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申请/专利权人：江苏大学

摘要：本发明属于生物技术和生物质转化领域，具体涉及一种纤维二糖脱氢酶固定化酶制剂的制备方法及其在秸秆降解领域中的应用。通过构建重组工程菌，优化筛选衣壳蛋白、连接肽得到最佳展示条件，把CDH展示在芽孢表面；并利用ep‑PCR技术获得携带随机突变位点的cdh基因片段，构建穿梭表达载体cdhep突变质粒文库。结合芽孢表面展示技术操作简单、无需进行蛋白纯化的优点，通过高通量筛选获得高催化活性CDH突变体；在多种酶的混合体系中，所制备的酶制剂均表现出良好的秸秆协同降解能力，且固定化CDH可循环使用。本发明不仅为纤维二糖脱氢酶的制备提供了新途径，还为秸秆降解和生物能源开发提供了更有效的方法，具有广阔的应用前景。

主权项：1.一种纤维二糖脱氢酶固定化酶制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1将来源于血红密孔菌Pycnoporussanguineus中的纤维二糖脱氢酶基因序列，根据枯草芽孢杆菌密码子偏好性进行密码子优化，获得得到优化的cdh编码基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；2以步骤1中所述cdh编码基因为模板，进行PCR扩增，并整合至枯草芽孢杆菌穿梭表达载体pHS-cotG上；并将连接肽插入cdh基因与衣壳蛋白之间形成重组质粒；所述连接肽为L2:-EAAAKGGGGSGGGGSGGGGS-；再将重组质粒转化至大肠杆菌后，经过质粒抽提，得到重组穿梭质粒，记为pHS-cotG-L2-cdh；最后将其导入枯草芽孢杆菌WB800N中，成功构建了可用于芽孢表面展示的重组纤维二糖脱氢酶工程菌，记为B.subtilisWB800N-pHS-cotG-L2-cdh；3将步骤2中得到的重组纤维二糖脱氢酶工程菌B.subtilisWB800N-pHS-cotG-L2-cdh接种到含有氯霉素的LB培养基中，经第一次培养后得到培养液；再将培养液接种到含有氯霉素的DSM液体培养基中，经第二次培养后离心收集菌体沉淀，使用含有溶菌酶的GTEBuffe将沉淀重悬，得到重悬液经孵育后离心收集沉淀并使用PBSBuffer进行清洗，清洗后离心收集沉淀重悬于蒸馏水中，得到表面展示有纤维二糖脱氢酶的重组孢子悬液，即为纤维二糖脱氢酶固定化酶制剂，作为第一种固定化酶酶制剂，记为cotG-L2-CDH；4以步骤1中所述cdh编码基因为模板，进行易错PCR扩增，扩增后所得产物cdhep基因与步骤2中pHS-cotG-L2-cdh酶切后线性化的枯草芽孢杆菌穿梭表达载体pHS-cotG-L2共连接，随后转化至大肠杆菌的感受态细胞中，经过共抽提，获得重组穿梭质粒突变文库，命名为pHS-cotG-L2-cdhep；接着，将重组穿梭质粒突变文库共转化至枯草芽孢杆菌WB800N中，构建得到可用于芽孢表面展示的重组纤维二糖脱氢酶突变菌株文库，记为B.subtilisWB800N-pHS-cotG-L2-cdhep；5建立用于对步骤4中重组纤维二糖脱氢酶突变菌株文库进行高通量筛选获得优质高催化活性突变体的筛选方法，具体步骤如下：将重组纤维二糖脱氢酶突变菌株文库利用含有氯霉素的LB固体培养基培养，然后从培养基中单个挑出所有转化子，对应接种于96孔板中进行培养，其中96孔板中含有包含氯霉素的LB培养基；经第一次培养后，得到培养液，转接至含有包含氯霉素的DSM培养基的96深孔板中，经第二次培养后离心收集菌体，使用含有溶菌酶的GTEBuffer将菌体重悬，得到重悬液经孵育后离心收集沉淀并使用PBSBuffer进行清洗，清洗后离心收集沉淀重悬于蒸馏水中，从而得到96孔板重组CDHep孢子悬液，记为cotG-L2-CDHep；然后将醋酸-醋酸钠缓冲液分装至96孔板中，对应再加入重组CDHep孢子悬液，并使用酶标仪检测OD520的降低情况，每分钟记录一个OD值，持续测定；根据OD520的下降斜率即可计算CDH突变体酶活，斜率越大即表示酶活越高，最终筛选得到活性最佳的CDH突变体，命名为cotG-L2-CDHep-A1，核苷酸序列，如SEQIDNO.3所示；其对应的重组枯草芽孢杆菌则标记为B.subtilisWB800N-pHS-cotG-L2-cdhep-A1；6将步骤5中得到的高催化活性突变体B.subtilisWB800N-pHS-cotG-L2-cdhep-A1，接种到含有氯霉素的LB培养基中，经第一次培养后得到培养液；再将培养液接种到含有氯霉素的DSM液体培养基中，经第二次培养后离心收集菌体沉淀，使用含有溶菌酶的GTEBuffe将沉淀重悬，得到重悬液经孵育后离心收集沉淀并使用PBSBuffer清洗，清洗后收集沉淀再次重悬于蒸馏水中形成悬液，从而得到高催化活性突变体的固定化CDH酶制剂，标记为第二种重组纤维二糖脱氢酶固定化酶制剂，记为cotG-L2-CDHep-A1。

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