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申请/专利权人：内蒙古自治区农牧业科学院

摘要：本发明公开了一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法，包括病株采集、培养基制备、病原菌分离与纯化、菌株基因DNA提取、原菌分子生物学鉴定、病原菌回接及病原菌确定等步骤。本发明结合物理培养分离、形态学鉴定及分子生物学鉴定，实现对尖孢镰刀菌和大丽轮枝菌的分离鉴定、接种以及病情调查，实现对植株黄化萎蔫的病原菌进行分离与系统鉴定，为进一步开展辣椒抗病育种提供较为准确的参考；本发明首次利用宏观变温调控方法，通过低温‑常温交替抑制大丽轮枝菌的生殖生长，逐步分离出尖孢镰刀菌和大丽轮枝菌，避免DNA测试取菌时因病原菌形态学分离不清楚而造成取菌失败，规避发病症状易混淆的辣椒黄萎病与辣椒枯萎病的误判。

主权项：1.一种辣椒黄萎病病原菌分离纯化及室内抗性鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，病株采集：选取发病植株的病根、茎部用无菌水冲洗干净，作为分离标本；S2，培养基制备：马铃薯葡萄糖琼脂培养基：即PDA培养基，马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂14g，水1000mL，高压湿热灭菌121℃、25min备用；水琼脂培养基：即WA培养基，琼脂15g、蒸馏水1L，高压湿热灭菌121℃、25min备用；麦麸培养基：在麦麸中加入适量的水，使其刚好成团，装入罐头瓶，高压湿热灭菌121℃、45min，冷却到室温备用；查比克培养基：即CDB培养基，2gNaNO3、1gK2HPO4、0.5gKCl、0.5gMgSO4·7H2O、0.01gFeSO4、30g蔗糖，蒸馏水定容至1000mL，121℃高温灭菌30min；S3，病原菌分离与纯化：通过手术刀将分离标本刨削成厚度≤1mm的薄片，再纵横切成0.5cm×0.3cm大小的矩形薄片，经75％酒精处理2s，再用0.1%升汞处理2-3min，取出用无菌水清洗3遍，置于PDA培养基上通过变温培养5-7d，并经过病原菌形态学鉴定，得到菌株FW001和菌株VW002；所述变温培养过程如下：①将培养箱温度控制为25℃和-15℃交替，25℃控制45min，-15℃控制15min，3d后培养基长出少量纯白色点状菌落；②将培养箱温度控制为25℃恒温，2.5-3d后长出椭圆形菌落，菌落直径在30-40mm之间，菌落气生菌丝茂盛，呈白色絮状，小型分生孢子团生，卵圆形至椭圆形，大小为4.0-12.8）μm×（2.0-3.8）μm，大型分生孢子呈镰刀形，2-5分隔，两端细胞尖或稍弯，大小为（17.6-48.3）μm×（1.4-2.5）μm，分离出菌株FW001，分离的病菌为尖孢镰刀菌；③将培养箱温度控制为25℃和35℃交替，25℃控制45min，35℃控制15min，2d后长出圆形菌落，菌落直径在27~40mm之间，开始菌落为白色，1d后菌落中间逐渐变为黑褐色，周围一圈仍为白色，1d后全转变成黑色，呈同心轮纹状，分生孢子呈椭圆形，大小为（2.3-7.2μm×（1.9-3.6）μm，分生孢子梗直立，轮枝状分支，分离出菌株VW002，鉴定为大丽轮枝菌；S4，菌株基因DNA提取：菌株VW002和菌株FW001的DNA提取如下：取0.1g菌株FW001或菌株VW002的菌丝体用液氮研磨成粉状，加入600μL的CTAB提取缓冲液，转人2.0mL离心管中，迅速混匀后65℃水浴1h；加入等体积氯仿-异戊醇，混匀后10000rmin离心10min；在离心液中加入等体积氯仿-异戊醇，混匀后10000rmin离心10min；加入等体积异丙醇，混匀后-20℃静置，沉淀30-60min；10000rmin离心10min弃上清，用75%乙醇洗涤2次，风干沉淀后，加入40-80μL超纯水溶解DNA，-20℃保存备用；S5，病原菌分子生物学鉴定：通过引物ITS1ITS4对菌株FWO07进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，获得1条600bp左右的清晰条带，经测序得到了长度为532bp的序列，在GenBank核酸序列数据库中进行BLAST搜索发现，该序列与镰孢菌属的ITS序列具有同源性，即菌株FW001与尖孢镰刀菌的菌株一致性高达99%；通过引物ITS1ITS4对菌株VW002进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，获得1条650-700bp左右的清晰条带，经测序得到了长度为582bp的序列，在GenBank核酸序列数据库中进行BLAST搜索发现，该序列与大丽轮枝菌的ITS序列具有同源性，断定与大丽轮枝菌的菌株一致性高达99%；S6，病原菌回接：将分离到的菌株FWO07接种到PDA培养基中在25℃恒温条件下培养2d后，制成分子孢子液，以灌根接种形式接种到健康植株上以确认主要致病菌；将分离到的菌株VW002接种到PDA培养基中在28℃恒温条件下培养3d后，以灌根和伤口接种形式接种到健康植株上以确认主要致病菌；S7，病原菌确定：将S6回接后植株状态与S1选取的发病植株状态进行对比，收集病态状态对比，最终确定致病菌，并进行抗病性评价。

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