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申请/专利权人：云南农业大学

摘要：本发明属于病毒检测领域，提供了B型牛库布病毒实时荧光定量检测方法，包括以下步骤：确定特异性引物：针对BKV3D基因的保守区域，采用一对特异性引物；核酸提取及反转录：用TrizolReagent法提取总RNA，将RNA核酸反转录成cDNA，并保存于‑20℃；制备阳性标准品：用BKV的cDNA为模板，使用引物进行PCR反应及电泳检测，对PCR鉴定为阳性的克隆质粒测序，并构建出重组质粒，将测序结果正确的重组质粒作为模板；反应体系及条件的优化：反应体系为20μL体系，其对0.2～0.6μL引物浓度和57～64℃退火温度进行优化；建立标准曲线；本发明通过建立BKV实时荧光定量PCR检测方法，该方法操作简单、特异性强、敏感性高、重复性好，为BKV感染的临床诊断及分子流行病学调查提供了技术支撑。

主权项：1.B型牛库布病毒实时荧光定量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、确定特异性引物：针对BKV3D基因的保守区域，设计合成一对特异性引物，分别为BKV-F和BKV-R，所述BKV-F引物序列为CGAAGATTATCTCGTGAAA；所述BKV-R引物序列为GCTGACAGGACACAGATG；S2、核酸提取及反转录：用TrizolReagent法提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书的方法将RNA核酸反转录成cDNA，并保存于-20℃；S3、制备阳性标准品：用BKV的cDNA为模板，使用S1中的引物进PCR反应及电泳检测，做胶回收纯化目的片段，将目的片段连接于PMD19-T载体，转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上过夜培养，进行蓝白斑筛选，挑选出白色单克隆菌落，于含氨苄青霉素抗性液体培养基中增菌，将PCR鉴定为阳性的克隆质粒测序，并构建出重组质粒，将测序结果正确的重组质粒作为模板；S4、反应体系及条件的优化：反应体系为20μL体系，即TBGreenPremixExTaqⅡ10μL,BKV阳性标准品2.0μL；其对0.2～0.6μL引物浓度和57～64℃退火温度进行优化；S5、建立标准曲线：将质粒进行10倍倍比稀释，得到1×101～1×109copiesL9个不同拷贝数的标准品，按照优化后的反应条件进行扩增，以拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。

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