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申请/专利权人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

摘要：本发明公开了一种人类器官来源外泌体的制备方法及其应用。该制备方法，包括下述步骤：1以人的诱导多能干细胞或组织来源的成体干细胞或分化细胞为起始细胞制备类器官；2收集类器官的培养基上清和或组织解离后的类器官细胞悬液上清，通过超速离心从类器官培养基上清或组织解离后的类器官细胞悬液的上清中分离外泌体。本发明获取的外泌体来源于正常类器官，非肿瘤类器官，外泌体组成成分和多样性与正常人体更为一致；本发明从类器官解离液中提取外泌体，可获得类器官细胞间隙内的外泌体，与培养上清中获得的外泌体互为补充，得到更接近于人体器官内的外泌体成分。

主权项：1.一种人类器官来源外泌体的制备方法，包括下述步骤：1以人的诱导多能干细胞为起始细胞，在相应信号通路的调控下，通过逐步添加细胞因子和小分子化合物组合，分化为皮肤类器官；其中，第0天添加10μMSB431542、4ngmLFGF2和2.5ngmLBMP4，第3天添加200nMLDN-193189和50ngmLFGF；2对含皮肤类器官的培养基进行离心，分别收集皮肤类器官的培养基上清以及类器官沉淀，并对类器官沉淀进行组织解离得到组织解离后的类器官细胞悬液的上清，收集好两种来源的上清后，通过超速离心从类器官细胞悬液上清或培养基上清中分离外泌体；所述步骤2中，所述组织解离后的类器官细胞悬液上清的具体制备方法如下：杜氏磷酸盐缓冲液清洗类器官，使用TrypLETMExpress酶于37℃培养箱中消化类器官10-30min，收集细胞悬液于1000-2000rpm转速离心5-10min去除细胞，转速3000-5000g离心10-20min去除死细胞，取上清；所述步骤2中，所述超速离心的具体方法为：先低速离心，取上清后超高速离心，弃上清，用1×PBS重悬沉淀后使用0.22μm0.45μm滤膜过滤，以弃掉上清中的杂质，再次超高速离心；其中，所述低速离心的条件为：2000-5000g，离心10min，取上清；再10000g，离心30min，离心的温度为4℃；所述超高速离心的条件为：离心转速为100000g-120000g，离心时间为60-90min，离心的温度为4℃。

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