买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：河南中医药大学第一附属医院

摘要：本发明提供了一种酸敏融合蛋白重组质粒及其构建方法、应用，涉及生物医药技术领域。本发明利用PCR扩增技术、重叠延伸PCR、转化和连接技术将pHLIP与外泌体膜蛋白Lactadherin的C1C2结构域融合，获得酸敏融合肽基因序列pHLIP‑C1C2‑1以及添加具有保护作用的糖基化基序GNSTM位点的酸敏融合肽基因序列pHLIP‑C1C2‑2；利用上述两种酸敏融合蛋白构建了重组质粒pCDH‑pHLIP‑C1C2‑1‑Puro和pCDH‑pHLIP‑C1C2‑2‑Puro分别简称为CT1和CT2，所述质粒可用于细胞转染，为获得修饰后受体细胞示踪奠定基础。与此同时本发明还获得了能够稳定表达酸敏肽融合蛋白的HEK293T单克隆细胞株HEK293TC1C2，为靶向性外泌体的制备和外泌体的靶向性创造了条件。

主权项：1.一种酸敏融合蛋白重组质粒的构建方法，其特征在于，所述重组质粒按照以下步骤制备：（1）C1C2-HA目的基因序列扩增利用PCR扩增技术扩增出Lactadherin基因的C1C2结构域基因序列，并利用PCR技术在其序列末端添加HA标签序列，获得的C1C2-HA序列如SEQIDNO.3所示；（2）Lactadherin信号肽-WT-pHLIP-Flag基因序列扩增利用PCR技术扩增Lactadherin信号肽-pHLIP-Flag，获得的Lactadherin信号肽-WT-pHLIP-Flag序列如SEQIDNO.2所示；（3）构建pHLIP-C1C2-1和pHLIP-C1C2-2融合蛋白基因利用重叠延伸PCR技术将扩增得到的Lactadherin信号肽-pHLIP-Flag和C1C2-HA基因序列连接为融合蛋白pHLIP-C1C2-1和pHLIP-C1C2-2；所述融合蛋白pHILP-C1C2-1的基因序列如SEQIDNO.1所示；所述融合蛋白pHLIP-C1C2-2还包含有具有保护作用的糖基化基序，基因序列如SEQIDNO.4所示；（4）构建酸敏融合肽重组质粒将酸敏融合肽基因克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro慢病毒载体上的多克隆位点，获得重组质粒pCDH-pHLIP-C1C2-1-Puro和重组质粒pCDH-pHLIP-C1C2-2-Puro，分别简称为CT1和CT2；（5）酸敏融合肽重组质粒鉴定将所构建的重组质粒CT1和CT2通过限制性核酸内切酶XbaI和NotI进行双酶切试验，并进行DNA测序，经鉴定成功构建酸敏融合肽重组质粒，并分别命名为pCDH-pHLIP-C1C2-1-Puro和pCDH-pHLIP-C1C2-2-Puro。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 河南中医药大学第一附属医院 一种酸敏融合蛋白重组质粒及其构建、应用