申请/专利权人：郑州大学第五附属医院

申请日：2022-05-17

公开（公告）日：2024-06-25

公开（公告）号：CN114908037B

主分类号：C12N5/071

分类号：C12N5/071;C12Q1/02

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.25#授权;2022.09.02#实质审查的生效;2022.08.16#公开

摘要：本发明提供人肠上皮化生气液界面模型构建用培养基、构建方法和应用，其中增殖培养基由Wnt3a、R‑spondin1、humanEGF、humanFGF‑10、humannoggin、humangastrin、B27、N2、Y‑27632、A83‑01、Nicotinamide、HEPES、Glutamax等成分组成，分化培养基由humanEGF、humanFGF‑10、humannoggin、humangastrin、B27、N2、Y‑27632、A83‑01、Nicotinamide、HEPES、Glutamax等成分组成。通过该培养基，并采用具有上下小室的细胞培养小室成功构建了人肠上皮化生气液界面模型，实现了对现有动物模型系统的互补，该模型可以用于药物效果评估、作为细菌感染或者慢病毒感染模型以及作为免疫细胞或间质细胞共培养模型，可以更好的研究肠化发生的机制、用于临床前实验以确定可能的治疗方法并对患者进行个性化治疗。

主权项：1.一种人肠上皮化生气液界面模型的稳定传代方法，其特征在于：采用具有上下小室的细胞培养小室，包括以下步骤：先增殖培养，包括以下步骤：（1）将获得的待培养人肠上皮化生细胞采用具有上下小室的细胞培养小室，上小室加入待培养人肠上皮化生细胞，下小室加入增殖培养基，在气液界面条件下进行培养；所述增殖培养基包括以下终浓度的组分：Wnt3a30%-50%；R-spondin115%-25%；humanEGF10-50ngml；humanFGF-1050-500ngml；humannoggin50-500ngml；humangastrin5-50nM；B272%；N21%；Y-276321.5-7.5μM；A83-010.5-5μM；Nicotinamide5-50mM；HEPES10mM；Glutamax1%；AdvancedDMEMF-1218.45%-48.45%；所述上小室加入待培养人肠上皮化生细胞，下小室加入所述增殖培养基，在气液界面条件下进行培养，具体包括：将待培养人肠上皮化生细胞以1000-1250个μl重悬于所述增殖培养基中并加至上小室，下小室中加入所述增殖培养基，于37℃、5%CO2培养3天后去除上小室中的增殖培养基，开始气液界面培养，期间每3天去除上小室内粘液并更换下小室中的增殖培养基，培养1~2周得到人肠上皮化生气液界面模型；然后将所述人肠上皮化生气液界面模型采用胰酶于37℃消化30min；（2）将细胞收集至含FBS的AdvancedDMEMF12培养基终止消化，并计数；（3）将细胞培养小室置于24孔细胞培养板，以10μgcm2的浓度将胶原蛋白稀释后加至上小室，于37℃放置30-60min，吸去胶原蛋白稀释液并用PBS洗2次；（4）将步骤（2）获得的细胞以1000-1250个μl重悬于增殖培养基中并加至上小室，下小室中加入所述增殖培养基，于37℃、5%CO2培养3天后去除上小室中的增殖培养基，开始气液界面培养，期间每3天去除上小室内粘液并更换下小室中的增殖培养基，每2-6周传代一次，即重复步骤（1）~（4），一共能传代至少6-10次；然后分化培养，包括以下步骤：将增殖培养后的人肠上皮化生气液界面模型去除上层小室内粘液，并吸去所述增殖培养基，加入分化培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养，期间每3天去除上层小室内粘液并更换所述分化培养基，培养6天；所述增殖培养基包括以下终浓度的组分：Wnt3a30%-50%；R-spondin115%-25%；humanEGF10-50ngml；humanFGF-1050-500ngml；humannoggin50-500ngml；humangastrin5-50nM；B272%；N21%；Y-276321.5-7.5μM；A83-010.5-5μM；Nicotinamide5-50mM；HEPES10mM；Glutamax1%；AdvancedDMEMF-1218.45%-48.45%；所述分化培养基包括以下终浓度的组分：humanEGF10-50ngml；humanFGF-1050-500ngml；humannoggin50-500ngml；humangastrin5-50nM；B272%；N21%；Y-276321.5-7.5μM；A83-010.5-5μM；Nicotinamide5-50mM；HEPES10mM；Glutamax1%；AdvancedDMEMF-1293.45%。

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