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申请/专利权人：深圳市龙岗区人民医院
申请日：2022-10-14
公开（公告）日：2024-06-28
公开（公告）号：CN115537427B
主分类号：C12N15/867
分类号：C12N15/867;C12N15/63;C12N5/10
优先权：
专利状态码：有效-授权
法律状态：2024.06.28#授权;2023.03.31#实质审查的生效;2022.12.30#公开
摘要：本发明公开了一种间充质干细胞条件性永生化方法，涉及基因工程技术领域，其技术方案要点是：本方法通过Tet‑on系统控制永生化基因SV40LT的表达，制作条件性永生化MSCsconditionalimmortalizedMSCs,iMSCs，实现细胞的增殖的在多四环素doxycycline,Dox的控制下的进行。当培养液中存在Dox时，永生化基因表达，细胞可以快速增殖；当培养液中去掉Dox后，永生化基因不表达，细胞逐渐停止分裂，表现出与原代MSCs相似的表面抗原谱，并保留了MSCs的分化潜能及外泌体分泌功能。
主权项：1.一种间充质干细胞条件性永生化方法，其特征是：具体包括以下步骤：S1：通过Tet-on系统的质粒pLVET-tTR-KRAB来设计Tet-on系统控制的永生化基因SV40LT的表达系统，其中慢病毒载体穿梭质粒为如图2所示的穿梭质粒VB210803-1095wmj；S2：将人骨髓注入含有肝素的离心管中，用淋巴细胞分离液分层并离心；S3：离心后，取含有间充质干细胞的中层骨髓单核细胞，并将其加入含有胎牛血清的αMEM培养基，吹打成细胞悬液，然后将细胞种于细胞培养装置内进行培养；S4：待细胞融合达90％时，用胰酶消化，细胞按1:3传代；S5：取第2-3代的间充质干细胞接种于6孔板，按照病毒滴度转导细胞，用含有多四环素的培养液换液诱导SV40LT表达；S6：每隔一天给细胞换含有多四环素的新鲜培养液，重复S4的操作；S7：待1-2周后，细胞按1:8传代，此时便得到了永生化间充质干细胞；所述S3中αMEM培养基的胎牛血清含量为10％。所述S3中细胞培养的具体方式为：S3-1：将细胞培养装置放入到37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中；S3-2：在接种后的第5天后换液，之后每3天换一次液。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 深圳市龙岗区人民医院 一种间充质干细胞条件性永生化方法
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