第1抗原结合分子作为有效成分的药物组合物等联用，第2抗原结合分子或包含第2抗原结合分子作为有效成分的药物组合物可用作用于提高其细胞毒性活性的诱导、或强化细胞毒性活性的药物组合物。[0264]此处，"联用"包含以第1抗原结合分子作为有效成分包含的药物组合物等与以第2抗原结合分子作为有效成分包含的药物组合物等对对象同时施用，也包含将它们分别施用。另外，其剂型可以相同也可以不同。进一步地，这些药物组合物等也可提供为试剂盒。[0265]另外，本发明提供了，通过利用上述第1抗原结合分子或包含该结合分子作为有效成分的药物组合物等、与第2抗原结合分子或包含第2抗原结合分作为有效成分的药物组合物等联用产生的效果，通过第1抗原结合分子或包含第1抗原结合分子作为有效成分的药物组合物等强化第2抗原结合分子或包含第2抗原结合分子作为有效成分的药物组合物等的细胞毒性活性或抗肿瘤效果的方法。另外提供了，通过第2抗原结合分子或包含第2抗原结合分子作为有效成分的药物组合物等强化第1抗原结合分子或包含第1抗原结合分子作为有效成分的药物组合物等的细胞毒性活性或抗肿瘤效果的方法。[0266]进一步，本发明中的药物组合物等可以按照需要与多种第1抗原结合分子和或第2抗原结合分子组合应用。例如，通过应用与相同抗原结合的多个本发明的抗原结合分子的混合物，能够强化对表达该抗原的细胞的细胞毒性作用。[0267]另外，本发明的抗原结合分子可以按照需要包封在微胶囊羟甲基纤维素、明胶、聚甲基丙烯酸甲酯等微胶囊）中，制成胶体药物递送系统脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米粒子和纳米胶囊等）（参考〃Remington'sPharmaceuticalScience16thedition",OsloEd.1980等）。进一步地，将药剂制成持续释放药剂的方法也是公知的，该方法可适用于本发明的抗原结合分子（】.13;[011161.]\^七61'.1?68.198115，267-277,〇1611^63]1·198212，98-105、美国专利第3773719号、欧洲专利公开公报EP58481号·ΕΡ133988号、Biopolymers198322，547-556。[0268]本发明的药物组合物、或细胞增殖抑制剂和抗癌剂可以通过经口、非经口施用中的任一施用于患者。优选非经口施用。所述施用方法可具体地列举注射施用、经鼻施用、经肺施用、经皮施用等。注射施用可列举例如，静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等。例如，通过注射施用可以全身或者局部施用本发明的药物组合物、或细胞毒性诱导治疗剂、细胞增殖抑制剂和抗癌剂。另外，可以根据患者的年龄、症状选择适当的施用方法。作为施用量，例如，可以在一次施用每1kg体重0.0001mg至1000mg的范围内选择施用量。或者，例如，可以在每个患者0.001mg机体至100000mg机体的范围内选择施用量。但是，本发明的药物组合物不限于这些施用量。[0269]本发明的药物组合物可以按照常规方法配成制剂（例如，Remingtοη'sPharmaceuticalScience,latestedition,MarkPublishingCompany，Easton，U.S.A，也可以共同包含药学上相容的载体、添加剂。例如，可以列举表面活性剂、赋形剂、着色剂、调味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动促进剂、矫味剂等。进一步，不限于这些，可适当使用其它常用载体。具体地，载体可举出轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。[0270]另外，本发明提供了，通过使表达特定癌症特异性抗原的细胞和与该癌症特异性抗原结合的本发明的第1抗原结合分子或者第1抗原结合分子以及第2抗原结合分子接触，引起对该癌症特异性抗原的表达细胞或包含该癌症特异性抗原的表达细胞的肿瘤组织的损伤的方法或者抑制该细胞或该肿瘤组织的增殖的方法。与该癌症特异性抗原结合的本发明的抗原结合分子结合的细胞是表达该癌症特异性抗原的细胞即可，没有特别限定。本发明中优选的该癌症抗原的表达细胞可适当列举，具体地，卵巢癌、前列腺癌、乳癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌以及大肠癌细胞等。[0271]本发明中的"接触"通过例如在体外培养的癌抗原表达细胞的培养液中添加与该癌抗原结合的本发明的抗原结合分子而进行。在该情况下，添加的抗原结合分子的形状可以适当使用溶液或通过冷冻干燥等获得的固体等形状。在以水溶液添加的情况下，可为仅纯粹地包含本发明的抗原结合分子的水溶液，也可为包含例如上述记载的表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动促进剂、矫味剂等的溶液。添加的浓度没有特别限定，培养液中的最终浓度可适当使用优选地1pgml至1gml的范围、更优选地1ngml至1mgml、更优选地lμgml至1mgml。[0272]另外，在其它实施方式中，本发明中的"接触"也另外通过对体内移植了表达癌症特异性抗原的细胞的非人动物、具有内在表达该癌症特异性抗原的癌细胞的动物施用与该癌抗原结合的本发明的抗原结合分子而进行。施用方法可通过经口、非经口施用中的任一实施。特别优选的是通过非经口施用的施用方法，所述施用方法可列举，具体地，注射施用、经鼻施用、经肺施用、经皮施用等。注射施用可列举例如，静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等。例如，通过注射施用，可以全身或者局部施用本发明的药物组合物、或用于诱导细胞毒性的药物组合物、细胞增殖抑制剂和抗癌剂。另外，可以根据被测动物的年龄、症状选择适当的施用方法。在以水溶液施用的情况下，可为仅纯粹地包含本发明的抗原结合分子的水溶液，也可为包含例如上述记载的表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动促进剂、矫味剂等的溶液。作为施用量，例如，可以在一次施用每1kg体重0.0001mg至1000mg的范围选择施用量。或者，例如，可在每个患者0.001至100000mg机体的范围选择施用量。但是，本发明的抗原结合分子施用量不限于这些施用量。[0273]作为评价或测定接触本发明的抗原结合分子引起的、表达构成该抗原结合分子的癌症特异性抗原结合结构域结合的癌症特异性抗原的细胞引起的细胞毒性的方法，适当使用以下的方法。作为体外评价或测定该细胞毒性活性的方法，可列举细胞毒性T细胞活性等的测定法。本发明的抗原结合分子是否具有T细胞毒性活性可以通过公知方法测定例如，CurrentprotocolsinImmunology,Chapter7.Immunologicstudiesinhumans,Editor,JohnE,Coliganetal·，JohnWiley&Sons,Inc.,1993等）。活性测定时，以与其抗原结合结构域结合的抗原与本发明不同的抗原、也即试验中使用的细胞不表达的抗原结合的抗原结合分子作为对照，与本发明的抗原结合分子同样地使用，本发明的抗原结合分子与用作对照的抗原结合分子相比显示更强的细胞毒性活性，从而能够判断活性。[0274]另外，为了评价或测定体内的细胞毒性活性，例如，将表达构成本发明的抗原结合分子的癌症特异性抗原结合结构域结合的抗原的细胞移植到非人被测动物皮内或皮下之后，从当日或第二日起以每日或数日间隔静脈或腹腔内施用被测抗原结合分子。通过每日测定肿瘤的大小，该肿瘤大小的变化的差异可限定为细胞毒性活性。与体外评价同样地施用作为对照的抗原结合分子，通过本发明的抗原结合分子的施用组中肿瘤的大小显著小于对照抗原结合分子的施用组中肿瘤的大小，可确定本发明的抗原结合分子具有细胞毒性活性。[0275]作为评价或测定本发明的抗原结合分子的接触引起的、对表达构成该抗原结合分子的癌症特异性抗原结合结构域结合的抗原的细胞的增殖的抑制效果的方法，适当应用同位素标记的胸苷向细胞中的摄取的测定或MTT方法。另外，作为评价或测定体内细胞增殖抑制活性的方法，可以适当应用与上述记载的评价或测定体内细胞毒性活性的方法相同的方法。[0276]另外，本发明提供包含本发明的抗原结合分子或者通过本发明的制备方法制备的抗原结合分子的、用于在本发明的方法中使用的试剂盒。该试剂盒中，还可以包装药学上相容的载体、媒介、记载使用方法的说明书等。[0277]另外，本发明涉及用于在本发明的方法中使用的、本发明的抗原结合分子或者通过本发明的制备方法制备的抗原结合分子。[0278]本领域技术人员当然理解，本说明书中记载的1个或多个实施方式的任意组合也包含在本发明中，只要根据本领域技术人员的技术常识在技术上不矛盾。[0279]另外，本说明书中引用的所有现有技术文献都作为参照并入本说明书中。[0280]实施例以下通过实施例对本发明进行更详细说明，但这些实施例不限制本发明的范围。[0281]〔参考例1〕抗体的表达载体的制备和抗体的表达和纯化编码抗体可变区的Η链和L链的核苷酸序列的全长基因的合成应用AssemblePCR等通过本领域技术人员公知的方法制备。氨基酸置换的导入应用PCR等用本领域技术人员公知的方法进行。将得到的质粒片段插入动物细胞表达载体中，制备Η链表达载体和L链表达载体。得到的表达载体的核苷酸序列用本领域技术人员公知的方法确定。将制备的质粒瞬时地导入人胎儿肾癌细胞衍生ΗΕΚ293Η株（Invitrogen公司）、或者FreeStyle293细胞Invitrogen公司），进行抗体的表达。回收得到的培养上清后，通过0.22μηι滤器1011^1?-GVMillipore或者0·45μηι滤器MILLEXR-GVMillipore得到培养上清。应用rProteinASepharoseFastFlowGEHealthcare或者ProteinGSepharose4FastFlowGEHealthcare通过本领域技术人员公知的方法从得到的培养上清纯化抗体。对于纯化抗体浓度，用分光光度计测定280nm的吸光度，通过PACE等方法从得到的值算出消光系数，应用该消光系数算出抗体浓度ProteinScience1995;4:2411-2423。[0282]〔参考例2〕小鼠Fcγ受体mFcγR的配制方法和改变抗体与mFcγR的相互作用分析方法用以下的方法配制小鼠FcγR的细胞外结构域。首先，通过本领域技术人员公知的方法合成FeyR的细胞外结构域的基因。此时，根据NCBI登录的信息制备各FeyR的序列。具体地，mFcyRI基于NCBIReferenceSequence:ΝΡ_034316·1的序列制备、mFcyRII基于NCBIReferenceSequence:NP034317.1的序列制备、mFcyRIII基于NCBIReferenceSequence:NP_034318.2的序列制备、mFcyRIV基于NCBIReferenceSequence:NP_653142.2的序列制备，在C末端添加His标签。将得到的基因片段插入动物细胞表达载体，制备表达载体。将制备的表达载体瞬时地导入人胎儿肾癌细胞衍生FreeStyle293细胞Invitrogen公司），进行目的蛋白质的表达。回收得到的培养上清后，通过0.22μπι滤器得到培养上清。将得到的培养上清作为原则通过下列4个步骤纯化。第1步骤实施离子交换柱层析、第2步骤实施针对His标签的亲和柱层析HisTrapHP、第3步骤实施凝胶过滤柱层析Superdex200、第4步骤实施无菌过滤。对于第1步骤的离子交换柱层析，mFcγRI应用QSepharoseHP、mFcyRII和mFcyRIV应用SPSepharoseFF、mFcyRIII应用SPSepharoseHP。另外，第3步骤及以后应用的溶剂是D-roS-，mFcyRIII应用包含0.1MArginine的D-roS-。对纯化的蛋白质应用分光光度计测定280nm的吸光度，通过PACE等方法从得到的值算出消光系数，应用该消光系数算出纯化蛋白质浓度ProteinScience1995;4:2411-2423。应用BiacoreT100GEHealthcare、BiacoreT200GEHealthcare、BiacoreA100、Biacore4000,进行各改变抗体与上述配制的Fcγ受体的相互作用分析。运行缓冲液应用HBS-EP+GEHealthcare，测定温度设为25°C。应用在SeriesSSensorChipCM5GEHealthcare或者SeriesSSensorChipCM4GEHealthcare上通过胺偶联方法固定ProteinUACTIGEN或者BioVision的芯片。在这些传感器芯片上捕获目的抗体，使用运行缓冲液稀释的mFcYR相互作用，测定对抗体的结合量，在抗体之间进行比较。但是，mFcγR的结合量依赖于捕获的抗体量，因此，以mFcγR的结合量除以各抗体的捕获量得到的校正值进行比较。另外，在10mM甘氨酸-HCl、pHl.5反应，以洗涤传感器芯片上捕获的抗体，使传感器芯片再生和重复应用。另外，按照下列方法，实施用于算出各改变抗体对FcyR的KD值的动力学分析。首先，在上述传感器芯片上捕获目的抗体，使用运行缓冲液稀释的mFcγR相互作用，对得到的传感器图，用BiacoreEvaluationSoftware将测定结果以1:1Langmuir结合模型进行整体拟合globalfitting，算出结合速度常数kaLmols、解离速度常数kdls，从这些值算出解离常数KDmolL。[0283]〔参考例3〕实验动物以及细胞株实验动物应用C57BL6雌性小鼠（日本CharlesRiver株式会社）、或Balbc雌性小鼠日本CharlesRiver株式会社），在动物饲养室在恒定条件温度:20~26°C，明暗：12小时的明暗周期）下，在自由摄取饲料和饮水的情况下饲养。通过本领域技术人员公知的方法，在小鼠肺癌细胞株LLCATCCNo.CRL-1642的染色体中掺入人GPC3基因，得到高表达人GPC3的细胞株LLC-GPC3。应用QIFI试剂盒①ako公司），通过制造商的推荐方法，确定人GPC3表达水平（2.3xl05细胞）。同样地，也在小鼠大肠癌细胞株CT-26ATCCNo.CRL-2638中掺入人GPC3基因，得到高表达株CT26-GPC3表达水平:3.1xlO5细胞）。为了保持人GPC3基因，对于这些重组细胞株，在ATCC推荐的培养基中添加遗传霉素GIBC0，对LLC-GPC3添加400μgml、对CT26-GPC3添加200μgml，进行培养。培养后，应用2.5gL胰蛋白酶-ImMEDTAnacalaitesque公司）剥离这些细胞，之后用于各实验。[0284]〔实施例1〕抗CD137小鼠抗体的制备和激动剂活性的评价1-1.抗小鼠CD137小鼠抗体的制备和与mFcγR的结合评价按照参考例1的方法，制备抗体Η链可变区和抗体Η链恒定区，抗体Η链可变区为针对TO2005017148中公开的小鼠CD137的可变区，即1D8VH序列编号:28，抗体Η链恒定区为具有天然型小鼠IgG1的Η链恒定区的1D8VH-mIgG1序列编号：29。另外，制备对于1D8VH-mlgGl导入消除W02012133782中记载的对FcγR的结合的改变、也即EU编号第235号的Pro置换为Lys的改变和EU编号第239号的Ser置换为Lys的改变而成的lD8VH-mF18序列编号：30。进一步地，制备对于lD8VH-mIgGl导入增强与mFcgRII结合的改变（T230E、V231P、P232N、S238E、S239D、N324D而成的1D8VH-MB492序列编号：31。应用W02005017148中公开的1D8VL作为抗体L链可变区，应用具有小鼠κ链的恒定区的1D8VL-mkO序列编号：32作为L链恒定区，按照参考例1的方法表达、纯化，得到lD8VH-mIgGllD8VL-mkO、lD8VH-mF18lD8VL-mkO、lD8VH-MB492lD8VL-mkO。这些抗体在下文为了简略记载为lD8-mIgGl、1D8-mF18、lD8-MB492。[0285]另外，为了测定各恒定区对mFcyR的结合，制备具有W02009125825中记载的抗人白介素6受体抗体的可变区H237序列编号：33的H237-mIgGl序列编号：34、H237-MB492序列编号：35作为Η链可变区。抗体L链应用托珠单抗tocilizumab的L链MRAL-kO序列编号：36，按照参考例1的方法表达、纯化，得到H237-mIgGlMRAL-kO、H237-MB492MRAL-k0。另外同样地，制备具有作为抗体Η链可变区的具有与人IL6R的结合的小鼠抗体小鼠PM-1Sato,CancerRes·,1993，53，851-856的可变区（mPMlH的mPMlH-mlgGl序列编号：37、mPMlH-mF18序列编号：38。抗体L链使用MRAL-kO,按照参考例1的方法表达、纯化，得到mPMlH-mIgG1MRAL-kO、mPMlH-mF18MRAL-kO〇[0286]按照参考例2的方法，评价mPMIH-mIgGlMRAL-kO和mPMlH-mF18MRAL-kO对mFcγRII、mFcγRIII的结合能力。在4种小鼠FcγR之中，天然型小鼠IgGlmlgGl显示不结合mFcyRI和mFcyRIV，仅与mFcyRII和mFcyRIII结合（Nimmerjahn,2005，Science,310，1510-1512。因此，期望通过对天然型mlgGl导入降低与mFcyR的结合的改变，得到与mFcγRII和mFcγRIII的结合降低、对所有mFcγR的结合降低的变体。结果在表1中示出。[0287]【表1】[0288]根据以上的结果，显示恒定区mF18对mFcyR的结合明显降低的改变体。[0289]另外同样地，H237-mIgGlMRAL-kO和H237-MB492MRAL-k0与mFcγRII、mFcγRIII的结合的评价结果在表2中示出。[0290]【表2】[0291]表中的"相对的结合活性"表示以天然型mlgGl对各mFcyR的结合活性为1时的1^492的结合活性。根据以上的结果显示，1^492是与11^61相比对11^丫1?11增强621.5倍、对1^〇丫1?111增强10.9倍的变体。[0292]1-2.抗小鼠⑶137抗体的体外⑶137激动剂作用的评价从幼稚的C57BL6雌性小鼠采取脾脏，在包含FBS10%的RPMI1640培养基中添加了0.5Pgml离子霉素以及10ngmlPH0RB0L12-MYRISTATE13-ACETATEPMA而成的培养基中悬浮细胞，以2X105细胞100μΙ孔的密度种植在96-孔板中。以3μgml的浓度向其中添加抗小鼠⑶137抗体，在37°C、5%C02的条件下培养3日。回收培养后的上清，通过ELISA测定包含的小鼠IFN-γ浓度，从而评价脾脏衍生T细胞的活化。ELISA按照试剂盒制造商PeproTech公司）的指示实施。[0293]其结果是（图1，在制备的抗小鼠CD137小鼠IgGl抗体中，与FcγR的结合极度降低的抗体（lD8-mF18不显示活性，野生型Fc的抗体（lD8-mIgGl确认到Τ细胞活化。进一步，对FcγRIIB的结合能力提高的抗体1D8-MB492的比活性比野生型Fc的抗体升高约8倍。[0294]根据上述可知，与ProcNatlAcadSciUSA.2013，11048，19501-6中记载的对其它TNFRSF的激动剂抗体同样地，为了抗⑶137抗体发挥激动剂活性，抗体与FcγRII结合是必需的，与表达⑶137的T细胞结合的抗⑶137抗体通过FcγRII表达细胞交联是必需的（图2^cyRII在B细胞等多种免疫细胞·巨噬细胞中表达，因此，认为抗⑶137抗体产生的激动剂活性在全身引起，认为由此产生副作用。[0295]〔实施例2〕抗人GPC3抗小鼠CD137双特异性抗体的制备和激动剂活性的评价2-1.癌抗原和CD137的双特异性抗体引起的癌抗原依赖性激动剂抗体的概念根据实施例1的论述，由于常规的抗CD137抗体引起的激动剂活性在全身产生，认为抗肿瘤效果和正常组织中的副作用（T细胞活化等）不可分离。因此认为，通过应用癌抗原和CD137的双特异性抗体，通过表达⑶137的T细胞和表达癌抗原的细胞癌细胞等经该双特异性抗体交联，仅在存在癌抗原的癌组织中，抗CD137抗体引起的激动剂活性得以发挥（图3〇[0296]2-1.抗人GPC3抗小鼠CD137双特异性抗体GPC3ERY22-1D8、GPC3ERY22-G2-1D8、GPC3ERY22-G4-1D8的制备制备具有人IgGl、IgG2、IgG4的恒定区的3种抗人GPC3抗小鼠CD137双特异性抗体。在这些分子中，为了调节Η链和L链的缔合、有效得到双特异性抗体，应用Schaefer等报告的CrossMab技术（Schaefer，Proc.Natl.Acad.Sci·，2011，108，11187-11192。也即，这些分子是对W02012073985中记载的人GPC3置换Fab的VH结构域和VL结构域而成的分子。另外，对于抗体Η链恒定区，为了促进异源缔合，应用Knobs-into-Holes技术。Knobs-into-Holes技术是这样的技术，通过将一个Η链的CH3区域中存在的氨基酸侧链置换为更大的侧链knob;突起）、另一Η链的CH3区域中存在的氨基酸侧链置换为更小的侧链hole;空隙），将突起配置在空隙中，促进Η链的异二聚化，能够有效获得目的异二聚化抗体Burmeister,Nature,1994,372,379-383。下文中，导入Knob改变的恒定区显示为Kn，导入Hole改变的恒定区显示为H1。另外，对于降低对FcyR的结合的改变，应用W02011108714中记载的改变。具体地，对于IgGl型、IgG4型，导入EU编号第234号、235号、297号置换为Ala的改变。另外，对于IgG2型，导入234号、237号、297号置换为Ala的改变。从抗体Η链的C末端除去EU编号第446号的Gly和447号的Lys，为了使其在进一步抗体表达后容易纯化，在抗人GPC3侧的Η链的C末端添加组氨酸标签，在抗小鼠⑶137侧的Η链的C末端添加FLAG标签。作为导入以上改变的抗人GPC3侧Η链，制备GC332H-GldKnHS序列编号：39、GC332H-G2dmKnHS序列编号：40、60332!1-641111批序列编号：41。另外，作为抗小鼠0137侧的!1链，制备108¥!1-GldHlFS序列编号：42、lD8VH-G2dmHlFS序列编号：43、lD8VH-G4dHlFS序列编号：44。此处，对于具有IgG2型恒定区的GC332H-G2dmKnHS和lD8VH-G2dmHlFS，仅CH1结构域和铰链区的前半部分为IgGl型。具体地，与天然型人IgG2的CH1的序列比较，EU编号第131号为Ser、133号为Lys、137号、138号为Gly，铰链区的219号为Ser。作为抗体L链，抗人GPC3侧共同应用GC332L-kO序列编号:45，抗小鼠CD137侧共同应用lD8VL-kO序列编号:46。这些抗体以表3的组合表达，得到目的双特异性抗体。另外，这些抗体的表达为按照1-1在FreeStyle293细胞（Invitrogen公司）中瞬时表达。将得到的培养上清添加到AntiFLAGM2柱Sigma公司），洗涤该柱后，实施应用0.1mgmLFLAG肽Sigma公司）的洗脱。将包含抗体的级分添加到HisTrapHP柱GEHealthcare公司），洗涤该柱后，实施应用咪唑浓度梯度的洗脱。将包含抗体的级分通过超滤膜浓缩后，将浓缩液添加到Superdex200柱（GEHea1thcare公司），仅回收其洗脱液的单体抗体而得到纯化抗体。[0297]【表3】[0298]2-2.抗人GPC3抗小鼠⑶137双特异性抗体的GPC3依赖性体外⑶137激动剂作用的评价将小鼠T细胞株CTLL-2ATCCCat.No.TIB-214在包含FBS10%的RPMI1640培养基中添加了〇.5μgml离子霉素以及10ngmlPMA而成的培养基中悬浮，以2X104细胞100μ1孔的密度种植在96-孔板中。在其中，将表达人GPC3的小鼠肺癌细胞株LLC-GPC3参考例3在相同培养基中悬浮，以2X104细胞100μΙ孔的密度种植在96-孔板中。进一步，配制分别包含相同细胞数的CTLL-2和LLC-GPC3的悬浮液并以4Χ104细胞100μΙ孔的密度种植在96-孔板中。在其中，以5μgml的浓度添加与FcγR的结合极度降低的抗人GPC3抗小鼠CD137双特异性人IgGl型抗体GPC3ERY22-1D8、或者抗人GPC3单特异性人IgG型抗体包含GC332H2-GldS以及GC332L2-k0的GC332-hGIS，在37°C、5%C〇2的条件下培养24小时。回收培养后的上清，通过ELISA测定包含的小鼠IFN-γ浓度而评价CTLL-2的活化。ELISA按照试剂盒制造商PeproTech公司）的指示实施。[0299]其结果是，仅在LLC-GPC3和CTLL-2两种细胞存在的条件下，见到小鼠IFN-γ的高蓄积（图4。这考虑为，产生与GPC3表达细胞结合的多数前述双特异性抗体介导的T细胞上的⑶137缔合所伴随的T细胞活化图3。[0300]另外，前述双特异性抗体的Fc部分变成与FcγR的结合极度降低的人IgG2型GPC3ERY22-G2-1D8和人IgG4型GPC3ERY22-G4-1D8的情况的活性在图5中示出。改变抗体的亚类也不产生⑶137激动剂活性的大差异。[0301]根据这些结果确认，在表达癌抗原的细胞癌细胞等存在时，与FcγR的结合降低的、针对癌抗原本实施例中是GPC3和CD137的双特异性抗体才能够产生Τ细胞上的CD137缔合，发挥激动剂活性。也即，认为由于在癌抗原不存在的正常组织中Τ细胞不活化，能够降低或避免副作用。[0302]〔实施例3〕抗人GPC3抗小鼠⑶137双特异性抗体与抗人GPC3抗小鼠⑶3双特异性抗体的混合物产生的Τ细胞活化增强作用3_1·概念虽然已知抗⑶137激动剂抗体通过活化Τ细胞发挥抗肿瘤效果，另一方面，已知抗⑶137激动剂抗体在单一制剂的情况下效果低。因此，为了增强抗癌抗原抗CD137双特异性抗体产生的Τ细胞的活化能力、发挥更强的抗肿瘤效果，研究与类似地活化Τ细胞的药剂的联用。抗癌抗原抗CD3双特异性抗体可使Τ细胞向癌抗原重定向，发挥Τ细胞介导的对癌细胞的细胞毒性活性，另一方面，抗癌抗原抗CD3双特异性抗体在单一制剂的情况下其抗肿瘤效果也未必高。因此，通过抗癌抗原抗CD137双特异性抗体和抗癌抗原抗CD3双特异性抗体联用，研究是否协同发挥Τ细胞活化能力和抗肿瘤效果。[0303]3-2.GPC3ERY22-3_1D8、GPC3ERY22-3-2C11的制备制备抗人GPC3抗小鼠CD137双特异性抗体GPC3ERY22-3-1D8、和抗人GPC3抗小鼠CD3双特异性抗体GPC3ERY22-3-2C1UGPC3ERY22-3-1D8是为了更简单纯化对实施例2-1制备的双特异性抗体GPC3ERY22-1D8的恒定区加入本领域技术人员公知的改变而成的。具体地，制备为了简单纯化对抗人GPC3侧Η链恒定区基因GC332H-GldKnHS加入本领域技术人员公知的改变H435R而成的GC332H-GldKnHSG3序列编号：48。与其相伴，制备从抗小鼠CD137侧Η链恒定区基因lD8VH-GldHlFS除去FLAG标签而成的lD8VH-GldHlS序列编号:47。另外，应用2C11VH序列编号：49的序列作为抗小鼠⑶3抗体的Η链可变区，制备2C11VH-GldHlS序列编号：50。作为抗体L链，抗人GPC3侧应用GC332L-kO、抗小鼠CD137侧应用lD8VL-kO、抗小鼠⑶3侧应用2C11VL-kO序列编号:51，将这些抗体以表4的组合表达，得到目的双特异性抗体。另外，这些抗体的表达为按照参考例1在FreeStyle293细胞中瞬时表达。将得到的培养上清添加到MabSelectSuRe柱GEHealthcare公司），洗涤该柱后，实施利用50mM乙酸的洗脱。将包含抗体的级分添加到HisTrapHP柱GEHealthcare公司）或NiSepharoseFF柱GEHealthcare公司），洗涤该柱后，实施利用咪唑的洗脱。将包含抗体的级分用超滤膜浓缩后，将浓缩液添加到Superdex200柱GEHealthcare公司），仅回收其洗脱液的单体抗体而得到纯化抗体。[0305]另外，作为比较对照，制备为相同抗人GPC3抗体的、与FcγR的结合减弱的GC332-G1CISXC332-GldS是不应用CrossMab技术的天然型抗人GPC3抗体，具有与FcγR的结合减弱的恒定区。具体地，制备GC33⑵H2-GldS序列编号：53，其具有GC332Η2序列编号：52作为抗体Η链可变区、对Gld导入L234A、L235A、N297A作为抗体Η链恒定区。应用GC332L2-k0序列编号：54作为抗体L链，按照参考例1的方法表达、纯化，得到GC332Η2-GldSGC332L2-k0。下文中，为了简略，将本抗体记为GC332-GldS。[0306]3-3.抗人GPC3抗小鼠CD137双特异性抗体和抗人GPC3抗小鼠CD3双特异性抗体的混合物引起的体外T细胞活化增强作用的评价从幼稚的C57BL6雌性小鼠采取脾脏，在包含FBS10%的RPMI1640培养基中添加了10ngml小鼠IL2而成的培养基中以4X106细胞ml的密度悬浮细胞。另外，将表达人GPC3的小鼠大肠癌细胞株CT26-GPC3参考例3在相同培养基中以4X105细胞ml的密度悬浮。将两种细胞悬浮液分别等量混合，以100μΙ孔种植在96-孔板中。在孔的一部分中进一步添加0.5μgml离子霉素以及10ngmlΡΜΑ。在其中，以3μgml的浓度添加与FcyR的结合极度降低的抗人GPC3抗小鼠CD137双特异性抗体GPC3ERY22-1D8和与FcγR的结合极度降低的抗人GPC3抗小鼠CD3双特异性抗体GPC3ERY22-2C11:GPC3ERY22-3-2C11中H435R改变恢复为原始），在37°C、5%C02的条件下培养24小时。回收培养后的上清，通过ELISA测定包含的小鼠IFN-γ浓度，评价脾脏细胞中包含的T细胞的活化。ELISA按照试剂盒制造商PeproTech公司）的指示实施。[0307]其结果是（图6，1D8-MB492和GPC3ERY22-1D8在添加离子霉素和PMA的情况下显示IFN-γ诱导活性。这假定为促分裂原等的刺激引起的脾脏T细胞中CD137诱导的结果。而且，在GPC3ERY22-1D8和GPC3ERY22-2C11的混合物中观察到IFN-γ的高累积。这暗示同时进行CD3刺激和CD137刺激强烈引起T细胞的活化。[0308]〔实施例4〕抗人GPC3抗小鼠CD137双特异性抗体的抗肿瘤效果以及对肝脏的毒性减轻作用4-1.抗人GPC3抗小鼠CD137双特异性抗体与抗小鼠CD137抗体的药效比较将表达人GPC3的重组小鼠大肠癌细胞株CT26-GPC3参考例3在Hanks'BalancedSaltSolutionHBSS中配制为5x106细胞mL，将200yLlx106细胞移植到BALBc小鼠（雌性，7周龄，日本CharlesRiver公司）的腹部皮下。随机分为5组各5只之后，在移植3日后、7日后、10日后、17日后通过尾静脈注射施用抗体。抗人GPC3小鼠⑶137双特异性抗体GPC3ERY22-3-1D8用溶剂（包含150mMNaCl、20mMHis-HCl的水溶液pH6.0通过0.22μπι滤器而成）配制成0.75mgmL、0.15mgmL，以10mLkg施用（分别为7.5mgkg、1.5mgkg。抗小鼠CD137抗体（1D8-MB492用溶剂配制成1.5mgmL、0.3mgmL，以10mLkg施用分别为15mgkg、3mgkg。肿瘤增殖抑制率%通过根据下式算出的肿瘤体积评价。[0309]肿瘤体积mm3=长径mmX短径mmX短径mm2肿瘤增殖抑制率%=[1-τ-TOAc-C0]X100T:各组的各测定日的平均肿瘤体积Τ0:各组的初次施用日的平均肿瘤体积C:对照组的各测定日的平均肿瘤体积C0:对照组的初次施用日的平均肿瘤体积。[0310]如图7所示，施用抗体的所有组都显示肿瘤增殖抑制率95%以上的强抗肿瘤效果。也即，抗人GPC3小鼠CD137双特异性抗体与抗小鼠CD137抗体同样地显示强抗肿瘤效果，也以癌抗原依赖性的方式在CD137活化的情况下表现强抗肿瘤效果。[0311]4-2.CT26-GPC3皮下移植模型中的抗人GPC3小鼠⑶137双特异性抗体产生的肝损害降低抗体施用药效试验结束时通过麻醉下放血实施安乐死处置之后，分离血浆。应用血浆，用自动分析装置TBA-120FR东芝MedicalSystems株式会社）测定谷草转氨酶AST;JSCCTransferable法）、谷丙转氨酶ALT;JSCCTransferable法）、总胆红素（TBIL;酶法）。尸检时采取肝脏，将其固定在10%中性缓冲甲醛液中，按照常规方法制备石蜡包埋薄组织切片苏木精伊红HE，用光学显微镜进行病理组织学观察。统计学分析通过针对对照组的非参数Dunnett多重比较检验进行。[0312]其结果是，如图8至图11所示，在抗小鼠⑶137抗体（1D8-MB492施用组中，所有用量都见到血中AST、ALT以及TBIL的增加或增加倾向，在所有实施例中见到病理组织学上轻微至轻度的肝细胞变性·坏死、炎症等肝损害。另一方面，在抗人GPC3小鼠CD137双特异性抗体GPC3ERY22-3-1D8施用组中，在血中AST、ALT以及TBIL方面没有见到考虑为肝损伤引起的变化，病理组织学上轻微的肝细胞变性·坏死或炎症在各用量组中5例中的2至3例中见到，肝损伤减轻。另外，在相同抗体3mgkg施用组的1例中见到血中AST以及ALT的显著增加，但血中TBIL没有见到变化，由于根据肝脏的病理组织学观察没有见到暗示肝损伤的所见，本酶的来源判断为不引起肝损伤。[0313]根据以上的结果，抗人GPC3抗小鼠CD137双特异性抗体GPC3ERY22-3-1D8显示不引起常规抗CD137激动剂抗体迄今报告的严重肝损伤并具有强抗肿瘤效果。也即，认为与FcyR的结合降低的、对癌抗原和CD137的双特异性抗体发挥癌抗原依赖性CD137激动剂活性，通过活化仅仅肿瘤中的T细胞，选择性地发挥对癌细胞的细胞毒活性，不活化正常组织中的T细胞，能够避免细胞损伤、细胞因子释放等副作用。[0314]〔实施例5〕抗人GPC3抗小鼠⑶137双特异性抗体和抗人GPC3抗小鼠⑶3双特异性抗体的联用产生的抗肿瘤效果将表达人GPC3的小鼠肺癌细胞株LLC-GPC3参考例3在HBSS中以5X106细胞mL悬浮，向C57BL6N小鼠（雌性，6周龄，日本CharlesRiver公司）的腹部皮下移植200yLlX1〇6细胞）。移植10日后基于肿瘤体积和体重数据无偏倚地分为各5只的5组，移植10日后、14日后、17日后通过尾静脈注射施用抗体。抗人GPC3小鼠CD137双特异性抗体GPC3ERY22-3-1D8用溶剂包含150mMNaCl、20mMHis-HCl的水溶液pH6.0通过0·22μπι滤器而成配制为0.5mgmL，以10mLkg施用5mgkg。抗人GPC3小鼠CD3双特异性抗体GPC3ERY22-3-2C11用溶剂配制为0.45mgmL，以10mLkg施用4.5mgkg。进一步，设定联合施用两种抗体的组。肿瘤增殖抑制率%通过根据下式算出的瘤体积评价。[0315]肿瘤体积mm3=长径mmX短径mmX短径mm2肿瘤增殖抑制率%=[1-τ-TOAc-C0]X100T:各组的各测定日的平均肿瘤体积Τ0:各组的初次施用日的平均肿瘤体积C:对照组的各测定日的平均肿瘤体积C0:对照组的初次施用日的平均肿瘤体积。[0316]如图12所示，肿瘤移植23日后的肿瘤增殖抑制率作为，抗人GPC3小鼠⑶137双特异性抗体单独施用组36%、抗人GPC3小鼠CD3双特异性抗体单独施用组29%，但两抗体联合施用组显示100%的抑制率，见到明显协同的联用效果。[0317]另外，药效试验结束时以与4-2同样的技术进行血浆中的肝功能参数AST、ALT和TBIL的分析和利用肝脏组织切片的HE染色的病理组织学分析，所有施用组中都没有见到暗示肝损害的变化。[0318]根据以上显示，通过对癌抗原以及⑶137的双特异性抗体、与对癌抗原以及⑶3的双特异性抗体的联用，CD137和CD3肿瘤局部特异性地同时缔合，发挥体外试验中见到的分别单独刺激达不到的强T细胞活化能力，从而表现体内各自单一制剂也不能发挥的强抗肿瘤效果。[0319]〔实施例6〕应用噬菌体展示技术从人抗体文库获得与人CD137结合的抗体6-1.幼稚的人抗体噬菌体展示文库的制备以从人PBMC制备的聚ARNA、市售人聚ARNA等为模板，按照本领域技术人员公知的方法，构建包含展示彼此不同的人抗体序列的Fab结构域的多数噬菌体的人抗体噬菌体展示文库。[0320]6-2.通过珠淘选从幼稚的人抗体文库获得与人CD137结合的抗体从实施例6-1中构建的幼稚的人抗体噬菌体展示文库，进行显示对抗原的结合活性的抗体的筛选。也即，收集展示对珠捕获的抗原显示结合活性的抗体的噬菌体。应用生物素化人⑶137作为抗原。具体地，实施应用与磁珠固定的抗原的淘选。磁珠应用NeutrAvidin包被珠（Sera-MagSpeedBeadsNeutrAvidin-coated或Streptavidin包被珠（DynabeadsM-280Streptavidin。[0321]首先，通过一般方法纯化从携带构建的噬菌体展示用噬菌粒的大肠杆菌产生的噬菌体。其后，得到用TBS透析处理的噬菌体文库液。随后，添加BSA使得噬菌体文库液中的终浓度为4%。[0322]其后，通过向配制的噬菌体文库液加入250pmol的生物素化人⑶137,使该噬菌体文库液和人CD137在室温接触60分钟。随后，在噬菌体文库液中加入用BSA封闭的磁珠，使人⑶137和噬菌体的复合物与磁珠在室温结合15分钟。珠用TBS洗涤1次。其后，将加入1mgmL胰蛋白酶溶液0.5mL的珠在室温悬浮15分钟后，立即应用磁力支架magneticstand分离珠，从该珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加到对数增殖期0D600是0.4~0.7的10mL大肠杆菌株ER2738。在37°C进行上述大肠杆菌的缓慢搅拌培养1小时，使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌种植在225mmX225mm的板上。随后，通过从种植的大肠杆菌的培养液回收噬菌体，配制噬菌体文库液。[0323]也在第2次淘选中，进行能够结合人⑶137的噬菌体的浓缩。通过在得到的噬菌体文库液中加入100pmol的生物素化人⑶137,使该噬菌体文库液与人⑶137在室温接触60分钟。随后，在噬菌体文库液中加入用BSA封闭的磁珠，使人CD137和噬菌体的复合物与磁珠在室温结合15分钟。珠用TBST包含0.1%Tween20的TBS洗涤3次，用TBS洗涤2次。其后，将加入1mgmL的胰蛋白酶溶液0.5mL的珠在室温悬浮15分钟后，立即用磁力支架分离珠，从该珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加到对数增殖期0D600是0.4~0.7的10mL大肠杆菌株ER2738中。在37°C进行上述大肠杆菌的缓慢搅拌培养1小时，使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌种植在225mmX225mm的板上。随后，通过从种植的大肠杆菌的培养液回收噬菌体，配制噬菌体文库液。[0324]以同样的顺序重复3次获得可与人CD137结合的抗体的淘选。但第4次淘选中应用40pmol的生物素化人CD137。[0325]6-3.合成人抗体噬菌体展示文库的制备利用本领域技术人员公知的方法，用10种重链种系序列、7种轻链种系序列构建合成人抗体噬菌体展示文库。对于应用的种系序列，以人B细胞所有组分中的出现频率、可变区家族中的物理化学性质为指标，选择VH1-2、VH1-69、VH3-23、VH3-66、VH3-72、VH4-59、VH4-61、乂!14-13、¥!15-51、¥册-1、¥1〇1-39、¥1〇2-28、¥1〇3-20、¥人1-40、¥人1-44、¥人2-14、¥人3-21。以模拟人8细胞抗体所有组分的形式，使合成抗体文库的抗原识别部位保持多样性。[0326]6-4.通过珠淘选从合成人抗体文库获得与人CD137结合的抗体从实施例6-3中构建的合成人抗体噬菌体展示文库中，筛选对抗原显示结合活性的抗体。也即，收集展示对珠捕获的抗原显示结合活性的抗体的噬菌体。抗原应用生物素化人CD137〇[0327]通过一般方法纯化从携带构建的噬菌体展示用噬菌粒的大肠杆菌产生的噬菌体。通过在进行噬菌体产生的大肠杆菌培养液中添加2.5MNaCl10%PEG沉淀噬菌体集合，将其用TBS稀释，得到噬菌体文库液。随后，在噬菌体文库液中添加BSA至终浓度4%。应用固定于磁珠的抗原实施淘选。磁珠应用NeutrAvidin包被珠（Sera-MagSpeedBeadsNeutrAvidin-coated或Streptavidin包被珠①ynabeadsM_28〇Streptavidin。[0328]其后，通过在配制的噬菌体文库液中加入250pmol的生物素化人⑶137,使该噬菌体文库液和人CD137在室温接触60分钟。随后，在噬菌体文库液中加入用BSA封闭的磁珠，使人⑶137和噬菌体的复合物与磁珠在室温结合15分钟。珠用TBS洗涤1次。其后，将加入1mgmL的胰蛋白酶溶液0.5mL的珠在室温悬浮15分钟后，立即用磁力支架分离珠，从该珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加到对数增殖期0D600是0.4~0.7的10mL大肠杆菌株ER2738中。在37°C进行上述大肠杆菌的缓慢搅拌培养1小时，使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌种植在225mmX225mm的板上。随后，通过从种植的大肠杆菌的培养液回收噬菌体，配制噬菌体文库液。[0329]也在第2次淘选中，进行能够结合人⑶137的噬菌体的浓缩。通过在得到的噬菌体文库液中加入100pmol的生物素化人⑶137,使该噬菌体文库液与人⑶137在室温接触60分钟。随后，在噬菌体文库液中加入用BSA封闭的磁珠，使人CD137和噬菌体的复合物与磁珠在室温结合15分钟。珠用TBST洗涤3次，用TBS洗涤2次。其后，将加入1mgmL的胰蛋白酶溶液0.5mL的珠在室温悬浮15分钟后，立即用磁力支架分离珠，从该珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加到对数增殖期0D600是0.4~0.7的10mL大肠杆菌株ER2738中。在37°C进行上述大肠杆菌的缓慢搅拌培养1小时，使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌种植在225mmX225mm的板上。随后，通过从种植的大肠杆菌的培养液回收菌体，配制菌体文库液。[0330]以同样的顺序重复3次获得可与人CD137结合的抗体的淘选。但第4次淘选中应用40pmol的生物素化人CD137。[0331]6-5.通过噬菌体ELISA的人⑶137结合性的评价从通过上述实施例所示的淘选法得到的大肠杆菌单个克隆，按照常规方法MethodMol.Biol.2002178，133-145回收含有噬菌体的培养上清。[0332]加入TBS的噬菌体按以下的顺序提供给ELISAJtreptaWell96微量滴定板Roche用含有生物素标记抗原（生物素化人⑶137的100yL的TBS在室温包被1小时。该板的各孔用TBST含有0.1%Tween20的TBS洗涤除去不与板结合的抗原后，该孔用250yL的2%脱脂乳-TBS封闭1小时以上。除去2%脱脂乳-TBS，其后通过将各孔中加入配制的噬菌体的该板在室温静置1小时，将展示抗体的噬菌体与各孔中存在的抗原结合。将在用TBST洗涤的各孔中加入用TBS稀释的HRP缀合抗M13抗体AmershamPharmaciaBiotech的板封闭1小时。用TBST洗涤后，通过硫酸添加停止添加TMB单组分溶液ZYMED的各孔中的溶液的显色反应，之后利用450nm的吸光度测定该显色。[0333]从实施了噬菌体ELISA的192个克隆中，确认对人⑶137具有结合活性的多数抗体。噬菌体ELISA的结果在表5中示出。[0334]【表5】[0335]6-6.生物素化人⑶137结合抗体的序列分析从实施例6-5所示的噬菌体ELISA的结果判断为对人CD137具有特异性结合活性的克隆中，应用特异性引物对幼稚的人抗体文库:序列编号55以及56、合成人抗体文库:序列编号57以及56分析扩增的基因的核苷酸序列。分析的结果确认了存在对人CD137具有结合活性的多种抗体序列。[0336]6-7.人⑶137结合抗体的配制从实施例6-6中取得的、判断为对生物素标记人CD137具有结合活性的克隆中，将幼稚的人抗体文库衍生的5个克隆R1~R5、以及合成人抗体文库衍生的14个克隆R6~R19的重链和轻链的可变区序列与重链抗体恒定区（人IgGl的恒定区改变的序列；序列编号：58或者轻链κ恒定区序列序列编号:59或λ恒定区序列序列编号:60连接，分别插入动物表达用质粒。各克隆的重链和轻链的可变区序列在表6中示出。[0337]【表6】[0338]各抗体以参考例1中记载的方法表达·纯化。进一步地，以增强抗人⑶137抗体的体外T细胞活化作用为目的，制备表6所示VH区域、与对人FcγRIIB的结合增强的恒定区（序列编号99连接的基因，插入动物细胞表达用质粒载体，以可变区的组合如表6所示组合的方式，用同样的方法表达·纯化抗体。[0339]〔实施例7〕抗人⑶137抗体的表位分析7-1.片段化人CD137-FC融合蛋白质的配制和抗体的配制为了分析获得的抗人CD137抗体的表位，制备以TNFRSF中共同的结构和由参考JExpMed.2014Jun30;2117:1433-48称为CRD的Cys-Cys形成的结构划分结构域的片段化人CD137与抗体的Fc区的融合蛋白质表7。关于片段化人CD137-FC融合蛋白质，以包含表7所示氨基酸序列的方式，从编码全长人CD137-FC融合蛋白质（序列编号100的多核苷酸通过PCR法获得各基因片段，通过本领域技术人员公知的方法掺入动物细胞表达用质粒载体。片段化人⑶137-Fc融合蛋白质通过参考例1中记载的方法与抗体同样地纯化。进一步地，作为ELISA的对照（Control，将分别编码W02005035584A1中记载的抗人CD137抗体简称为B的Η链恒定区改变为除去人IgGl的Η链恒定区C末端的Gly和Lys的恒定区而成的抗体H链序列编号l〇l、L链序列编号102、与W02012145183A3中记载的抗人CD137抗体简称为M的恒定区改变为与人FcγRIIB的结合增强的恒定区而成的抗体H链序列编号103、L链序列编号104的基因掺入动物细胞表达用质粒载体，以参考例1中记载的方法获得抗体。[0340]【表7】[0341]7-2-1.应用片段化人CD137-Fc融合蛋白质的表位分析应用实施例7-1中配制的片段化人CD137-FC融合蛋白质，对于前述实施例6得到的抗体重链恒定区应用序列编号99与人⑶137的哪个部位结合，通过ELISA法进行结合评价。例如，在与结构域1结合的抗体的情况下，预期与包含结构域1的片段化人CD137-FC融合蛋白质结合，但不与不含结构域1的片段化人CD137-FC融合蛋白质结合。[0342]7-2-2.ELISA法将片段化人CD137-FC融合蛋白质在配制为pH9.6的碳酸钠水溶液中稀释成2ygmL。将稀释的片段化人⑶137-Fc融合蛋白质各50yU；ik加入NuncMaxiSorp平底96孔板Nunc的各孔。在4°C静置1晚以上后，通过在室温静置1小时，使板处于与室温相同的温度。将包含片段化人CD137-Fc融合蛋白质的溶液倒转除去，各孔用洗涤缓冲液包含0.1%Tween20的TBS、TaKaRa300yL洗涤3次。随后，将封闭缓冲液含有2%BSA的TBS在各孔中分别添加150yL，静置1小时以上。倒转除去封闭缓冲液，各孔用洗涤缓冲液与前一步骤同样地洗涤3次后，将预先用TBS稀释为10ygmL或5ygmL的抗体溶液在各孔中分别添加50yL。在室温以600rpm左右的速度使固定化的抗原与抗体结合1小时。倒转除去抗体溶液后，各孔用洗涤缓冲液与前一步骤同样地洗涤3次。用包含0.1%Tween20的TBS稀释1000倍的2次抗体在各孔中分别添加100yL。另外，在二次抗体是具有κ链的抗体的情况下，应用BI0S0URCE公司抗体碱性磷酸酶缀合物人免疫球蛋白吸附的山羊抗人κ碱性磷酸酶（ANTIB0DYALKALINEPHOSPHATASE⑶NJUGATEHUMANMMUNOGLOBULINABSORBEDGoatAnti-HumanKappaAlkalinePhosphate，在二次抗体是具有λ链的抗体的情况下，应用BETHYLLABORATORIES.INC，人λ轻链抗体，山羊抗人λ轻链抗体碱性磷酸酶缀合的（HumanLambdaLightChainAntibody；Goatanti-HumanLambdaLightChainAntibodyAlkalinePhosphataseConjugated。在室温静置1小时反应之后，倒转除去抗体溶液，各孔用洗涤缓冲液与前一步骤同样地洗涤3次。应用KPL公司的BluePhosMicrowell试剂盒进行显色。用KPL公司的AP终止液停止显色反应后，用吸光光度计测定620nm的吸光度。其结果在图14中示出。如图14所示，各抗体对片段化人CD137-FC融合蛋白质分别显示不同的显色值，显示与人⑶137-Fc之中不同的部分结合。进一步地，获得的抗体显示与现有抗体B、M不同。[0343]〔实施例8〕抗人⑶137抗体的体外T细胞活化作用的评价从市售PBMCAllCells公司），应用DynabeadsHumanT-ActivatorCD3CD28Gibco,11132D扩增培养T细胞。在包含10%FBS、60Uml人IL2、0.5μgml离子霉素、10ngmlPMA、以及特定浓度的青霉素和链霉素的RPMI1640培养基中，以4X105细胞ml的密度悬浮人T细胞。另外，将人B细胞淋巴瘤株Raji在相同培养基中以4X105细胞ml的密度悬浮。将两种细胞悬浮液各等量混合，以100μΙ孔种植在96-孔板中。以5μgml的浓度向其中加入实施例6中得到的人CD137结合抗体R1~R19;应用与实施例7所述ELISA相同的抗体），在37°C、5%C02的条件下培养3日。回收培养后的培养上清，通过ELISA测定包含的人IFN-γ浓度而评价人Τ细胞的活化。ELISA按照试剂盒制造商PeproTech公司）的指示实施。[0344]其结果是（图15，与对照人IgGAllexis，804-133-C100:图15中的hlgG比较，R7、R15以外的克隆全部显示IFN-γ诱导活性。这些具有IFN-γ诱导活性的抗体判断为对CD137的激动剂抗体。[0345]图16总结了得到的抗体的性质。获得多个与前述实施例所示抗人CD137抗体、即B和Μ识别不同的表位的抗体。将这些抗人CD137抗体改变为与GC33抗体抗人GPC3抗体的双特异性抗体，通过评价癌抗原GPC3依赖性⑶137激动剂能力，能够提供发挥期望抗肿瘤效果的抗人GPC3抗人⑶137双特异性抗体。[0346]〔实施例9〕抗人GPC3抗小鼠CD40双特异性抗体®PC3FAE-FGK45的制备具有人IgGl的恒定区的抗人GPC3抗小鼠CD40双特异性抗体GPC3FAE-FGK45按照以下的顺序制备。对于抗小鼠CD40侧，应用FGK45VH6序列编号120作为重链可变区、FGK45VL4序列编号121作为轻链可变区。此时，重链恒定区和轻链恒定区分别应用F760nG3P17序列编号119、k0序列编号118。作为抗人GPC3侧的抗体，共同应用重链可变区H0000序列编号115和轻链可变区GL4序列编号116。此时，恒定区使用与Fcγ受体的结合降低、加入使2个重链异源缔合的改变的重链恒定区F760nN17序列编号117、轻链恒定区k0序列编号118。这些抗体应用以下方法表达。对于在FreeStyle293ExpressionMedium培养基Invitrogen中以1.33x106细胞mL的细胞密度悬浮、种植的人胎儿肾细胞衍生FreeStyle293-F株（Invitrogen，通过脂转染方法导入配制的质粒。从在⑶2培养箱（37°C、8%C〇2、90rpm中培养4日的培养上清中，应用rProteinASepharose™FastFlowAmershamBiosciences或者ProteinGSepharose4FastFlowGEHEALTHCARE通过本领域技术人员公知的方法纯化抗体。应用分光光度计，测定纯化的抗体溶液在280nm的吸光度。从得到的测定值通过PACE法算出消光系数，应用该消光系数算出纯化的抗体的浓度ProteinScience19954，2411-2423。纯化的各同源体以表8的组合混合，应用本领域技术人员公知的技术W02015046467制备目的双特异性抗体。[0347]【表8】[0348]〔实施例10〕抗人GPC3抗小鼠⑶40双特异性抗体和抗人GPC3抗小鼠⑶3双特异性抗体的混合物产生的体外脾细胞活化增强作用的评价从幼稚的Balbc雌性小鼠采取脾脏，在包含FBS10%、0.5μgml离子霉素、以及10ngmlPMA的RPMI1640培养基中添加了10ngml小鼠IL2而成的培养基中以4X106细胞ml的密度悬浮细胞。另外，将表达人GPC3的小鼠大肠癌细胞株CT26-GPC3参考例3在相同培养基中以4X105细胞ml的密度悬浮。将两种细胞悬浮液分别等量混合，以100μΙ孔种植在96-孔板中。向其中添加浓度3μgml的与FcγR的结合极度降低的抗人GPC3抗小鼠⑶40双特异性抗体GPC3ERY22-FGK45和浓度lμgml与FcγR的结合极度降低的抗人GPC3抗小鼠CD3双特异性抗体GPC3ERY22-2C11，在37°C、5%C02的条件下培养72小时。回收培养后的上清，通过ELISA测定包含的小鼠IFN-γ浓度而评价脾脏细胞中包含的T细胞的活化。ELISA按照试剂盒制造商PeproTech公司）的指示实施。[0349]其结果是（图17，GPC3ERY22-2C11在单一制剂下显示IFN-γ诱导活性，另一方面，GPC3ERY22-FGK45单一制剂几乎不显示活性。但是，在GPC3ERY22-FGK45和GPC3ERY22-2C11的混合物中见到IFN-γ的高蓄积。这暗示，对多种免疫细胞混合物同时进行⑶3刺激和CD40刺激，结果强烈引起Τ细胞的活化。[0350]〔实施例11〕抗人GPC3抗人⑶137双特异性抗体的制备和激动剂活性的评价11-1.抗人GPC3抗人⑶137双特异性抗体的制备具有人IgGl的恒定区的抗人GPC3抗人CD137双特异性抗体按照以下顺序制备。从实施例7中确认到与人CD137结合的序列R3和R5应用设计为重链CDR3的氨基酸随机改变的引物进行改变。可变区序列在表9中示出。此时，在从R3和R5改变的情况下，对于重链恒定区和轻链恒定区，分别应用在实施例9中构建的F760nG3P17序列的C末端加入Gly-Lys也记载为〃GK"的序列、λ恒定区序列（序列编号:60。作为抗人GPC3侧的抗体，共同应用重链可变区Η0000序列编号115和轻链可变区GL4序列编号116。此时，恒定区使用与Fey受体的结合降低、加入了使2个重链异源缔合的改变的重链恒定区F760nN17序列编号117、轻链恒定区k0序列编号118。这些抗体应用以下方法表达。对于在FreeStyle293ExpressionMedium培养基（Invitrogen中以1.33x106细胞mL的细胞密度悬浮、种植的人胎儿肾细胞衍生FreeStyle293-F株（Invitrogen，通过脂转染方法导入配制的质粒。从在C〇2培养箱（37°C、8%C〇2、90rpm中培养4日的培养上清，应用rProteinASepharose™FastFlowAmershamBiosciences或者ProteinGSepharose4FastFlowGEHEALTHCARE以本领域技术人员公知的方法纯化抗体。应用分光光度计，测定纯化的抗体溶液在280nm的吸光度。从得到的测定值通过PACE法算出消光系数，应用该消光系数算出纯化的抗体的浓度ProteinScience19954，2411-2423。另外，抗人CD137抗体R3和R5衍生）计算为E1%=14。如表9所示地，与实施例9同样地混合纯化的抗人GPC抗体和人⑶137抗体的各自同源体，应用本领域技术人员公知的技术W02015046467制备目的双特异性抗体。[0351]【表9】[0352]11-2.抗人GPC3抗人⑶137双特异性抗体的GPC3依赖性体外⑶137激动剂作用的评价从市售PBMCAllCells公司），应用DynabeadsHumanT-ActivatorCD3CD28Gibco,11132D扩增培养T细胞。在包含10%FBS、60Uml人IL2、0.5μgml离子霉素、10ngmlPMA、以及特定浓度的青霉素链霉素的RPMI1640培养基中，以4X105细胞ml的密度悬浮人T细胞。另外，将表达人GPC3的小鼠大肠癌细胞株CT26-GPC3参考例3在相同培养基中以4X105细胞ml的密度悬浮。将两种细胞悬浮液各等量混合，以100μΙ孔种植在96-孔板中。以10μgml的浓度向其中加入对照人IgGAllexis，804-133-C100:图18中的CtrlhlgGl或者前面11-1中配制的GPC3FAE-BMS与FcyR的结合极度降低的抗人GPC3抗人CD137双特异性抗体），在37°C、5%C〇2的条件下培养3日。回收培养后的上清，通过ELISA测定包含的人IFN-γ浓度而评价T细胞的活化。ELISA按照试剂盒制造商PeproTech公司）的指示实施。[0353]其结果是（图18，抗人GPC3抗人CD137双特异性抗体显示IFN-γ诱导活性。这暗示，在人Τ细胞中，也与实施例2所示的应用小鼠Τ细胞的情况同样地，通过进行CD137刺激，强烈引起Τ细胞的活化。[0354]11-3.抗人GPC3抗人⑶137双特异性抗体的GPC3依赖性体外⑶137激动剂作用的评价人⑶137也在Β细胞株HDML-2中表达，CD137的激动剂活性也能够应用HDML-2测定。在包含20%FBS以及特定浓度的青霉素链霉素的RPMI1640培养基中，以8Χ105细胞ml的密度悬浮人B细胞癌细胞株HDLM-2。另外，将表达人GPC3的小鼠大肠癌细胞株CT26-GPC3参考例3在相同培养基中以4X105细胞ml的密度悬浮。将两种细胞悬浮液各等量混合，以100μL孔种植在96-孔板中。以10μgml的浓度向其中加入对照人IgGAllexis，804-133-C100:图19中的CtrlhlgGl或者前面11-1中配制的与FeyR的结合极度降低的抗人GPC3抗人CD137双特异性抗体，在37°C、5%C〇2的条件下培养3日。回收培养后的上清，通过ELISA测定包含的人IL-6浓度而评价B细胞的活化。ELISA按照试剂盒制造商PeproTech公司）的指示实施。[0355]其结果是（图19，抗人GPC3抗人⑶137双特异性抗体显示IL-6诱导活性。这暗示，在人B细胞株中，也与实施例2所示的应用小鼠T细胞的情况、实施例11-2所示的应用人T细胞的情况同样地，显示能够评价⑶137刺激。[0356]根据实施例11-2和11-3,人⑶137也与用小鼠⑶137进行的实施例2至5所示结果同样地，显示双特异性抗体具有激动剂活性，认为可以预期与小鼠CD137同样的效果。[0357]产业实用性根据本发明，提供了不具有癌抗原非依赖性地由细胞因子风暴、正常组织损伤等引起的毒性、安全性高、并且具有优异抗肿瘤活性的新的抗原结合分子或者药物组合物。本发明的包含抗原结合分子作为有效成分的药物组合物通过癌抗原依赖性活化免疫细胞，具有以包含癌细胞的各种细胞为靶标的细胞毒性作用，能够治疗或预防各种癌症。对于患者能够提供不仅安全性高、身体负担也少且便利性也高的期望治疗。

权利要求：1.抗原结合分子，其包含下述结构域：1癌症特异性抗原结合结构域，以及2肿瘤坏死因子TNF超家族结合结构域或肿瘤坏死因子TNF受体超家族结合结构域。2.权利要求1中记载的抗原结合分子，其进一步包含FcRn结合结构域。3.权利要求2中记载的抗原结合分子，其中FcRn结合结构域是对Fcγ受体的结合活性降低的、抗体的Fc区。4.权利要求1至3中任一项记载的抗原结合分子，其中TNF超家族结合结构域或TNF受体超家族结合结构域是CD137结合结构域。5.权利要求1至4中任一项记载的抗原结合分子，其为双特异性抗体。6.药物组合物，其包含权利要求1至5中任一项记载的抗原结合分子作为有效成分。7.权利要求6中记载的药物组合物，其为诱导细胞毒性的组合物。8.权利要求6中记载的药物组合物，其为癌症治疗用组合物。9.药物组合物，其由权利要求1至5中任一项记载的第1抗原结合分子和第2抗原结合分子组合而成，所述第2抗原结合分子包含下述结构域：1癌症特异性抗原结合结构域，以及2T细胞受体复合物结合结构域。10.权利要求9中记载的药物组合物，其中第2抗原结合分子是进一步包含FcRn结合结构域的抗原结合分子。11.权利要求10中记载的药物组合物，其中FcRn结合结构域是对Fcγ受体的结合活性降低的、抗体的Fc区。12.权利要求9至11中任一项记载的药物组合物，其中T细胞受体复合物结合结构域是T细胞受体结合结构域。13.权利要求9至11中任一项记载的药物组合物，其中T细胞受体复合物结合结构域是CD3结合结构域。14.权利要求9至13中任一项记载的药物组合物，其中第2抗原结合分子是双特异性抗体。15.权利要求9至14中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和第2抗原结合分子混合。16.权利要求9至14中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和第2抗原结合分子联用。17.权利要求9至14中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和第2抗原结合分子同时施用。18.权利要求9至14中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和第2抗原结合分子分别施用。19.权利要求9至18中任一项记载的药物组合物，其为诱导细胞毒性的组合物。20.权利要求9至18中任一项记载的药物组合物，其为癌症治疗用组合物。21.药物组合物，其包含含有下述结构域的第1抗原结合分子作为有效成分：1癌症特异性抗原结合结构域、以及2肿瘤坏死因子TNF超家族结合结构域或肿瘤坏死因子TNF受体超家族结合结构域，其用于与包含下述结构域的第2抗原结合分子联用：1癌症特异性抗原结合结构域、以及2T细胞受体复合物结合结构域。22.权利要求21中记载的药物组合物，其为诱导细胞毒性的组合物。23.权利要求21中记载的药物组合物，其为癌症治疗用组合物。24.权利要求21至23中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和或第2抗原结合分子是进一步包含FcRn结合结构域的抗原结合分子。25.权利要求24中记载的药物组合物，其中FcRn结合结构域是对Fcγ受体的结合活性降低的、抗体的Fc区。26.权利要求21至25中任一项记载的药物组合物，其中TNF超家族结合结构域或TNF受体超家族结合结构域是CD137结合结构域或者CD40结合结构域。27.权利要求21至26中任一项记载的药物组合物，其中T细胞受体复合物结合结构域是T细胞受体结合结构域。28.权利要求21至26中任一项记载的药物组合物，其中T细胞受体复合物结合结构域是CD3结合结构域。29.权利要求21至28中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和或第2抗原结合分子是双特异性抗体。30.权利要求21至29中任一项记载的药物组合物，其与第2抗原结合分子同时施用。31.权利要求21至29中任一项记载的药物组合物，其与第2抗原结合分子分别施用。32.药物组合物，其包含含有下述结构域的第2抗原结合分子作为有效成分：1癌症特异性抗原结合结构域、以及2T细胞受体复合物结合结构域；其用于与包含下述结构域的第1抗原结合分子联用：1癌症特异性抗原结合结构域、以及2肿瘤坏死因子TNF超家族结合结构域或肿瘤坏死因子TNF受体超家族结合结构域。33.权利要求32中记载的药物组合物，其为诱导细胞毒性的组合物。34.权利要求32中记载的药物组合物，其为癌症治疗用组合物。35.权利要求32至34中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和或第2抗原结合分子是进一步包含FcRn结合结构域的抗原结合分子。36.权利要求35中记载的药物组合物，其中FcRn结合结构域是对Fcγ受体的结合活性降低的、抗体的Fc区。37.权利要求32至36中任一项记载的药物组合物，其中T细胞受体复合物结合结构域是T细胞受体结合结构域。38.权利要求32至36中任一项记载的药物组合物，其中T细胞受体复合物结合结构域是CD3结合结构域。39.权利要求32至38中任一项记载的药物组合物，其中TNF超家族结合结构域或TNF受体超家族结合结构域是CD137结合结构域或者CD40结合结构域。40.权利要求32至39中任一项记载的药物组合物，其中第1抗原结合分子和或第2抗原结合分子是双特异性抗体。41.权利要求32至40中任一项记载的药物组合物，其与第1抗原结合分子同时施用。42.权利要求32至40中任一项记载的药物组合物，其与第1抗原结合分子分别施用。

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