买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：浙江省海洋水产研究所

摘要：本发明公开了沉积物中喹诺酮类抗生素的超高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：（1）制样；（2）超声提取；（3）浓缩和稀释；（4）全自动固相萃取；（5）浓缩定容；（6）超高效液相色谱‑串联质谱检测；（7）标准曲线绘制；（8）样品分析。本发明能快速完成样品前处理，操作简单，具有较高的灵敏度机准确性、令人满意的回收率及重现性，适合用于沉积物中喹诺酮类抗生素的含量测定。

主权项：1.一种沉积物中喹诺酮类抗生素的超高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：（1）制样将沉积物样品冷冻干燥后，研磨过筛，冷藏，得待测样品；（2）超声提取精密称取2.00g待测样品，加入15种喹诺酮类抗生素的同位素内标及5mL甲醇，涡旋、避光静置后，加入10mL提取剂，超声提取后，高速离心，取上清液，得一次提取液；再向提取液中加入10mL提取剂，重复上述过程，得二次提取液；将一次提取液和二次提取液合并，得混合提取液；15种喹诺酮类抗生素的同位素内标为恶喹酸-D5、氟甲喹-13C3、诺氟沙星-D5、依诺沙星-D8、环丙沙星-D8、培氟沙星-D5、洛美沙星-D5、丹诺沙星-D3、恩诺沙星-D5、氧氟沙星-D3、氟罗沙星-D3、沙拉沙星-D8、司帕沙星-D4、奥比沙星-D4、双氟沙星-D3，15种喹诺酮类抗生素的同位素内标的加入量分别为12ng；所述提取剂为乙腈和0.2molL磷酸氢二钠溶液的混合液，乙腈和0.2molL磷酸氢二钠溶液的体积比为1：1；超声条件为：功率300W，温度38℃，提取时间10min；高速离心条件为：转速8000rpm，离心6min；（3）浓缩和稀释将混合提取液在50℃水浴条件下，用氮气吹扫除去甲醇和乙腈后用稀释液稀释至45mL，得萃取稀释液；所述稀释液为氯化钠乙二胺四乙酸二钠二水合物的水溶液，稀释液通过以下方法制得：将15g氯化钠、0.25g乙二胺四乙酸二钠二水合物，溶于超纯水中并定容至500mL，加入浓盐酸调节pH为3；（4）全自动固相萃取采用全自动固相萃取仪对萃取稀释液进行全自动固相萃取，得洗脱液；具体萃取方法为：将CNWPoly-SeryHLB小柱，柱规格为500mg，6mL，依次用10mL甲醇和10mL、pH为3的超纯水进行活化，再以30s浸泡模式上样，上样结束后，用15mL、pH为3的超纯水分三次淋洗CNWPoly-SeryHLB小柱，在氮气流下干燥15min，最后用8mL甲醇洗脱，得到洗脱液；（5）浓缩定容将洗脱液在50℃水浴条件下，氮气吹干，用初始流动相溶解后定容至600μL，有机相滤膜过滤，得上机溶液；所述初始流动相为乙腈和0.1%甲酸的2mmolL乙酸铵溶液的混合液，乙腈和0.1%甲酸的2mmolL乙酸铵溶液的体积比1：9；0.22μm有机相滤膜过滤；（6）超高效液相色谱-串联质谱检测用进样针抽取上机溶液，按已设定的超高效液相色谱-串联质谱检测条件进行上样检测，得上机溶液的离子流色谱图；色谱条件为：watersACQUITYUPLCBEHC18色谱柱，柱规格为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温35℃，样品室温度10℃；进样量为5μL；流速为0.3mLmin；采用二元梯度洗脱，流动相A为0.1%甲酸的2mmolL乙酸铵溶液，B为乙腈，梯度洗脱程序：0~1.5min，90%A；1.5~6.5min，90%~87.5%A；6.5~9.5min，87.5%~70%A；9.5~10.5min，70%~60%A；10.5~10.7min，60%~10%A；10.7~11.5min，10%A；11.5~11.8min，10%~90%A；11.8~15min，90%A；质谱条件为：电喷雾正电子模式电离，多反应监测模式检测；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：600℃；毛细管电压：3.0kV；锥孔气流量：150Lh；脱溶剂气流量：800Lh；（7）标准曲线绘制采用Mass-Lynx软件4.1和计算机进行数据采集和处理，用多反应监测模式和保留时间进行定性：取浓度为1mgL的恶喹酸、氟甲喹、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、氟罗沙星、沙拉沙星、司帕沙星、奥比沙星、双氟沙星的喹诺酮混合标准使用液12μL，以及与上述15种喹诺酮类抗生素相对应的1mgL的恶喹酸-D5、氟甲喹-13C3、诺氟沙星-D5、依诺沙星-D8、环丙沙星-D8、培氟沙星-D5、洛美沙星-D5、丹诺沙星-D3、恩诺沙星-D5、氧氟沙星-D3、氟罗沙星-D3、沙拉沙星-D8、司帕沙星-D4、奥比沙星-D4、双氟沙星-D3的喹诺酮同位素内标混合溶液12μL，用初始流动相定容至0.6mL，得到标准工作液；将标准工作液按照上述步骤（6）的步骤进行操作，得标准工作液的离子流色谱图；将标准工作液的离子流色谱图与单种喹诺酮类抗生素和与之相对应的同位素内标的离子流色谱图进行定性离子、定量离子比较，同时结合保留时间，确定15种喹诺酮类抗生素；该15种喹诺酮类抗生素的定性离子、定量离子、保留时间和相对应的15种同位素内标的定量离子、保留时间用以作为同位素标记内标法定量时识别15种喹诺酮类抗生素色谱峰识别的依据；用同位素标记内标法进行定量：同时取浓度为1μgL的喹诺酮混合标准使用液30μL、浓度10μgL的喹诺酮混合标准使用液60μL、浓度100μgL的喹诺酮混合标准使用液30、120、300μL以及浓度1000μgL的喹诺酮混合标准使用液60μL，分别加入与之对应的1mgL的喹诺酮同位素内标混合溶液12μL，再分别用初始流动相定容至0.6mL，得到六次加标浓度范围均为0.05～100μgL，且同位素内标浓度均为20μgL的标准曲线系列溶液；将六种不同加标浓度的标准曲线系列溶液，根据加入的喹诺酮浓度和相应定量离子积分峰面积与对应同位素内标的定量离子积分峰面积的比值的对应关系建立标准曲线；（8）样品分析将步骤（6）中得到的上机溶液的离子流色谱图中的喹诺酮类抗生素的相应定量峰面积与相对应同位素内标的定量峰面积的比值，与步骤（7）中建立的标准曲线进行比较，通过换算即可得到样品中15种喹诺酮的实际含量。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 浙江省海洋水产研究所 一种沉积物中喹诺酮类抗生素的超高效液相色谱串联质谱检测方法