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申请/专利权人：深圳大学

摘要：本发明公开了一种受激辐射损耗超分辨荧光寿命成像方法，应用在光学显微镜成像技术领域，本发明提出的方法结合了受激辐射损耗和荧光寿命成像原理，采用的损耗激光脉冲频率为激发光脉冲频率的一半，并调整两个脉冲序列之间的时间间隔，使损耗激光脉冲位于相邻激发光脉冲之后，通过对采集到的荧光寿命数据进行分析处理，得到超分辨率的荧光寿命图像，解决受激辐射损耗荧光寿命成像显微镜在高能量损耗激光作用下荧光寿命显著缩短的问题，进而准确反映荧光染料和微环境的真实信息，这一创新技术将为生命科学研究提供重要的技术支撑，显著提升研究的精准性和有效性，推动生物医学领域的进一步发展。

主权项：1.一种受激辐射损耗超分辨荧光寿命成像方法，采用结合受激辐射损耗和荧光寿命成像的激光扫描共聚焦成像系统，其特征在于：该结合受激辐射损耗和荧光寿命成像的激光扫描共聚焦成像系统包括：激发激光，由皮秒激光器产生脉冲型激光；损耗激光，由皮秒激光器产生脉冲型激光，波长长于激发激光，脉冲频率为激发激光的一半，且通过激发激光的控制系统触发后发出同步的脉冲激光；半波片，用于调节激光的偏振方向；偏振分光镜，用于激光分束，与半波片配合使用可以控制反射和透射激光的能量比例；挡板，用于阻挡激光束；反射镜，用于改变激光的传输方向；涡旋相位板，用于对损耗激光进行波前调制，将高斯光转换成环形光；角反射器，用于调节激发激光和损耗激光之间的脉冲间隔，即移动角反射器的位置延长或缩短环形损耗激光光斑的光程，在时间上控制损耗激光脉冲到达样品的时间；双色镜1，用于反射激发激光，透射荧光信号；双色镜2，用于反射损耗激光，透射激发激光和荧光信号；振镜x，用于对两束激光束进行横向同步扫描；振镜y，用于对两束激光束进行纵向同步扫描，与振镜x搭配实现对样品的面阵成像；扫描透镜，放置于振镜之后，用于收集面阵扫描的激光光束；管镜，与物镜搭配构成显微镜系统；物镜，用于将激光聚焦到样品，同时收集样品反射回来的荧光信号；载物台，用于放置和固定待测样品，并对样品进行三维移动控制；透镜，用于对光束进行聚焦；滤光片，用于透射荧光，去除荧光以外的杂散光，提高图像信噪比；探测器1，使用光电倍增管或雪崩光电二极管，用于收集信号并对荧光信号进行放大；探测器2，用于探测激发光路中偏振分光镜反射后的激光，作为荧光寿命成像中的参考信号；时间相关单光子计数器，用于记录荧光信号的时空信息；电脑，用于控制软件采集图像，存储数据和图像数据处理；激发激光从激光器出射后经过偏振分光镜分为两束，其中反射光被探测器2收集，用作荧光寿命成像时的参考信号，透射光被双色镜1反射，损耗激光经涡旋相位板的波前调制生成环形激光光斑；激发激光和损耗激光在双色镜2处相遇，且空间上精准重合，样品被激发后发出荧光信号，将探测器1和探测器2采集的信号传输至时间相关单光子计数器，并将数据保存至电脑；通过开启激发激光和损耗激光，利用激发激光的控制系统来同步触发损耗激光，使两束激光的脉冲序列保持同步，通过移动角反射器可以改变损耗激光的光程，调节两束激光之间的脉冲间隔；激发激光的脉冲频率是损耗激光脉冲频率的两倍，损耗激光的波长长于激发激光，激发激光输出高斯型脉冲激光，激光出射后经偏振分光镜一分为二，反射光作为荧光寿命成像的参考信号，透射光经双色镜1反射、双色镜2透射、振镜x和振镜y扫描后，依次通过扫描透镜、管镜和物镜后聚焦于样品；损耗激光由激发激光的控制系统触发后出射高斯型脉冲激光，通过半波片和偏振分光镜的组合控制光路中的损耗激光能量，利用角反射器调节损耗激光脉冲到达样品的时间，透过涡旋相位板由高斯型转换为环形激光，被双色镜2反射后经振镜x和振镜y扫描，依次通过扫描透镜、管镜和物镜聚焦于样品；激发激光和损耗激光的光斑经物镜聚焦后在空间上精准重合，时间相关单光子计数器同时收集探测器1采集的荧光信号和探测器2采集的参考信号，将数据传输至电脑进行存储和处理；开启激发激光时，仅有激发光脉冲序列构成共聚焦荧光寿命成像，荧光发射呈单指数衰减，当激发激光和损耗激光都开启时，由于激发激光的脉冲频率是损耗激光脉冲频率的两倍，通过调节角反射器使损耗激光脉冲位于相邻激发激光脉冲之后，确保和相邻激发激光脉冲之间的脉冲间隔与荧光染料的激发态振动弛豫时间相匹配，该时间为百皮秒量级，此时，荧光发射同时包含共聚焦荧光衰减曲线和受激辐射损耗超分辨荧光衰减曲线，在受激辐射效应的作用下，荧光光子数显著降低，荧光发射呈多指数衰减趋势；将损耗激光的脉冲频率作为荧光信号的探测周期（T），因此在一个探测周期内包含两个激发光脉冲和一个损耗激光脉冲，根据荧光衰减曲线可以将探测周期分为两个部分，即区域1和区域2；在区域1中，分子仅受到激发激光的作用，由此产生的荧光光子构成了标准的共聚焦荧光成像信号；在区域2中，分子则受到激发激光与损耗激光的共同作用，其荧光光子表现为受激辐射损耗显微镜荧光成像信号，因此，通过荧光寿命成像探测可以在每个像素中一次性同时得到共聚焦荧光成像的荧光强度信息ICx,y和荧光寿命信息τCx,y，以及受激辐射损耗荧光成像的荧光强度信息ISx,y和荧光寿命信息τSx,y；获取上述信息之后，利用图像处理算法分别得到共聚焦荧光成像中的荧光寿命信息τCx,y和受激辐射损耗荧光成像中的荧光强度信息ISx,y，τCx,y代表了正常的荧光寿命信息，而ISx,y代表了超分辨率的荧光强度信息，生成一个与采集图像相同维度和像素的全1矩阵onesx,y，然后对荧光强度ISx,y和荧光寿命τCx,y进行归一化，并将归一化后的荧光强度和荧光寿命信息分别作为亮度和颜色与该全1矩阵合并为三通道的HSV颜色图像；将该HSV图像转成RGB图像即可获得强度加权的荧光寿命图像，即同时包含了正常荧光寿命信息和超分辨结构信息的受激辐射损耗超分辨荧光寿命图像。

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