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申请/专利权人：上海翔琼生物技术有限公司

摘要：本发明提供了一种在同一反应管中通过隔离实现多步骤反应的方法。该方法通过使用热熔性隔离层，将可能互相干扰的多步骤反应组分相互隔离，实现在封闭的一管内进行多步骤反应。本发明的方法隔离率高，重复性好，制备简易，可应用于RT‑PCR，RT‑qPCR，多重荧光高分辨率溶解曲线HRM分析、Taqman蛋白表达量检测，杂交反应、化学发光检测等。

主权项：1.一种在同一反应容器中通过隔离实现多步骤反应的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：a提供多步骤反应所需的全部组分，并将所述全部组分分为第二步反应所需的组分A和第一步反应所需的组分B；b使用隔离层将组分A封闭在反应容器中，所述隔离层为双层石蜡隔离层，并且上层采用的石蜡熔点低于下层石蜡；c向所述反应容器中加入组分B；d在所述反应容器被封闭的情况下，在低于石蜡隔离层熔点的温度下，进行第一步反应，从而获得第一步反应产物；e在所述反应容器被封闭的情况下，加热反应容器至高于所述石蜡隔离层熔点的温度，使石蜡隔离层熔化，从而使所述第一步反应产物与组分A混合，得到混合物；f对所述混合物进行第二步反应，从而获得第二步反应产物，其中，所述的第一步反应所需的组分B和第二步反应所需的组分A是存在干扰的，所述第一步反应为反转录反应；并且所述的第二步反应为定量PCR反应，所述下层石蜡熔点为58-60℃，且上层石蜡熔点为50-52℃；或所述下层石蜡熔点为58-60℃，且上层石蜡熔点为52-54℃；并且下层石蜡体积为7.5μL，上层石蜡体积为12.5μL，所述隔离层的制备方法包括步骤：（S1）将下层石蜡直接熔化后，加入温度高于其熔点的反应容器中，使石蜡自然流入反应容器中，冷却凝固形成隔离层；和（S2）随后将上层石蜡制备成颗粒，加入到室温的反应容器中，加热反应容器至高于上层石蜡熔点且低于下层石蜡熔点，使上层石蜡熔化且下层石蜡不被熔化，随后再次冷却形成隔离层，所述的组分A包括具有下列特点的所有组分：C1）是仅在第二步反应中需要的物质；C2）是对第一步反应存在干扰的；和C3）耐高温，所述高温为大于或等于石蜡隔离层熔点的温度；并且，组分B为全部组分中除上述组分外的其他物质。

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