申请/专利权人：淮阴师范学院

申请日：2022-12-26

公开（公告）日：2024-06-28

公开（公告）号：CN118256544A

主分类号：C12N15/82

分类号：C12N15/82;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/46

优先权：

专利状态码：在审-公开

法律状态：2024.06.28#公开

摘要：本发明属于水稻OsPDCD5基因改良技术领域，具体涉及一种基于水稻OsPDCD5基因改良水稻低温性状的方法，包括如下步骤：步骤S1：构建pBWAVH‑cas9‑OsPDCD5载体，步骤S2、pBWAVH‑cas9‑PDCD5.2载体的遗传转化，步骤S3、转化植株筛选与检测，步骤S4、OsPDCD5的CDS区域突变的植株筛选与检测，步骤S5、OsPDCD5突变株系的低温抗性测定，通过在OsPDCD5基因CDS区域选取靶标片段，将该靶标片段构建到敲除载体，然后转入籼稻品种T025中，获得重要经济性状发生改良的敲除株系。

主权项：1.一种基于水稻OsPDCD5基因改良水稻低温性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1：构建pBWAVH-cas9-OsPDCD5载体，1使用引物yjstgt+:cagtGGTCTCaggcacccagagttggaagcta和yjstgt-:cagtGGTCTCaaaacgatagcttccaactctg扩增OsPDCD5基因CDS区域中20bp的靶标序列；2割胶回收PCR产物，并使用试剂盒纯化该DNA片段；3配制酶切连接体系: Component Volumes pBWAVH-cas9i 4μL PCR 4μL BsaIEco31I 1μL T4_ligase:1 1μL Buffer 2μL H2O 8μL Total 20μL 37℃for20min，5cycles；37℃for10min；20℃for10min；37℃for20min；获得连接产物；4将5-10μL连接产物转化到大肠杆菌感受态，培养转化后的大肠杆菌使用卡纳霉素抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑PCR鉴定；5挑取10个菌斑同时进行1.5mlEP管接菌和PCR鉴定是否连接成功,鉴定引物Pbw2+：GGCGTCTTCTACTGGTGCTA,Pbw2-：GTCTTTACGGCGAGTTCTGT，扩增片段长度为422bp，取3个阳性条带对应的菌液，送样测序，将测序结果正确的菌液进行保菌处理；步骤S2、pBWAVH-cas9-PDCD5.2载体的遗传转化，1将pBWAVH-cas9-PDCD5载体转化EHA105农杆菌AgrobacteriumtumefaciensWuZMet，2007，得到转化子，将转化子提取质粒送样测序，结果表明质粒为pBWAVH-cas9-PDCD5；2T025成熟种子愈伤的诱导与培养培养基如下表所示： 取T025成熟种子去壳，在无菌条件下，先用70％乙醇浸洗10min，无菌水清洗5次，转入0.1％升汞浸泡20min，无菌水清洗3次，接种于诱导培养基中，26℃黑暗条件下培养，20天后选取愈伤组织继代培养；3农杆菌侵染，28℃培养EHA105cas9-PDCD5.2农杆菌16小时，收集菌液，并稀释到含有100μmolL的YEP液体培养基中至浓度为OD600≈0.5，浸泡时间分为10min、20min、30min三组，浸泡期间不时摇匀，浸泡完成后，取出愈伤块，铺在灭菌的滤纸上吸干多余菌液后，转移到共培养培养基上，培养基表面铺一层无菌滤纸，愈伤在滤纸上与培养基不直接接触，在26℃温度条件下，共培养6天；4转化愈伤的筛选，共培养完成后，取出愈伤块，用无菌水清洗3-5次，再用含利福平50mgL与卡那霉素50mgL抗性的无菌水清洗2-3次，无菌滤纸吸干净多余水分后，将愈伤转移至初级筛选培养基中；转化愈伤进行初级、次级两轮筛选，在2-4周筛选完成后，转移至分化培养基中再生植株，在26℃、16h光照每天的条件下，继续培养，直至分化出绿苗后，把小苗转移到生根培养基中培养，当小植株长到约10cm高时，将其从生根培养基中移出，洗净残留培养基，炼苗一段时间后，移栽到温室或大田；步骤S3、转化植株筛选与检测，1将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养30天；2待分化出小植株后，将小植株转入生根壮苗培养基，长大后移入温室；3采用PCR扩增检测候选的转化植株,检测T0代转化植株中是否含有潮霉素筛选标记，获得21个含pBWAVH-cas9-PDCD5的阳性转化植株；步骤S4、OsPDCD5的CDS区域突变的植株筛选与检测，将筛选到的T0阳性转化植株收种，再种植一代获得T1代，取叶片抽提基因组DNA，并使用OsPCDC5检测引物MPCD6-F：TGGAGGGAGTACATGTTTTAGGTG和MPCD6-R：ATAAACATGGTTGACAAATAGAGC，确定含有9株发生OsPDCD5功能突变的株系；步骤S5、OsPDCD5突变株系的低温抗性测定，生长10天左右的水稻幼苗低温胁迫，环境温度4℃下处理2天，随后幼苗被再次转移回温室恢复生长3～8天，最后测定存活率、离子泄露率以及叶绿素含量。

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