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申请/专利权人：厦门大学

摘要：本发明公开了一种基于数字微流控芯片的多个单细胞miRNA测序文库的制备方法，该数字微流控芯片具有依次连通且具有超疏水化表面的至少一储液区、至少一液滴生成通道、一单细胞捕获区和若干文库反应区，至少一储液区、至少一液滴生成通道、一单细胞捕获区和若干文库反应区均具有与数字微流控芯片的驱动电极电连接的电极，该单细胞捕获区具有均匀分布的若干亲水部，每一亲水部对应连通一文库反应区。本发明能够实现高效、自动化和具备选择性的多个单细胞同时分离，能够进行高度并行化的miRNA文库制备，并能够实现高灵敏、低污染和低成本的miRNA检出。

主权项：1.一种基于数字微流控芯片的多个单细胞miRNA测序文库的制备方法，其特征在于：该数字微流控芯片具有依次连通且具有超疏水化表面的至少一储液区、至少一液滴生成通道、一单细胞捕获区和若干文库反应区，至少一储液区、至少一液滴生成通道、一单细胞捕获区和若干文库反应区均具有与数字微流控芯片的驱动电极电连接的电极，该单细胞捕获区具有均匀分布的若干亲水部，每一亲水部对应连通一文库反应区；该制备方法包括如下步骤：（1）在至少一储液区的电极通电的条件下，将细胞悬液输送至至少一储液区；（2）对至少一液滴生成通道的电极进行通断电控制，以从至少一储液区中的细胞悬液中分离出细胞悬液液滴；（3）对至少一液滴生成通道和单细胞捕获区的电极进行通断电控制，使该细胞悬液液滴位移至单细胞捕获区的亲水部中，且使位于该细胞悬浮液液滴中的一单细胞正对一亲水部，接着断电静置，使该一单细胞在重力的作用下自然沉降至亲水部的底部，接着移除该细胞悬浮液液滴，使该一单细胞留在亲水部的底部；（4）将至少一储液区的电极断电，用无菌水清洗其中残余的细胞悬液；（5）对至少一储液区、至少一液滴生成通道和单细胞捕获区的电极进行通断控制，将细胞裂解液从至少一储液区输送至底部沉降有单细胞的亲水部，与该单细胞进行细胞裂解反应，然后通过加热装置进行加热，以使miRNA充分从细胞裂解液中释放，再对单细胞捕获区和若干文库反应区的电极进行通断控制，将位于亲水部的物料输送至相对应的文库反应区；（6）根据步骤（5），重复对至少一储液区、至少一液滴生成通道、单细胞捕获区和若干文库反应区的电极进行通断控制，依次将3’接头连接试剂、多余3’接头消化试剂、5’接头连接试剂、第一逆转录预反应试剂、第二逆转录预反应试剂和逆转录试剂从至少一储液区位移至相应的文库反应区，通过加热装置进行加热依次完成3’接头连接反应、多余3’接头消化反应、5’接头连接反应、第一逆转录预反应、第二逆转录预反应和逆转录反应；（7）将扩增试剂加入若干文库反应区中的逆转录试剂完成后所得的物料中，充分混合后，通过基因扩增装置进行第一扩增反应；（8）将步骤（7）所得的来自不同文库反应区的物料分别与miRNA建库扩增反应试剂混合，通过经扩增装置进行第二扩增反应，即得对应不同单细胞的miRNA测序文库。

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