申请/专利权人：中山大学

申请日：2022-02-11

公开（公告）日：2024-06-25

公开（公告）号：CN114561335B

主分类号：C12N5/071

分类号：C12N5/071;C12N5/074

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.25#授权;2022.06.17#实质审查的生效;2022.05.31#公开

摘要：本发明公开了一种外周血单个核细胞PBMCs制备肝脏类器官的方法，本发明通过一种相对无创的方式获得具有个体遗传信息的，在体外充分模拟肝脏发育及肝脏相关疾病病理生理过程的肝脏类器官模型。将采集的PBMCs通过重编程为诱导多能干细胞iPSCs，进一步iPSCs诱导分化为肝脏类器官，通过这两大步骤实现上述目标，且iPSCs可在体外无限扩增及保存，为肝脏类器官的规模化生产提供了基础。

主权项：1.一种多能干细胞制备肝脏类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将多能干细胞诱导分化为末端前肠内胚层细胞，具体地，包括以下步骤：S11.将多能干细胞使用mTeSR培养基培养至细胞密度达到80％，消化处理，接种于含有Y27632的mTeSR培养基；S12.使用内胚层诱导培养基1培养，其中内胚层诱导培养基1为含有B27、WNT3A蛋白和ActivinA蛋白的RPMI1640培养基；S13.使用内胚层诱导培养基2培养，其中内胚层诱导培养基2为含有B27和ActivinA蛋白的RPMI1640培养基；S14.使用前肠内胚层细胞培养基培养，其中前肠内胚层细胞培养基为含有FGF2蛋白和BMP4蛋白的HCMBulletKit肝细胞培养基，所述多能干细胞是外周血单个核细胞重编程得到的，即所述多能干细胞是外周血单个核细胞转入OCT4、SOX2、Klf4及c-Myc后制备得到的；S2.将末端前肠内胚层细胞在基质胶内重悬，之后用肝祖细胞球的增殖培养基培养，得到类器官细胞球，所述肝祖细胞球的增殖培养基为含有10mMN-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、体积比1％GlutaMAX、1.25mM乙酰半胱氨酸、体积比1％N2细胞培养添加剂、体积比1％B27无血清细胞培养添加剂、10mM烟酰胺、10nM胃泌素、5μMA83-01、10μMForskolin、250μMR-spondin-1蛋白、100μMWnt3a蛋白和50μM表皮细胞生长因子EGF的DMEMF12基础培养基；所述末端前肠内胚层细胞在基质胶内重悬的方法包括以下步骤：S21.将末端前肠内胚层细胞消化处理，固液分离，取细胞沉淀；S22.Matrigel基质胶与沉淀细胞混合，吹吸充分混合，并避免混入气泡，保持避免基质胶凝固，得到细胞基质胶悬液；S23.将细胞基质胶悬液加入具有尖底或锥底的容器中，保持在容器的尖底或锥底，孵育至全部基质胶凝固；S24.吹打尖底或锥底的容器底部的基质胶，转移至后续培养容器中；S3.解离并消化上一步的得到的类器官细胞球，用肝脏类器官的诱导培养基培养，所述肝脏类器官的诱导培养基为含有质量体积比1％牛血清白蛋白、质量体积比1％B27细胞培养添加剂、体积比1％ITS细胞培养添加物、0.2mML-ascorbicacidtrisodiumsalt、1.25mM乙酰半胱氨酸、20μM肝细胞生长因子HGF蛋白、20μM抑瘤素M、0.5μM地塞米松、10μM表皮细胞生长因子EGF蛋白、100μM8-溴-环磷酸腺苷、10μM维生素K2、10μM石胆酸和10μMY27632的HM基础培养基。

全文数据：

权利要求：

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