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申请/专利权人：河北大学
申请日：2023-02-27
公开（公告）日：2024-06-11
公开（公告）号：CN118166075A
主分类号：C12Q1/6844
分类号：C12Q1/6844;C12Q1/686
优先权：
专利状态码：在审-公开
法律状态：2024.06.11#公开
摘要：本发明提供了一种基于CRISPR‑Cas12a的DNA中5‑羟甲基胞嘧啶检测方法及应用。本发明将PCR扩增与CRISPR‑Cas12a扩增相结合，首先利用AbasI酶特异性识别并切割含有β‑葡萄糖基‑5羟甲基胞嘧啶的目标序列，然后通过连接‑PCR扩增目的DNA片段，利用Cas12a酶的反式切割活性，实现5‑羟甲基胞嘧啶的定量检测。并且在此基础上，结合胶体金技术，实现5‑羟甲基胞嘧啶的可视化检测。本发明方法简单，灵敏度高，选择性好。
主权项：1.一种以非诊断为目的的基于CRISPR-Cas12a的定量检测DNA中5-羟甲基胞嘧啶的方法，其特征在于，包括以下步骤：1对含有5-羟甲基胞嘧啶的DNA链进行糖基化处理，获得含有β-葡萄糖基-5-羟甲基胞嘧啶的目标链；2使用AbasI酶对步骤1获取的含β-葡萄糖基-5-羟甲基胞嘧啶的目标链进行切割，将酶切后的产物与Harpin探针连接；3以步骤2获取的连接产物作为模板进行聚合酶链扩增反应；所述聚合酶链扩增反应上游引物的序列中包含PAM序列，所述PAM序列如SEQIDNO.16所示；4将步骤3聚合酶链扩增反应扩增出来的双链DNA加入CRISPR-Cas12a体系进行Cas12a酶切反应；其中，CRISPR-Cas12a体系包含Cas12a酶、gRNA分子以及荧光基团和荧光淬灭基团双标记的Taqman探针，所述gRNA分子的序列如SEQIDNO.8所示；5用实时定量PCR仪对步骤4的反应体系进行实时荧光强度的检测。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 河北大学 一种基于CRISPR-Cas12a的DNA中5-羟甲基胞嘧啶检测方法
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