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申请/专利权人：华南农业大学

摘要：本发明公开了一种高效、特异地合成与扩增大片段DNA的PCR引物、方法及应用。本发明通过特别设计扩增引物，在正向引物和反向引物5'端添加相同的任意短序列，使扩增序列的单链DNA末端形成反向重复序列并配对产生发夹结构，对引物二聚体和短小的非特异DNA片段的扩增有良好的抑制效果；而较大的目标DNA片段末端难以相互配对不产生发夹结构，因而可避免非特异产物的竞争而被高效地特异性扩增。进一步，本发明使用嵌套式交错变温内循环，可优化目标序列的不同GC含量区间的有效延伸，与上述抑制效果的倍加效应最终提高PCR的扩增效率和特异性；本发明可提高大片段DNA序列从头合成的能力，从不同物种的基因组等各种模板扩增大片段目标DNA，扩增的DNA片段可应用于载体克隆、表达和基因组测序等目的，在分子生物学、合成生物学和生物技术领域具有重要的应用价值。

主权项：1.一种扩增大片段DNA的PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.获取基因组DNA或cDNA；S2.以步骤S1的基因组DNA或cDNA为模板，采用高性能与高保真度的耐高温的DNA聚合酶及用于扩增大片段DNA的PCR引物进行PCR扩增反应；所述大片段DNA是指4～10kb或10kb以上的序列；所述用于扩增大片段DNA的PCR引物包括正向引物和反向引物，正向和反向引物具有如下构成：5’-nxNy-3’，其中Ny为与目的扩增序列的两末端位点特异结合的短序列，N为4种碱基的任一种，y为碱基数目；nx为Ny引物5'端一段附加的任意短序列，n为4种碱基的任一种，x为碱基数目，所述附加的任意短序列在正向和反向引物中相同；所述x为18～28碱基；nx的Tm值为65～72℃；所述y为18～28碱基，Ny的Tm值为58～68℃；所述任意短序列不包括与模板特异结合的序列；其中，长度较短的非特异产物链包括引物二聚体链在PCR的复性退火和延伸阶段，其两末端的反向互补短序列由于距离近容易相互配对形成茎结构，从而阻止引物与末端位点配对而抑制此序列的扩增；而较长的特异产物链的两末端之间的距离远，较难相互配对成茎结构，使引物能与特异产物链末端位点配对而进行序列扩增；这种差异的PCR效率消除或减弱了较短非特异产物对较长特异产物的竞争性扩增。

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百度查询： 华南农业大学 一种高效的大片段DNA合成与扩增的PCR引物、方法及应用