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用于金钱白花蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重PCR鉴别的引物及其应用、鉴别方法 

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申请/专利权人:广东一方制药有限公司

摘要:本发明公开了一种用于金钱白花蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重PCR鉴别的引物,其包括第一引物对、第二引物对和第三引物对;其中,第一引物对的上游引物的序列如SEQIDNO:1所示,其下游引物的序列如SEQIDNO:2所示;第二引物对的上游引物的序列如SEQIDNO:3所示,其下游引物的序列如SEQIDNO:4所示;第三引物对的上游引物的序列如SEQIDNO:5所示,其下游引物的序列如SEQIDNO:6所示。本发明还公开了上述引物的应用,以及基于该引物的鉴别方法。实施本发明,可同时有效鉴别金钱白花蛇、赤链蛇和金环蛇。

主权项:1.一种金钱白花蛇药材、金钱白花蛇标准汤剂及金钱白花蛇中药配方颗粒多重PCR鉴别方法,其特征在于,包括:取待检测样品0.3~0.8g,研磨成粉末,置离心管中,加入1~1.8mL的CTAB沉淀液、15~25μL蛋白酶K,混合均匀,在50~60℃下加热45~65min,冷却至室温后离心,弃去上清液;加入800~1000μLCTAB沉淀液、15~25μL蛋白酶K,混合均匀,在50~60℃下加热45~65min,冷却至室温后离心,弃去上清液;取沉淀加入800~1000μLCTAB提取液,5~15μLβ-巯基乙醇,混合均匀,在60~70℃加热100~150min,冷却至室温后取上清液,加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,震荡混匀后离心,取上清液700~800μL,再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,震荡混匀后离心,取上清液400~500μL,加入等体积的异丙醇或异丙醇-乙酸钠混合液,于-30~-20℃静置30~60min,离心后弃去上清液,再用乙醇洗涤沉淀2~4次,弃去上清液,沉淀于35~38℃孵育20~40min,待乙醇挥发后,加入30~50μL灭菌水溶解,即得到待检测样品的基因组DNA;其中,所述CTAB沉淀液的组成为:2%wvCTAB,100mmolLTris-HCl,20mmolLEDTA;所述CTAB提取液的组成为:2%wvCTAB,100mmolLTris-HCl,20mmolLEDTA,2.5molLNaCl,20%wvPVP40;其中,Tris-HCl、EDTA的pH均为8.0;以所述基因组DNA为模板,采用第一引物对、第二引物对、第三引物对进行PCR扩增,若扩增产物中含有160bp的DNA条带,则待检测样品含有金钱白花蛇药材、金钱白花蛇标准汤剂和或金钱白花蛇中药配方颗粒;若扩增产物中含有207bp的DNA条带,则待检测样品含有赤链蛇药材、赤链蛇标准汤剂和或赤链蛇中药配方颗粒;若扩增产物中含有191bp的DNA条带,则待检测样品含有金环蛇药材、金环蛇标准汤剂和或金环蛇中药配方颗粒;所述第一引物对的上游引物的序列如SEQIDNO:1所示,其下游引物的序列如SEQIDNO:2所示;所述第二引物对的上游引物的序列如SEQIDNO:3所示,其下游引物的序列如SEQIDNO:4所示;所述第三引物对的上游引物的序列如SEQIDNO:5所示,其下游引物的序列如SEQIDNO:6所示;PCR扩增体系由下述物质组成:PCR预混液12.5μL;第一引物对的上游引物、下游引物各0.3μL,第二引物对的上游引物、下游引物各0.3μL,第三引物对的上游引物、下游引物各0.3μL,模板1μL,ddH2O9.7μL;所述PCR扩增程序为:将PCR扩增体系在95℃预变性5min,然后在预设程序下循环35次,最后在72℃延伸5min;其中,所述预设程序为:将PCR扩增体系在95℃变性30s,然后在61℃退火30s,再在72℃延伸30s。

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