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申请/专利权人：浙江寿仙谷医药股份有限公司;浙江寿仙谷植物药研究院有限公司

摘要：本发明一种铁皮石斛高分辨率熔解曲线鉴别引物、应用及鉴别方法，上游引物TPHML‑F的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，下游引物TPHML‑R的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。本鉴别引物可用于鉴别铁皮石斛药材及其加工制品铁皮枫斗与其近缘物种。本发明方法操作简便、耗时短、检出限低、准确度高，具有良好的应用前景。

主权项：1.一种用于鉴定铁皮石斛的特异性分子标记TPHML在鉴定铁皮石斛与近缘石斛中的应用，该分子标记包括上游引物TPHML-F和下游引物TPHML-R，所述上游引物TPHML-F的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述下游引物TPHML-R的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，以待检测样本的DNA为模板DNA，与分子标记TPHML混合后进行PCR扩增后进行HRM分析，铁皮石斛药材及其加工制品铁皮枫斗的Tm值为75.75±0.04℃，而其他混伪品的Tm值为76.53±0.06℃；所述近缘石斛指金钗石斛、霍山石斛、鼓槌石斛、流苏石斛、广东石斛、杯鞘石斛、束花石斛及齿瓣石斛；所述应用的具体步骤为：1）提取待检测样本的DNA；2）以待检测样本的DNA为模板DNA，与分子标记TPHML混合后进行PCR扩增；PCR扩增反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火40s，72℃延伸40s，40个循环；72℃再延伸7min；PCR扩增反应体系以20μL计，包括：2×HighResolutionMeltingMasterMix10μL，2.5mmolL的MgCl21.6μL，10μmolL的上游引物和10μmolL的下游引物各0.4μL，模板DNA1μL，ddH2O6.6μL；3）高分辨熔解曲线分析：PCR扩增完成后进入高分辨率熔解曲线分析程序，若待测样品Tm值为75.75±0.04℃，则为铁皮石斛，高分辨率熔解曲线分析程序包括：以0.02℃·s-1速度由70℃升温至90℃，每升高1℃采集荧光25次。

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