申请/专利权人：四川农业大学;四川生力源生物工程有限公司

申请日：2022-03-08

公开（公告）日：2024-06-25

公开（公告）号：CN115927129B

主分类号：C12N1/21

分类号：C12N1/21;C12N15/75;C12N15/62;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/125

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.25#授权;2023.04.25#实质审查的生效;2023.04.07#公开

摘要：本发明实施例公开了一种在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及应用。该重组枯草芽孢杆菌是通过基因工程方法在整合型质粒pDG364的基础上构建了一个以芽孢衣壳蛋白CotB为锚定蛋白表面展示猪PCV2Cap截短抗原蛋白的重组载体，通过化学转化方法将重组载体转化到野生型枯草芽孢杆菌168中而获得，其具有遗传稳定性，不会在传代的过程中丢失。该菌直接将抗原蛋白展示在芽孢表面，无需破碎，可直接拌料或通过饮水免疫动物，免去了大规模注射的繁琐流程。且得益于芽孢良好的抗逆性，该菌易于保存及运输，大大降低成本。该菌可以诱导特异性的免疫反应，这为猪圆环病毒2型的防治提供了一种新的途径，可以用于开发商品化疫苗。

主权项：1.一种在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌是利用整合载体pDG364将芽孢衣壳蛋白CotB与猪圆环病毒2型截短Cap基因进行融合，并将获得的融合基序CotB-tCap转入枯草芽孢杆菌168中而获得；所述在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其包括如下步骤：1以猪圆环病毒2型为模板扩增编码Cap蛋白的截短ORF2基因序列，所述Cap蛋白截短ORF2基因序列的扩增引物1如下所示：tCap-F1:CGGGATCCTATGAATGGCATCTTCBamHⅠtCap-R1:CGCGAATTCTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTCEcoRI所述截短Cap蛋白基因ORF2的更换酶切位点后扩增引物2如下所示：tCap-F2:CCGAAGCTTATGAATGGCATCTTCHindⅢtCap-R2:CGCGAATTCTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTCEcoRI；2将按照tCap-F1，tCap-R1扩增得到的截短Cap蛋白基因ORF2进行密码子的优化以去除其中的酶切位点序列，获得优化后的tCap序列；优化后的tCap序列经T-A克隆连接至pUCm-T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质粒pUCm-T-tCap；3将步骤2得到的重组质粒pUCm-T-tCap与大肠杆菌表达质粒pET-32a经BamHⅠ，EcoRI双酶切后分别胶回收tCap片段与线性化质粒pET-32a，再经DNA连接酶将其连接并转化入大肠杆菌BL21菌株感受态细胞中，获得重组表达质粒pET-32a-tCap；4以步骤3得到的重组表达质粒pET-32a-tCap为模板，用tCap-F2，tCap-R2引物进行PCR以更换酶切位点，获得的产物经T-A克隆连接至pUCm-T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质粒pUCm-T-tCap2；重组质粒pUCm-T-tCap2与重组整合质粒pDG364-CotB经HindⅢ、EcoRI双酶切后分别胶回收tCap片段与pDG364-CotB，再经DNA连接酶连接，转入大肠杆菌DH5α获得重组整合质粒pDG364-CotB-tCap2；5将步骤4中得到的重组整合质粒pDG364-CotB-tCap2通过化学转化方法转入枯草芽孢杆菌168感受态细胞中，通过筛选，得到在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap抗原蛋白的重组枯草芽孢杆菌。

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