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申请/专利权人：吉林大学

摘要：本发明提供了一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法，并初步分析了Lama3基因点突变对毛发生长的影响。该构建方法包括如下步骤：1靶点构建：寻找Lama3基因的CDS区，明确外显子部分，确定基因突变位点；2获取受精卵，在体外通过显微注射技术将Cas9mRNA和gRNA以及合成的donoroligo一同注射到C57BL6J小鼠的受精卵中，获得F0代杂合小鼠；3将F0代杂合小鼠自交后得到F1代小鼠；4F1代小鼠经测序确认获得纯合子点突变小鼠，表明模型构建成功；5表型分析显示Lama3基因点突变小鼠出生后第80天出现区域性脱毛。该突变小鼠模型可用于人类毛发异常疾病的药物及治疗方法的研究，为探求疾病治疗方法具有重要的实际意义。

主权项：1.一种Lama3基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述小鼠模型的突变位点为小鼠第18号染色体的Lama3基因第4外显子第854位碱基由C突变为T，蛋白质第217位氨基酸从R突变为C，由精氨酸变为半胱氨酸，所述小鼠模型为Lama3基因点突变纯合子F1代小鼠，所述Lama3基因点突变小鼠模型的构建方法主要步骤如下：（1）靶点选择：寻找Lama3基因的CDS区，明确外显子部分，确定基因突变位点，并对第4号外显子E4进行基因替换，野生型等位基因序列信息如下：GGGCAAGAAGCAAACATGGCAATTACCCAGGACGACCAGATGCTCTGTGTCACGGAGTATTCCCGTATCGTGCCTCTGGAAAATGGCGAGGTAATCAGCTTTGGGAAGCTGTAACACCAAAGACTCATGAATGGGTTG，其中野生型等位基因序列中第4号外显子E4碱基序列为：TCCCGTATCGTGCCTCTGGAAAAT，下划线部分的碱基为突变位点；（2）设计能够特异性识别Lama3基因的gRNA，制备gRNA与Cas9mRNA的混合物，即Cas9混样体系，所述gRNA的DNA序列为：gRNA：5’-ATTACCTCGCCATTTTCCAGAGG-3’；（3）利用In-Fusion克隆技术构建载体donoroligo，所述donoroligo的DNA序列为，GGGCAAGAAGCAAACATGGCAATTACCCAGGACGACCAGATGCTCTGTGTCACGGAGTATAGTTGTATCGTGCCTTTAGAAAATGGCGAGGTAATCAGCTTTGGGAAGCTGTAACACCAAAGACTCATGAATGGGTTG；（4）F0代小鼠构建：包括小鼠的超排、受精卵注射及移植、F0代小鼠获得，具体如下，A．选取实验对象：挑选5-6周龄，体重为18-22g的C57BL6J小鼠6只；B．获取受精卵：先腹腔注射孕马血清促性腺激素PSMG，48h后注射人绒毛膜促性腺激素hCG，其中孕马血清促性腺激素PSMG以及人绒毛膜促性腺激素hCG的注射量各为5IU只，14h后取卵，然后体外受精获得受精卵，将5μLCas9混样体系以及donoroligo混合注射到受精卵中，诱导受精卵的染色体基因进行突变；突变型等位基因序列信息如下：GGGCAAGAAGCAAACATGGCAATTACCCAGGACGACCAGATGCTCTGTGTCACGGAGTATAGTTGTATCGTGCCTTTAGAAAATGGCGAGGTAATCAGCTTTGGGAAGCTGTAACACCAAAGACTCATGAATGGGTTG，其中突变后的第4号外显子E4碱基序列为：AGTTGTATCGTGCCTTTAGAAAAT，下划线部分的碱基为突变位点；C．受精卵移植：注射完成后，将受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，一笼两只饲养，受精卵发育并顺利被生产出，获得F0代小鼠；（5）F0代小鼠的鉴定与繁育：将出生的F0代小鼠剪尾提取DNA进行PCR和测序鉴定，获得的F0代Lama3基因点突变杂合子小鼠自交后获得后代，对F0代突变杂合子小鼠的后代剪尾提取DNA进行鉴定，获得Lama3基因点突变纯合子F1代小鼠；（6）F1代小鼠经测序确认筛选获得阳性纯合子，表明模型构建成功。

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