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申请/专利权人：深圳华大生命科学研究院

摘要：本发明属于生物技术领域，公开了一种纳米孔测序方法和试剂盒。所述方法包括：1提供测序文库，包括靶多核苷酸双链，靶多核苷酸的第一链的5’端与第二链的3’端包括非配对的第一单链区，分别含有引导序列和第二引物配对区；靶多核苷酸的另一端具有发夹结构；2将第一引物与测序文库进行孵育以形成测序复合物，所述第一引物具有3’自由端，且通过5’端附着在嵌有纳米孔的膜上；3使具有链置换活性的聚合酶以第二链为模板、延伸第一引物，在电场力作用下，引导序列被膜上的纳米孔捕获且穿过纳米孔，随着延伸进行，第一链被置换出，并穿过纳米孔；4检测第一链穿过纳米孔时产生的电信号变化，确定靶多核苷酸双链的第一链的序列信息；5延伸至所述发卡结构后，聚合酶以所述第一链为模板继续进行延伸，使得所述第一链以逆电场方向退出膜上的纳米孔，检测所述第一链退出纳米孔时产生的电信号变化，再次确定所述靶多核苷酸双链的第一链的序列信息。

主权项：1.一种纳米孔测序方法，所述方法包括：1提供测序文库，所述测序文库包括靶多核苷酸双链，所述靶多核苷酸双链包括第一链和第二链，所述第一链的5’端与所述第二链的3’端包括非配对的第一单链区，在所述第一链的第一单链区5’端含有引导序列，在所述第二链的第一单链区3’端含有第二引物配对区；所述第一链的3’末端和所述第二链的5’末端相连接，使得所述靶多核苷酸双链在该末端具有发夹结构；2将第一引物与所述测序文库进行孵育以形成测序复合物，其中，所述第一引物与所述第二引物配对区通过碱基互补配对原则进行结合，所述第一引物具有3’自由端，且所述复合物通过所述第一引物的5’端附着在嵌有纳米孔的膜上；3使具有链置换活性的聚合酶以第二链为模板、延伸所述第一引物，在电场力作用下，所述引导序列被膜上的纳米孔捕获且穿过纳米孔，随着延伸进行，所述第一链被置换出，并穿过纳米孔；4检测延伸过程中所述第一链穿过纳米孔时产生的电信号变化，确定所述靶多核苷酸双链的第一链的序列信息；5延伸至所述发卡结构后，聚合酶以所述第一链为模板继续进行延伸，使得所述第一链以逆电场方向退出膜上的纳米孔，检测所述第一链退出纳米孔时产生的电信号变化，再次确定所述靶多核苷酸双链的第一链的序列信息。

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